Name: Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Keşfedin, orofaringeal skuamöz hücreli karsinomda T hücresi alt popülasyonlarını çok renkli floresan immünohistokimya ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, immünoterapi için hasta sınıflandırmasına yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Simone Punt, Hollanda Kanser Derneği&#39;nden hibe UL2010-4801 tarafından desteklendi. Bu JoVE protokolünün dayandığı orijinal makalenin tüm yazarlarına, Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter ve Sjoerd van&#39;a teşekkür ederiz. Der Burg.

Hasta örnekleri, Hollanda Biyomedikal Bilim Toplulukları Federasyonu İnsan Doku&#39;nun Doğru İkincil Kullanımı Davranış Kurallarında (www.federa.org) açıklanan tıbbi etik yönergelere göre ele alınmıştır. 1. Slayt Hazırlayın <ol><li> Rezeke edilen materyali kullanma tıbbi etik komite iznini aldıktan sonra bir patoloji bölümünden rezeke edilen doku materyalini (her türlü doku) elde edin. NOT: Mevcut deney için, 1970 ve 2011 yılları arasında Leiden, Leiden&#39;de Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi&#39;nde teşhis edilen primer orofaringeal tümörlerden ön tedavi tümörü örnekleri daha önce tarif edildiği gibi seçilmiştir (n = 162) 13 . Doku büyüklüğü, tümörün içinde 4 mikroskopik görüntü elde etmek için yeterli miktarda tümör dokusu gereksinimi ile sınırlıydı. </li><li> Dokuyu% 4 tamponlu formalinde en az 12 saat sabitleyin. Dokuyu ag içinde kurutunTasarlanmış etanol serisi. Ksilen içinde yıkayın ve otomatik bir doku işlemcisi kullanarak parafin mumu içine katıştırın. </li><li> Cam kapaklar üzerinde 4 μm kalınlığındaki formaline sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) doku kesitlerini bir mikrotome kullanarak kesin. Standart prosedürler kullanarak doku bloğunu mikro tonlu doku tutucusuna yerleştirin. <ol><li> Kurdele şeritleri kesin ve 45 ° C&#39;de deiyonize su içeren bir su banyosu yüzeyine koyun. İmmunohistokimyasal boyama için uygun bir slayt kullanarak, slaydı doğrudan bölümün altındaki suya yerleştirerek bir bölüme balık tutun. Parçayı suyun dışına çıkararak ve slayt üzerine yapıştırarak, slaydı dikkatli bir açıyla yukarıya doğru hareket ettirin. </li></ol></li><li> Slaytlar gece boyunca 37 ° C&#39;de kurumaya bırakılsın. </li><li> FFPE slaytlarını, her biri 5 dakika süreyle üç kez tamamen taze% 100 ksilende daldırmak suretiyle deparafinize hale getirin. Slaytları, her biri 5 dakika boyunca taze% 100 etanol,% 70 etanol ve% 50 etanol içine iki kez batırarak yeniden su haline getirin. </li></ol> 2. Antigen Alımı gerçekleştir <ol><li> Slaytları deiyonize suda 5 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Bir mikrodalga kullanarak kaynar sıcaklığa kadar Tris-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tamponunu (10 mM Tris artı 1 mM EDTA, pH 9.0) önceden ısıtın. Sürgüleri önceden ısıtılmış EDTA tamponuna batırarak ve tamponu mikrodalgada 10 dakika boyunca bu sıcaklıkta tutarak antijen alımını gerçekleştirin. NOT: 900 W gücünde herhangi bir mikrodalga kullanılabilir. </li><li> Slaytları tamponda 2 saat boyunca soğutun. </li></ol> 3. Leke Doku Sunumları <ol><li> Slaytları her biri 5 dakika süreyle fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın. </li><li> Seyreltilmiş antikorların slayttan dökülmesini önlemek için hidrofobik bir kalemle doku etrafında bir daire çizin. PBS ile bir kez daha yıkayın; Bu isteğe bağlıdır. </li><li> % 1 a / a sığır serumu a içinde seyreltilmiş birincil antikorlar (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 ve anti-IL-17 1:50) ile dokuyu inkübe edin.Lbümin (BSA) ile gece boyunca oda sıcaklığında PBS içerisinde karıştırılır. NOT: Slayt başına hacim dokunun boyutuna bağlıdır, ancak genellikle 50 - 150 μL&#39;dir. CD3, CD8 ve FoxP3 antikorları ( yani, tavşan Ig izotip kontrol antikoru, fare IgG1 izotip kontrol antikoru ve keçi ile aynı seyreltmede negatif kontrol slaytları için bilinmeyen bir özgüllük ile birincil antikorları aynı izotip sınıfının antikorları ile değiştirin IgG izotip kontrol antikoru). </li><li> Slaytları her biri için 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Doku, seyreltilmiş birincil antikor türünü ve / veya izotiplerini ( yani, 1: 200 eşek anti-keçi IgG Alexa 488, eşek anti-tavşan IgG A546 ve eşek anti-fare A647) hedef alan floresan etiketli sekonder antikorların bir kombinasyonu ile inkübe edin 1% BSA, PBS içinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle. NOT: Slayt başına hacim, dokunun boyutuna bağlıdır, ancak genellikle 50 - 150 μL&#39;dir. <ol><li> SonraIkincil antikoru ekleyerek, slaytları karanlık bir kutuya koyarak veya kutuyu alüminyum folyo ile sararak mümkün olduğunca ışıktan koruyun. </li></ol></li></ol> 4. Doku Saydamlarını Yerleştirme ve Karşıtın Bakım <ol><li> Slaytları her biri için 5 dakika boyunca PBS içinde üç kez yıkayın. </li><li> Slaytları, nükleer kontrast içeren sulu bir anti-solmaya dayanıklı montaj malzemesi ( ör . DAPI) kullanarak monte edin. Slaytları mümkün olan en kısa sürede (iki hafta içinde) bir flüoresan mikroskop kullanarak analiz edin. Analiz edilinceye kadar slaytları 4 ° C&#39;de karanlıkta saklayın. </li></ol> 5. Lekeli Doku Saydamlarını Analiz Edin <ol><li> Her slaytta dört resim elde etmek için, 20 - 25X&#39;lik bir objektifle donatılmış bir floresans mikroskopu kullanın. Tümörün temsil eden bir bölümünü yakalamak için slaytta bulunan toplam tümör alanı boyunca rastgele yerlerde görüntü alın. NOT: 250X standart bir büyütme kullanılmalıdır. Herhangi bir floresan oKullanılan florokromları görselleştirmek için gerekli olan filtreler ve lazerler varsa r tarayıcı mikroskop kullanılabilir. <ol><li> Alexa 488&#39;in görselleştirilmesi için, maksimum 490 uyarma ve 525 emisyon maksimum kullanın; Alexa 546&#39;yı görselleştirmek için maksimum uyarı mıknatısı 556 ve maksimum emisyon 573 kullanın; Alexa 647&#39;yi görselleştirmek için, maksimum 650 uyarı ve maksimum emisyon 665 kullanın; Ve DAPI&#39;nın görselleştirilmesi için, maksimum uyarı mıknatısı 358 ve maksimum emisyon 461 kullanın. </li><li> Görüntüleri, kullanıcıya sunulan yazılımda görüntü dosyaları ( örn., Jpeg ve tiff) olarak kaydedin. </li></ol></li><li> Bir patoloğa danıştıktan sonra tümör epitelyumuna karşı stromal hücrelerin nükleer ve hücresel şekillerine dayalı olarak tümör epiteli ve tümör stroması alanlarını ayırt edin. <ol><li> Toplam stromal yüzey alanını belirlemek için, stromal hücreler (tümör hücreleri yerine) tarafından işgal edilen tüm alanların etrafında bir çizgi çizin ve yeniden çizinMikroskop imalatçısı tarafından sağlanan görüntü analiz yazılımını kullanarak yüzey alanı. <ol><li> Resmin altındaki &quot;Döşeme&quot; sekmesini tıklayın; &quot;Kapalı Poli-çizgi&quot; şeklini seçin ve üzerine tıklayın. Alanın çevresine tıklayarak tümör epitelial ve stromal alanlar arasındaki sınırı yeniden ilk noktaya ulaşana kadar sınırlayın .; Bu alan için bir önlem sağlar. NOT: şekil kapandıktan sonra, seçilen görüntünün yüzey alanını çevreleyen şeklin yanında bir sayı görünür (A = x μm 2 ). </li></ol></li><li> Epitel yüzey alanını hesaplamak için bu yüzey alanını (görüntü özelliklerinde sağlanan) toplam görüntü yüzey alanından çıkarın. Vasküler, nekrotik ve otofloresan alanları, etrafında bir çizgi çizerek, verilen alanın büyüklüğünü kaydedin ve bunu epitel yüzey alanından çıkararak hariç tutun. </li><li> Ortalama yüzey alanlarını hesaplamak için tüm yüzey alanı numaralarını bir elektronik tablo dosyasına kaydedin veSlayt başına hücre sayıları. </li><li> Görüntü analiz yazılımını kullanarak, dört kanalın floresansını kontrol ederek hücrelerin tek, çift veya üçlü pozitif olup olmadığını belirleyin. <ol><li> ImageJ kullanarak her bir resimdeki tek, çift ve üçlü pozitif hücreleri sayın. <ol><li> İndir ImageJ. &quot;Dosya&quot; ve &quot;Aç&quot; ı tıklayıp analiz edilecek resmi seçerek bir resim açın. &quot;Nokta Aracı&quot; (dört çizginin ortasındaki kırmızı bir kar) sağ tıklayın ve &quot;Çok Nokta Aracı&quot; nı seçin. &quot;Çok Nokta Araç&quot; ı çift tıklayın ve her hücre türüne göre farklı bir sayaç numarası seçerek, resimdeki farklı hücre türlerinin sayısını hesaplayın. NOT: Bir, iki veya üç floresan renginin varlığıyla tanımlandığı gibi, farklı her hücre türünün tüm hücrelerini sayın. Bu nükleer karşıtın her hücrede mevcut olduğu ve tümör hücrelerini bağışıklık hücrelerinden ayırt etmek için kullanıldığı için DAPI&#39;yı hariç tutun. Her hücre türü sayılırFarklı bir sayaç numarası kullanarak. Her seferinde farklı bir sayaç seçerek tümör epitelyal ve stromal bölgelerinde her hücre türünün hücre sayılarını ayrı olarak sayın. Kan damarları içinde hücreleri saymayın ve büyük oranda otofloresan alanlar. </li><li> Analiz edilen hücrelerin sayısını, her bir resim için her kutu bölmesinde bir elektronik tablo dosyasına kaydedin. </li><li> Analiz edilen tümör epiteli ve tümör stromasının toplam yüzey alanı boyunca her bir hücre tipi için toplam hücre sayısını bölün. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6. İstatistiksel Analiz NOT: Verilerin kalitesini sağlamak için tüm istatistiksel analizler bir istatistikçi ile tartışılmalıdır. Genel istatistikler için herhangi bir tıbbi istatistik rehberi 14 kullanın . <ol><li> Bir Spearman sıra korelasyonu rho testi kullanarak hücre frekansları arasındaki korelasyonları test edin. </li><li> Olumlu cel sayısındaki istatistiksel farklılıkları test edinWilcoxon Mann-Whitney testini kullanarak hasta grupları arasındaki mesafe. </li><li> Kaplan-Meier eğrisi üretimi ve günlüğü kullanarak, kesilen hücre sayısına dayalı gruplardaki hastaları bölerek, hücre sayıları ile hastalıksız sağkalım arasındaki ( yani tanıdan , yerel veya uzak tekrar nüksetme veya hastalığa kadar geçen süre arasındaki korelasyonları test edin) test edin Sıralama analizi 15 . </li><li> Cox orantısal tehlike regresyon analizini kullanarak çok değişkenli analizler yapın. </li></ol>

