Name: Rekombinant mCD1d Böcek Hücrelerde Protein Üretimi İçin Bir Yöntem. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Öğrenin, High Five böcek hücrelerini hazırlayıp bakulovirüsle enfekte ederek rekombinant fare CD1d proteini üretme ve mCD1d tetramerleri oluşturma yöntemini. Bu teknik NKT hücre tanıma çalışmaları için gelişimsel immünolojide kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

I. Hücreler Çözülme TN5 hücreler dondurulmuş flakon alın ve 37 ° C su banyosu içinde çözünme. 25cm 2 TC balon böcek Express orta 5ml (Invitrogen, katalog numarası 10486) ekleyin. Hızlı beş Glutamin olmadan geldiğini unutmayın; 100X glutamin kalem strep veya 1 lt medya tek başına Glutamine 10ml eklemek gerekir. TN5 hücrelerin içine ekleyin ve 30 dakika boyunca 27 ° C inkübatör inkübe. Daha sonra, balonun altına bağlanan hücreleri bozmadan nazikçe DMSO ile orta aspirat. Taze orta 5ml ekleyin. II. Yetiştirme ve Hücreler genişletilmesi Her gün hücrelerin izleyin. Balon yaklaşık% 70 konfluent olduğunda, her iki tarafta şişesi vurarak süspansiyon hücreleri getirmek ve Böcek ifade orta ve hücre kültürü 5ml 21 ml ekleyerek 175cm 2 balon hücreleri aktarmak. Her T175 şişesi, son bir birim olarak 25-30ml orta etrafında olmalıdır. Split konfluent balonuna (yaklaşık 1 milyon / ml kons.) Gerektiği şekilde 1 / 4 veya 1 / 5. Hücreleri büyümek izin vermeyin. Hücrelere bölünmüş olduğunu pasajların sayısını. Hücre lizis sonucu hücrelerin yaşlanma neden olabilir, çünkü geçit sayısı 30 üzerinde büyümeye etmeyin. 1 milyon / ml konsantrasyonda istenen birimde ulaştığınızda, hücreleri enfekte. Ben genellikle genellikle yetmiş 175cm 2 şişeler ve yaklaşık tutarı 2 ile 2,5 litre kadar büyüyebilir. 25 / 30ml balon ya da beş 1 litre Erlenmeyer şişeler ve yaklaşık. Her balona 400ml 500 ml Not: Ya T-175 fiş mühür şişesi veya Corning Erlenmeyer şişesinin hücreleri büyüyebilir. Erlenmeyer şişeler büyüyen hücreleri daha hızlı ve kolay. III. End Point Seyreltme Yöntemi Virüs Titering <ol><li> Hızlı beş SFM orta 200ul düz dipli 96 plaka Plaka 3000-5000 hücreleri de ortalama. Hücreler 27 ° C&#39;de en az 30 dakika dinlendiriniz. </li><li> Bakülovirüs stok seri seyreltme olun. Bir de ortalama 250ul kullanarak, 96 U alt plakası bir satır, 1 / 10 dilüsyon yapmak gerekir. Dilüsyonları Express Beş SFM ortamda yapılır. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak farklı dilüsyonları sabit tutar (genellikle 20 ul), hücrelere aktarın. </li><li> 27 ° C&#39;de 7 gün süreyle Kültür. Kenar satır buharlaşmasını önlemek için, parafilm ile plaka kenarları sarın. </li><li> 7 gün sonra, plaka kontrol ve virüs seyreltme% 50 enfeksiyon verir belirlemek bu virüs konsantrasyonu az yarım kuyu bulaşmış). Sonra pfu / ml (pfu-plak oluşturan birim) cinsinden ifade edilir titresi hesaplamak için bir formül kullanabilirsiniz. En bakülovirüs kılavuzları formül bulundu. </li></ol> IV. Hücrelerini enfekte Bu virüs Tam titresi bilmek çok önemlidir. Virüs gerekli miktarda ekleyin. Viral stok hazırlanması için hücreleri değil, daha Yüksek İçişleri Bakanlığı viral mutasyonlar üretimine neden olur (1pfu Beş hücre 1High) 1&#39;den Enfeksiyon Çokluk (İçişleri Bakanlığı) enfekte olmalıdır. Protein üretimi için, her zamanki miktarı MO1 5-10. Örnek: MCD1d bakülovirüs titresi = 1X108 pfu / ml Ekle İçişleri Bakanlığı = 1 (virüs yükseltmek için) = 20X10 ^ 6 hücre / şişeyi / 1x10 ^ 8 pfu / ml = 200 ul / şişesi İçişleri Bakanlığı = 5 - 10 (toplam protein üretimi için) 20x10 = 1ml için 2ml ^ 6 hücre / şişesi Enfeksiyon sonrası 4. günde, enfekte olmuş hücreleri bakmak. Onlar, yüzen, şişmiş ve şekillendirme sosis müstakil olmalıdır. V. kurtarma süpernatantlar Enfekte şişeler orta alın ve 250ml mavi kapaklı Falcon İplik şişe transfer. Otoklavlanabilir ve yeniden kullanılabilir. 200rpm, 20 dakika, 4 ° C de eşit şişe doldurun ve Sorvall GSA rotor hücreler santrifüj Süpernatantı toplayın ve daha ileri saflaştırma için devam edin. VI. Rekombinant mCD1d Of Arıtma <ol><li> Diyaliz ve Konsantrasyon 150mm Sodyum Fosfat tamponu (pH 7.4) </li><li> Ni-NTA Agaroz Kromatografi, 150mm Sodyum fosfat 200 mM Immidazole protein mCD1d + B2M Zehir </li><li> Tuzsuzlaştırma sütun Immidazole, kurtulmak için 20mm Tris HCl pH8 tampon kullanarak çalıştırın </li><li> Kalan kirleri ortadan kaldırmak için MonoQ sütun kullanarak Anyon Değişimi Kromatografisi çalıştırın. </li><li> YM 30 konsantratör (Millipore) kullanarak 1mg/ml için Konsantre </li><li> , Bira enzimatik biotynlation üretici protokolü (Avidite) göre mCD1d </li><li> Serbest biotin salin (PBS), pH7.4 tamponlanmış fosfat kullanarak S200 sütunu (boyut dışlama Chromatograpy) tarafından elimine edilir. Biotynlated protein 2 ila 3 MGS ortalama 2 litre süpernatant elde edilebilir </li><li> A-Galcer CD1d tetramer üretimi. </li></ol> A-Galcer çözünür biotynlated CD1d-b2 CD1d molekül yüklemek içinm PBS içinde% 0.5 Tween -20,% O.9 Sodyum Klorür çözünmüş bir Galcer üç kat molar fazlalığı, oda sıcaklığında bir gece inkübe edilir. Konjuge streptavidin ve oda sıcaklığında 4 saat için kuluçka Tetramers bir Galcer yüklü CD1d monomerlerin PE, 4 kat molar fazlası ile karıştırılarak oluşturulur. 48 ° C saklayınız