<ol><li>Westra, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+head+and+neck+cancer+in+the+21st+century%3A+the+impact+of+HPV+on+the+epidemiology+and+pathology+of+oral+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck+Pathol%22%5BJournal%5D)">The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer.</a> Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).</li>
<li>Rietbergen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+detection+and+comorbidity%3A+critical+issues+in+selection+of+patients+with+oropharyngeal+cancer+for+treatment+De-escalation+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials.</a> Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).</li>
<li>Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+immune+parameters+in+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers.</a> Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).</li>
<li>Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+and+regulation+of+human+Th17+cells+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity.</a> Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).</li>
<li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+analysis+of+pancreatic+cancer-infiltrating+T+lymphocytes+reveals+that+ENO-specific+Tregs+accumulate+in+tumor+tissue+and+inhibit+Th1%2FTh17+effector+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+regulatory+T+cells+%28Treg%29+regulating+in+cancer+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?</a> Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).</li>
<li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angels+and+demons%3A+Th17+cells+represent+a+beneficial+response%2C+while+neutrophil+IL-17+is+associated+with+poor+prognosis+in+squamous+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer.</a> Oncoimmunology. 4 (1), e984539(2015).</li>
<li>Bamias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+differences+of+lymphocytes+isolated+from+ascites+of+patients+with+ovarian+cancer+compared+to+blood+and+tumor+lymphocytes.+Association+of+CD3%2BCD56%2B+cells+with+platinum+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance.</a> Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).</li>
<li>Gasparoto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma+are+characterized+by+increased+frequency+of+suppressive+regulatory+T+cells+in+the+blood+and+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment.</a> Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).</li>
<li>Jordanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I%2C+MHC+class+I+chain-related+molecule+A%2C+and+CD8%2B%2Fregulatory+T-cell+ratio%3A+which+variable+determines+survival+of+cervical+cancer+patients%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?</a> Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).</li>
<li>van Esch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+classical+and+nonclassical+HLA+expression+in+recurrent+and+progressive+HPV-induced+usual+vulvar+intraepithelial+neoplasia+and+implications+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy.</a> Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).</li>
<li>Heeren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+effect+of+different+PD-L1+expression+patterns+in+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+of+the+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix.</a> Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).</li>
<li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beneficial+tumor+microenvironment+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+is+characterized+by+a+high+T+cell+and+low+IL-17%28%2B%29+cell+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency.</a> Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).</li>
<li>Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirkwood%2C+BR+%22Essential+Medical+Statistics%22">Essential Medical Statistics</a>. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).</li>
<li>Kleinbaum, D. G., Klein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinbaum%2C+DG+%22Survival+Analysis%3A+A+Self-Learning+Text%22">Survival Analysis: A Self-Learning Text</a>. , 2nd ed, Springer. (2005).</li>
<li>Fabre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Tumor+Microenvironment%3A+The+Protumor+Effects+of+IL-17+Related+to+Cancer+Type%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type.</a> Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ticari ya da finansal çıkar çatışması ilan etmez.