<ol><li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).</li>
<li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> Nature. 434, 520-525 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).</li>
<li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+family%3A+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).</li>
<li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+tetramers%3A+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).</li>
</ol>

Bu yöntemde, başlatmak, büyümek, Böcek hücreleri enfekte ve bu hücreleri kullanarak bakülovirüs nasıl titresi nasıl gösterilir. Bu prosedürün en önemli yönlerinden hücrelerin korunması ve bakülovirüs tam titresi bilmek. CD1 tetramers yarattı, onlar glikolipid reaktif T hücrelerinin analizi için güçlü bir araç olarak kullanılabilir. Baculovirus sistemleri de MHC sınıf II tetramers bu nedenle bu işlemi çok daha geniş uygulanabilirliği içeren rekombinant proteinler üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Express Five SFM</td><td>Serumsuz Besiyeri</td><td>Invitrogen</td><td>10486025</td><td></td></tr><tr><td>High Five TM</td><td>Böcek Hücreleri</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine Pen strep</td><td>Antibiyotikler</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 TC Flask</td><td>Plastik</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 TC Flask</td><td>Tıpalı kapaklı flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-8</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer Flask</td><td>Hücre Kültür Flaskı</td><td>Fisher Scientific</td><td>07 200 672</td><td></td></tr><tr><td>YM 30 Konsantratör</td><td>30,000 MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC 903096</td><td></td></tr><tr><td>FPLC cihazı</td><td></td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BrA Enzimi ve Tamponu</td><td>Biyotinilasyon Kiti</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroz Kolonu</td><td>His Tag Protein Saflaştırma Kolonu</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuz giderme kolonu</td><td>Proteinden tuzları uzaklaştırmak için</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonoQ Kolonu</td><td>Anyon Değişim Kromatografisi</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 Kolonu</td><td>Boyut Dışlama Kromatografisi</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alpha-Galcer</td><td>Glikolipid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE- Streptavidin</td><td>Protein konjugasyonu için</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S-866</td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinant mcd1d böcek hücrelerde protein Üretimi İçin bir yöntem.

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteinler antijen sunan moleküllerin üçüncü sınıf oluşturmaktadır. Onlar noncovalently beta2-mikroglobulin ile ilgili yaklaşık 50 kDa glikozile ağır zincir olarak ifade edilen hücre yüzey glikoprotein. Bu lipidler ziyade peptidler bağlanır. Kendi yapısı MHC sınıf I ve sınıf II antijen sunan moleküllerin CD1 proteinlerin benzerlik teyit rağmen, mCD1d oluk nispeten dar, derin ve son derece hidrofobik ve klasik için açıklanan birkaç sığ cepleri yerine iki bağlayıcı cepleri var MHC antijen sunan moleküller kodlanmış. Kendi amino asit dizilerinin dayanarak, böyle bir hydrobphobic oluk lipid antijenlerin bağlanması için ideal bir ortam sağlar. Doğal Öldürücü T (NKT) hücreleri, bağlı veya CD1d tarafından sunulan glikolipitler tanımak için kendi TCR kullanın. CD1 tarafından sunulan lipidler reaktif T hücrelerinin otoimmün ve bulaşıcı hastalıklara karşı koruma ve tümör rejeksiyon dahil edilmiştir. Böylece, CD1-reaktif NKT hücre yanıtı belirlemek, arındırmak ve izlemek için yeteneği büyük önem taşımaktadır. CD1d alfa Galactosyl seramid (a-Galcer) tetramers nesil NKT hücreleri biyoloji önemli bir anlayışa sahiptir. Diğer CD1 molekülleri inşa Tetramers de üretilen edilmiş ve bu yeni reaktifleri lipid tabanlı aşılara yanıt izlenmesinde potansiyel kullanımı ile büyük ölçüde ve otoimmün hastalıklar ve diğer tanı, lipid-reaktif T hücrelerinin fonksiyonları bilgi genişlettik tedaviler.

Böcek hücreleri hazırlamak ve onları mCD1d tetramers üreten rekombinant mCD1d proteinand üretimi amacı bakülovirüs ile enfekte Bir Yöntem.

Rekombinant mCD1d Böcek Hücrelerde Protein Üretimi İçin Bir Yöntem.

CD1 proteinleri, antijen sunan moleküllerin üçüncü bir sınıfını oluşturur. Bunlar, yaklaşık 50-kDa glikozillenmiş... şeklinde eksprese edilen hücre yüzeyi glikoproteinleridir.