Açıklanan protokol için en kritik adımlardan biri, kullanılan primer antikorların doğru seyreltilmesini belirlemektir. Etiketli sekonder antikorların seyreltilmesi, bu spesifik Alexa etiketli antikorların imalatçısı tarafından tavsiye edildiği gibi 1: 200 idi. Birincil antikorların seyreltilmesi, daha sonra tercihen amaçlanan doku türünün iki farklı numunesi (bu durumda OPSCC) kullanılarak bir seri seyreltme ile belirlenmelidir. Optimal çalışma seyreltmesi, arka plan gürültüsü olmaksızın ve aynı konsantrasyonda negatif ...

Orofaringeal skuamoz hücreli karsinomlar (OPSCC), orofarenks kaynaklı heterojen bir skuamöz hücreli kanser grubudur. OPSCC için risk faktörleri human papillomavirus (HPV) enfeksiyonu ve alkol ve tütün kullanımı 1 , 2&#39;yi içerir . Bağışıklık tepkisinin rolü ve bunun klinik ortamda nasıl kullanılacağı henüz keşfedilmeye başlandı. Tümör mikro-çevre, kanser bölgesine çekici olan immün hücreler tarafından sızdırılır. Yüksek CD8 + sitotoksik T hücre frekansı OPSCC hastalarında 3 sağkalımın iyileşmesiyle korele olmasına rağmen, Tregs ve Th17 hücreleri de dahil olmak üzere diğer T hücre alt gruplarının rolü hala net değildir 4 . Th1 ve Th17 hücrelerinin tümör hücrelerini hedefleyen bağışıklık tepkisine yardımcı olması beklenirken, Treg&#39;ler diğer T hücrelerinin aktivitesini bastırma kabiliyetleri açısından iyi bilinir 5 . Bununla birlikte, T varlığıRegların farklı tümör tiplerinde hem olumlu hem de olumsuz yanıtlarla korele olduğu bulunmuştur 6 . Kanda bulunan tüm immün hücreler aynı derecede tümöre nüfuz etmediğinden, lokal tümör mikro ortamının incelenmesi tümöre yöneltilen bağışıklık tepkisinin en güvenilir ölçümünü sağlar. Bu çalışmanın amacı immün hücrelerin sayı ve tipleri ile klinik sonuç arasındaki korelasyonun belirlenmesidir. İnsan OPSCC&#39;sindeki çeşitli T hücresi alt popülasyonlarının sayısını ve lokalizasyonunu analiz etmek için dört renk flüoresan IHC görüntüleme kullandık. Toplam T lenfositlerine (CD3 + ), Th17 hücrelerine ve immünsüpresif FoxP3 + Treg&#39;lere odaklandık ve farklılaşma yolu Th17 hücreleriyle yakından ilişkiliydi. Th17 hücreleri CD3 ve IL-17 kombinasyonu ile karakterize edilir. Sitokin IL-17, aynı zamanda T olmayan hücreler tarafından üretilebilir 7 . İntra epitop dağılımını saptadıkHelial ve stromal T hücreleri, Tregs, Th17 ve IL-17 + T olmayan hücrelerden oluşan gruptan seçildi ve hasta sağkalımı ile olan korelasyonlarını analiz etti. Bir DAPI karşıt lekesi ile kombinasyon halinde CD3, Foxp3 ve IL-17 ekspresyonunu tanımlamak için çok renkli floresans IHC kullanıldı. Bu tahlil, her iki tümör hücresinin (DAPI nükleer boyaması kullanılarak) kolaylıkla ve net bir şekilde tanımlanmasına ve sızma T hücresi popülasyonlarının (farklı markörlerin bir kombinasyonu kullanılarak) tespit edilmesine izin verdi. Örnek hazırlama ve boyamayı takiben, kullanılan flüoresan renkleri ayırmak ve hem tümör epitelyumunda hem de tümör ilişkili stromada bulunan hücre sayısını ve türünü belirlemek için bir floresan mikroskopu ve görüntüleme yazılımı kullanıldı. Bağışıklık hücre popülasyonlarının sayısallaştırılması ve fenotiplenmesi için alternatif bir analiz, tümörün veya periferik örneklerin ( örn., Kan veya asit) uçuş zamanına (CyTOF) göre akış sitometrisi analizi veya sitometridir. Bunu kullanarakTekniği ile lokalizasyon ve farklı hücre tiplerinin göreceli dağılımı ile ilgili tüm bilgiler kaybolur. Periferik örneklerin kullanımı ve analizi, hangi hücrelerin tümörün mikro ortamına sızabildiğiyle ilgili bilgi sağlamamaktadır. Kan ve asitle immün hücre analizleri tümör dokusunda 8, 9 bağışık hücre içi filtrasyonundan fenotip ve sıklığını yansıtacak şekilde gösterilmemiştir edilmiştir. Başka bir alternatif parlak alan mikroskobu kullanımıdır. Bu tekniğin flüoresan görüntüleme üzerindeki avantajı, doku otofloresansının bulunmamasıdır. Bazı örneklerde daha otofloresans, özellikle eritrositler, ancak nötrofilik granülositler de dahil olmak üzere diğer hücre türleri de bulunmakla birlikte, bu bölgeler hemen hemen tüm numunelerin analizinde kolayca alınabilir. İmmünofloresans, hedeflenen flüoresan panelini kullanarak bir örnekteki birden fazla işaretçiyi analiz etme avantajını sunarNt dalga boyları. Bu, belirli bir antijen için yeterli sayıda etiketin ve piyasada mevcut olan antikor izotiplerinin olmaması nedeniyle parlak alan mikroskopisi için aynı ölçüde mümkün değildir. Burada tarif edilen çok renkli floresan IHC tekniği, insan lökosit antijenler (HLA) ve PD-L1 10, 11 gibi farklı immün hücre popülasyonları, hem de tümör hücresi-tanımlı molekülleri, çalışma kanser türleri ve antikor kombinasyonları bir çok farklı kullanılmıştır 12 . Protokol, birçok farklı örnek ve antikor çeşidi kullanılarak kurulmuş ve onaylanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Pathos Delta Ultra Hızlı Doku İşlemcisi</td><td>Milestone ve Histostar</td><td></td><td>Otomatik doku işlemcisi</td></tr><tr><td>Histostar</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Doku bloğu gömme makinesi</td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milliQ su</td><td>Elaga Purelab Chorus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafin balmumu / Paraclean</td><td>Klinipath</td><td>5079A</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom doku tutucu</td><td>Leica</td><td>RM225</td><td></td></tr><tr><td>Flex IHC tarafı</td><td>Dako</td><td></td><td>Doku slaytı</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merk-Milipore</td><td>1.083.821.000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bio-Rad</td><td>BUF036A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-CD3</td><td>Abcam</td><td>ab828</td><td>Titrat gerekli antikor seyreltmesi</td></tr><tr><td>Fare IgG1 anti-FoxP3</td><td>Abcam</td><td>ab20034</td><td>Titrat gerekli antikor seyreltmesi</td></tr><tr><td>Keçi IgG anti-IL-17</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AF-317-NA</td><td>Titrat gerekli antikor seyreltmesi</td></tr><tr><td>Tavşan Ig izotip kontrol antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab27472</td><td>Anti-CD3 ile aynı son konsantrasyonda kullanın</td></tr><tr><td>Fare IgG1 izotip kontrol antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab91353</td><td>Anti-FoxP3 ile aynı son konsantrasyonda kullanın</td></tr><tr><td>Keçi IgG izotip kontrol antikoru</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-6202</td> ile <td>aynı son konsantrasyonda kullanın anti-IL-17</td></tr><tr><td>Eşek anti-tavşan IgG A546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10040</td><td>1:200'ü %1 oranında seyreltin BSA/PBS</td></tr><tr><td>Eşek anti-fare-A647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31571</td><td>1:200'ü %1 oranında seyreltin BSA/PBS</td></tr><tr><td>Eşek keçi karşıtı IgG A488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11055</td> DAPI Vektör Laboratuvarları H-1200 içeren <td>BSA/PBS VectaShield'de 1:200 seyreltin</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 konfokal lazer tarama mikroskobu&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objektif</td><td>Zeiss</td><td>420852-9972-720</td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen Yazılımı</td><td>Zeiss</td><td>sürüm 2009</td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser</td><td>Zeiss</td><td>sürüm 4.2.0.121</td><td>www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html adresinden indirilebilir.</td></tr><tr><td>SPSS</td><td>IBM A.Ş.</td><td>sürüm 20.0</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>sürüm 1.50i</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij adresinden indirilebilir.</td></tr></tbody></table>

arşiv formalin sabitlenmiş, parafin gömülü İnsan orofaringeal skuamöz hücreli karsinoma Örneklerinde t-hücresi subpopülasyonlarının dört renkli floresan İmmunohistokimyası