Merhaba, ben La Jolla Alerji ve İmmünoloji Enstitüsü Gelişimsel İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Mitch Kronenberg'in laboratuvarından Ashra Corona. Bugün size, MA CD 1D tetramerleri üretmek amacıyla high five böcek hücrelerinin nasıl hazırlanacağını ve VIR ile nasıl enfekte edileceğini göstereceğim. CD 1D tetramerleri, laboratuvarımız ve diğerleri tarafından NKT hücrelerinin tanınması için kullanılmaktadır.Rekombinant proteinlerin, bunlardan MS C sınıfı iki TE tremorları da dahil olmak üzere, üretilmesinde VIR sistemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Dolayısıyla, size gösterilecek olan prosedür çok daha geniş bir uygulama alanına sahiptir. Bu prosedür; High Five böcek hücrelerinin başlatılmasını ve büyütülmesini, hücrelerin CD 1D cDNA taşıyan reovirüs ile enfekte edilmesini, enfeksiyondan dört gün sonra santrifüjle süpernatantın hasat edilmesini, 150 mM sodyum fosfat tamponunda (pH 7.4) protein konsantrasyonunun lizis ile belirlenmesini, fare CD 1D proteininin nikel ve T agros ve iyon değişim kromatografisi yöntemiyle saflaştırılmasını, fare CD 1D proteininin YM 30 konsantratör kullanılarak 1 mg/mL konsantrasyona getirilmesini, fare CD 1D'nin AVID D protokolü ile enzimatik validasyonun

a-method-for-production-of-recombinant-mcd1d-protein-in-insect-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Kindlins İntegrinlerin yoluyla hücre yapışması temel vardır ama bunların çalışmalar bakteriyel konaklarda rekombinant olarak bunları ifade karşılaşılan zorluk engel olmuştur. Burada bakulovirüs ile enfekte olmuş böcek hücrelerinde bunların verimli üretimi için yöntemleri tarif eder.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Nonlytic böcek hücresi ifade sistemleri üretim, selüler trafik / lokalizasyonu ve rekombinant protein, fonksiyonel analiz için atıl edilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir lepidopteran hücresi çizgilerinde ifade vektörleri ve daha sonra geçici protein sentezlenmesinin üretilmesi için yöntemleri tarif eder. Hücre içi fluoresan işaretleyici proteinleri ile Bemisia tabaci aquaporins eş yerleşimi de sunulmuştur.

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Arızalı rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo iletim sistemi geliştirmek için yapay bir intronic küçük RNA ifade strateji kullanarak rapor. İnşaat, ambalaj ve larva enfeksiyon gelince de rAaeDV vektörlerin kantitatif analiz için detaylı bir yordam açıklanır.

Sivrisinek larva genlerin fonksiyonel analiz için bir gen teslim vektör olarak rekombinant sivrisinek Densovirus kullanın

Yabancı proteinler ifade veya anti-apoptotik etkinliğini potansiyel yabancı proteinler ve onların kesilmiş amino değerlendirmek için kullanılabilir bir ısı şok kaynaklı protein ifade sistemi (pDHsp/V5-O'nun/sf9 hücre), bu iletişim kuralını açıklar asitler böcek hücrelerinde.

Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

Burada, bir aracılı baculovirus böcek hücre ifade sistemi ile ev sinek carboxylesterase proteinler vitro üretmek ve daha sonra işlevsel olarak Permetrin, metabolize onların rolleri böylece, karakterize bir protokol pyrethroid veriyor mevcut rezistansının hücre tabanlı MTT tahlil ve vitro metabolik çalışmalar yürütmektedir.

Carboxylesterases böcek ilacı dayanıklı ev sinekleri, sinek Domestica içinde işlevsel karakterizasyonu

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarda kullanılacak protein arginin metiltransfenazlarının (PRMT) ekspresyon taraması ve üretimi için sağlam bir platformdur. Milligram miktarda malzeme, ökaryotik bir ifade platformu gerektiren PRMT'lerin ve diğer ilgi proteinlerinin çoğunluğu için üretilebilir.

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Öğrenin, High Five böcek hücrelerini hazırlayıp bakulovirüsle enfekte ederek rekombinant fare CD1d proteini üretme ve mCD1d tetramerleri oluşturma yöntemini. Bu teknik NKT hücre tanıma çalışmaları için gelişimsel immünolojide kritik öneme sahiptir.

Rekombinant mCD1d Böcek Hücrelerde Protein Üretimi İçin Bir Yöntem.

Daha fazla video keşfet