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Dört renk floresan immünohistokimya (IHC) tekniği, bağıl dağılımı ve dokudaki lokalizasyonu göz önüne alırken, ilgili hücre popülasyonlarını nicelleştirmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu teknik, çeşitli tümör tiplerinde bağışıklık sızıntısının araştırılması için yoğun bir şekilde uygulanmıştır. Tümör mikro-çevre, tümör bölgesine çekilen bağışıklık hücreleri tarafından sızdırılır. Farklı immün hücre popülasyonlarının tümör mikro ortamında farklı roller oynadığı ve hastalığın sonucunda farklı bir etkisi olduğu bulunmuştur. Bu el yazması örnek olarak orofaringeal skuamöz hücreli karsinomda (OPSCC) multiparametre floresans IHC&#39;nin kullanımını açıklamaktadır. Bu teknik diğer doku örneklerine ve ilgi konusu hücre tiplerine kadar uzatılabilir. Sunulan çalışmada, büyük bir OPSCC kohortunun (n = 162) intraepitelyal ve stromal bölmesini analiz ettik. Toplam T lenfositleri (CD3 + ), immünosupresif düzenleyiciTümör epitelini stroma&#39;dan ayırmak için bir nükleer kontrast lekesi kullanarak , ory T hücrelerinde (Tregler; yani FoxP3 + ) ve T yardımcı 17 (Th17) hücrelerinde ( yani, IL-17 + CD3 + ). Az sayıda intratümöral IL-17 + T olmayan hücreler bulunan hastalarda iyileştirilmiş hastalıksız sağkalım ile yüksek sayıda T hücresinin korelasyon gösterdiği bulundu. Bu, IL-17 + olmayan T hücrelerinin, kanser hastalarında IL-17 ve kötü sağkalım arasında tarif edilen korelasyonla uyuşan OPSCC&#39;deki zayıf bir immün yanıt ile korele olabileceğini düşündürmektedir. Günümüzde, yeni multiparametre floresan IHC teknikleri 7 farklı florokrom kullanılarak geliştirilmektedir ve tümör mikro ortamında bağışık hücrelerin daha kesin karakterizasyonu ve lokalizasyonu sağlanacaktır.

Protokolü kullanılarak boyanmıştır (n = 162), daha önce tarif edildiği 13 tarif edildiği gibi Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi, Leiden, 1970 ve 2011 arasında, Hollanda&#39;da bulunan teşhis konmuş primer orofaringeal tümörlerden elde edilen FFPE ön tümör örneğinden oluşan bir seri, seçilen. Her slaydın bir ila dört rasgele görüntüsü analiz edildi ( Şekil 1 ). Bazı otofloresan hücreler gösterilir, bu da tamamen sarı görünümüyle ayırt ed...

Multiparametre floresan immünohistokimyası, tümör mikro ortamındaki bağışık hücre popülasyonlarının sayısını, göreceli dağılımını ve lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu el yazması oropharyngeal kanserdeki T hücresi alt popülasyonlarını analiz etmek için bu tekniği tanımlamaktadır.

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Bu deneyin genel amacı, orofaringeal skuamöz hücreli karsinom örneklerinden arşiv formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku kesitlerinde çeşitli T lenfosit alt popülasyonlarının çok renkli immünohistokimyasal görselleştirmesini ve sayımını gerçekleştirmektir. Bu yöntem, immüno-onkoloji alanında, tümör dokusunun infiltre eden immün hücrelerin alt popülasyonları ile hasta prognozu arasında bir bağlantı olup olmadığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknikle, bir doku bölümünde birkaç biyobelirteç görselleştirebilirsiniz.Bu tekniğin etkileri, çoklu bağışıklık hücrelerinin veya bağışıklık ile ilgili faktörlerin eşzamanlı olarak değerlendirilmesi, spesifik bağışıklık tedavileri için hasta tabakalaşmasına yardımcı olabileceğinden, kanser tedavisine kadar uzanır. Dört mikrometre kalınlığında formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku bölümleri elde etmek için bir mikro dil kullanarak başlayın ve doku şeritlerini elde edildikleri gibi 45 santigrat derece deiyonize su banyosunun yüzeyine yerleştirin. Kesitleri yakalamak için, suya, doğrudan doku örneğinin altına bir cam slayt yerleştirin ve slaytı belirli bir açıyla dikkatlice yukarı doğru hareket ettirin.Kaydırak sudan kaldırılırken bu bölüm cam yüzeye yapışacaktır. Numuneleri gece boyunca 37 santigrat derecede kuruttuktan sonra,% 100 ksilol içinde üç beş dakikalık toplam daldırma ile dokuları parafinden arındırın. Bölümler tamamlandığında parafinden arındırıldığında, doku örneklerini üç azalan etanol daldırması ile yeniden sulandırın.Ardından deiyonize suda beş dakikalık bir yıkama yapılır. Ardından, numuneleri mikrodalgada 10 dakika kaynar EDTA tamponuna batırın ve slaytları iki saat tamponda soğumaya bırakın. İlgilenilen antijenlerin etiketlenmesi için, numuneleri iki adet beş dakikalık PBS yıkama ile durulayın.İkinci yıkamadan sonra, dokuları primer antikorlarla inkübe edin ve PBS'de% 1 sığır serum albümini içinde seyreltilmiş ilgi, gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ertesi sabah, bölümleri beş dakikalık üç PBS yıkaması ile durulayın ve numuneleri bir saat boyunca oda sıcaklığında PBS içinde% 1 serumda seyreltilmiş uygun ikincil antikorlarla inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, slaytları az önce gösterildiği gibi PBS'de üç kez yıkayın ve slaytları nükleer bir karşı leke içeren sulu bir antifade montaj ortamı kullanarak monte edin.Numuneleri analiz etmek için, önce bir floresan mikroskobunda 20 ila 25 kat objektifi seçin ve ikincil antikorlar ve karşı boyama için uygun filtreleri kullanarak slayt başına dört görüntü yakalayın. Görüntüleri elde edildikleri gibi kaydedin. Ardından, uygun görüntü analiz yazılımında, ilgilendiğiniz ilk görüntüyü açın ve bindirme sekmesine tıklayın.İlgilenilen bölgenin sınırını belirlemek için kapalı poli çizgi şeklini seçin. Şekil kapatıldığında, ilgilenilen bölgenin yanında ölçümün yüzey alanı görünecektir. Slayt başına ortalama yüzey alanlarını ve ses sayılarını hesaplamak için tüm yüzey alanı verilerini elektronik tablo dosyasına kaydedin.Görüntüyü ImageJ'de açılacak bir TIFF veya JPG dosyası olarak dışa aktarın. Ardından, ImageJ'de ilgilendiğiniz ilk görüntüyü açın ve eklentiler menüsü altındaki hücre sayacını seçin. Ardından, başlat'a tıklayın, bir türe tıklayın ve bir tür olarak belirlenen her hücreye tıklayın.Florokrom ifadesine göre görüntüdeki farklı hücre türlerinin sayısını saymak için her hücre türü için farklı bir tür seçin. Son olarak, elektronik tablo dosyasındaki her görüntü için her sayaç kutusunda analiz edilen hücre sayısını kaydedin. Bu temsili deneyde, 1970-2011 yılları arasında Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi'nde teşhis edilen ve az önce gösterildiği gibi hazırlanan primer orofaringeal tümörlerden elde edilen bir dizi formalinle sabitlenmiş parafine gömülü tedavi öncesi tümör örneğinden dört rastgele görüntü analiz edildi.Bu deneysel örnekte, tam sarı görünümleriyle ayırt edildiği gibi bazı otofloresan hücreler gözlenirken, negatif kontrol slaytları arka plan dokusu otofloresansının üzerinde herhangi bir spesifik lekelenme göstermedi. Tüm tümör örneklerinin, IL-17'yi eksprese eden sadece küçük bir T hücresi alt kümesi ile değişen sayıda fox p3 pozitif, CD3 pozitif T hücreleri tarafından infiltre edildiği belirlendi. Yüksek sayıda toplam infiltre CD3 pozitif T hücresi olan hastalardan alınan örnekler, düşük T hücresi üyelerine sahip hasta örneklerine kıyasla daha iyi bir hastalıksız sağkalım ile korelasyona doğru bir eğilim göstermektedir.Ayrıca, düşük sayıda IL-17 pozitif hücreye sahip örneklerde, yüksek sayıda toplam sızan T hücresi de gelişmiş bir hastalıksız sağkalım ile ilişkilidir, bu da orofaringeal skuamöz hücreli karsinomda etkili tümör sızan T hücrelerinin mevcut düşük IL-17 pozitif hücre sayısı ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu numune hazırlama adımları, boyama seansı başına maksimum 25 slayt için bir buçuk günde tamamlanabilir. Numuneyi paraffanize etmek çok önemlidir, aksi takdirde çok fazla arka plan elde edersiniz.Bu teknik geliştirildikten sonra patoloji ve immünoloji alanlarındaki araştırmacıların önünü açmıştır. Çeşitli bağışıklık hücresi alt popülasyonlarının lokalizasyonu için mikro çevreyi keşfetmek için. Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli proteinleri ve hücre tiplerini tek bir arşiv dokusu bölümünde nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.Silo ile çalışmanın çok tehlikeli olduğunu unutmayın, her zaman bir akış kabininde çalışmalısınız.

four-color-fluorescence-immunohistochemistry-t-cell-subpopulations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Burada kantitatif immünofloresan, görüntü analizi, ve heterojenlik istatistiksel bir ölçü kullanarak, tümör malzeme histolojik bölümlerde moleküler heterojenite ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, klinik biyomarker geliştirme ve analiz kullanım için tasarlanmıştır.

Kantitatif İmmünofloresan kullanarak Tümörler Protein İfade heterojenite Haritalama

Detaylı bir iletişim kuralı için bir altı-marker multiplex ayirt panel en iyi duruma getirilmiş ve gerçekleştirilen, daha tutarlı sonuçlar ve daha kısa işlem süresi için bir otomatik stainer kullanarak. Bu yaklaşım doğrudan IMMUNO-Onkoloji araştırmalar amaçlı herhangi bir laboratuvar tarafından adapte edilebilir.

IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Human papilloma virüsü (HPV) RNA kromojenik in situ hibridizasyon tümörlerde aktif insan papilloma virüsü Enfeksiyon algılama için altın standartlarından biri olarak kabul edilir. HPV E6-E7 mRNA ifadesinin lokalizasyonu ve sinyalinin seminiceliksel değerlendirilmesi ile görselleştirilmesini sağlar.

Kromojenik In situ hybridization HPV Ile Ilgili baş ve boyun kanseri tanısı için bir araç ss

Burada, formalin-sabit parafin gömülü tümör doku bölümlerinde bağışıklık hücrelerini görselleştirmek, ölçmek ve haritalamak için basit ve erişilebilir bir strateji tanımlıyoruz. Bu metodoloji, mevcut görüntüleme ve dijital analiz tekniklerini görüntüleme testlerinin çoklama yeteneğini ve multiparametre analizini genişletmek amacıyla birleştirir.

Tümör Mikroortamında Bağışıklık Hücre Popülasyonlarının Görselleştirilmesi, Ölçülmesi ve Haritalanması

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Kanser immünoterapisi çağında, tümör mikroçevre dinamiklerini aydınlatmaya olan ilgi çarpıcı bir şekilde artmıştır. Bu protokol, boyama ve görüntüleme adımlarıyla ilgili olarak kütle spektrometresi görüntüleme tekniğini detaylandırır ve bu da oldukça çoklanmış mekansal analize izin verir.

Formalin-Sabit ve Parafin-Gömülü Doku Örneklerinin Kütle Spektrometrisi Görüntülemesini Kullanarak Tümör Mikroçevresinin Kavranmasının Genişletilmesi

Mevcut protokol, insan osteosarkom hücrelerinde lncRNA'ları lokalize etmek için bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini açıklamaktadır.

İnsan Osteosarkom Hücrelerinde Uzun Kodlamayan RNA Lokalizasyonu için RNA Floresan In Situ Hibridizasyon

Bu deneysel protokol, esas olarak tek kanallı antikor inkübasyon koşullarını optimize ederek ve klinik kökenli akciğer kanseri dokularında otofloresan ve kanal karışma problemlerini çözmek için antikorların ve kanalların ayarlarını ayarlayarak bir multipleks immünohistokimya (IHC) boyama yöntemini tanımlar ve optimize eder.

Parafine Gömülü Akciğer Kanseri Dokusu için Multipleks İmmünohistokimya Boyama

Multipleks siklik immünohistokimya, tekrarlanan antijen-antikor inkübasyonu, görüntü taraması ve görüntü hizalama ve entegrasyonu kullanılarak aynı anda birden fazla belirtecin in situ tespitine izin verir. Burada, akciğer kanseri ve eşleştirilmiş beyin metastazı örneklerinde bu teknoloji ile immün hücre substratlarının tanımlanması için çalışma protokolünü sunuyoruz.

Multipleks Siklik Floresan İmmünohistokimya

Bu rapor, otomatik bir slayt boyayıcı üzerinde multipleks immünofloresan (mIF) testleri için otomatik bir protokolü açıklar. Translasyonel araştırmalarda çok sayıda doku slaytında özel mIF tahlilleri için ideal olan standart yüksek verimli doku otomatik boyalayıcıları ve tam slayt floresan görüntüleyiciler üzerinde uzamsal proteomiklerin yüksek tekrarlanabilirliğini gösterir.

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Keşfedin, orofaringeal skuamöz hücreli karsinomda T hücresi alt popülasyonlarını çok renkli floresan immünohistokimya ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, immünoterapi için hasta sınıflandırmasına yardımcı olur.

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası (Video) | JoVE Journal

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

Daha fazla video keşfet