Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, tek bir fotoreseptör hücreden tek foton absorbsiyonundan kaynaklanan ışıkla uyarılmış akımları ve yoğun ışığa verilen tekrarlayan yanıtları ölçmek için tüm hücre voltaj klemp kayıtları elde etmektir. Bu yöntem, fototransdüksiyonun temelindeki fiziksel ve iyonik mekanizmalar ile TRP kanallarının özellikleri gibi duyusal transdüksiyon alanının temel konularının ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniği kullanmanın avantajları arasında membran voltajının tam kontrolü, son derece yüksek sinyal-gürültü oranı ve optik ölçümler için spesifik indikatörlerin ekleme yeteneği yer almaktadır.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, preparatın çok küçük boyutu ve metabolik hassasiyet nedeniyle diseksiyonun hızlıca gerçekleştirilme gerekliliği konusunda zorluk yaşayacaklardır. Bu prosedür için, sinekleri her flakonda yaklaşık 20 adet olacak yoğunlukta yetiştirin. Deney sırasında, kapanmak üzere olan pupaların bulunduğu ve en az 24 saattir sürekli karanlıkta tutulmuş birkaç flakon bulundurun.

Yetişkinler toplanmadan iki saat önce, çıkış yapmış olan tüm yetişkinleri uzaklaştırın. Karanlığa adapte edilmiş sineklerle her zaman kırmızı ışık aydınlatması altında çalışın. Yeni çıkış yapmış sinekleri beklerken kayıt odasını hazırlayın.

Banyoyu tamamlamak için, lamın alt kısmını eritilmiş parafin veya yüksek vakumlu silikon gres kullanarak sabitleyin. Ardından banyoyu, ters mikroskobun tablasına monte edin. Banyonun içine perfüzyon sistemi tüpünü, vakum sistemi tüpünü ve elektrofizyoloji düzeneği için toprak hattını yerleştirin.

Diseksiyona başlamadan önce, 60 milimetrelik bir Petri kabının arka tarafında bazı çözeltiler hazırlayın. Kalsiyumsuz ES'den dört ayrı damla ve bir damla TS damlatın. Şimdi, kaba cımbızlar kullanarak, yeni çıkmış bir sineği kanatlarından veya gövdesinden yakalayın. Ardından, ince cımbızlar kullanarak başı ayırın ve başı hızla kalsiyumsuz ES'nin ilk damlasına aktarın. Bir stereoskop altında, ikinci bir ince cımbız çifti kullanarak başı sagital düzlem boyunca ikiye ayırın.

Her iki gözün de sağlam kaldığından emin olun. Şimdi başın 1/2'sini ikinci kalsiyumsuz ES damlasına, başın diğer yarısını ise üçüncü kalsiyumsuz ES damlasına aktarın. Ardından iki gözden birinin diseksiyonuna geçin.

Retinaya herhangi bir zarar verilmediğinden emin olmak için, ince cımbız kullanarak gözü çevreleyen dokunun mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın. Ardından, korneanın kenarını ince cımbızla sıkıca kavrayın ve retinayı dışarı çıkarın. Sonuç, sağlam bir retinadan ayrılmış, boş ve sağlam bir kornea olmalıdır.

Pipetler etanol içinde saklanır, bu nedenle yeni bir tritürasyon pipeti kullanırken her zaman önce su ile durulayın. Ardından, durulanan pipeti dördüncü damladan itibaren küçük bir hacimde kalsiyumsuz ES ile doldurun. Sonra, hafif ağız aspirasyonu kullanarak izole edilen retinayı pipete çekin.

Hava kabarcığı oluşmamasına aşırı dikkat ederek işlem yapın. Ardından retinayı TS damlasının içine yerleştirin. Sonra, her iki retina da TS damlası içinde olacak şekilde, ikinci göz için retina izolasyonunu tekrarlayın. Daha sonra, Petri kabındaki kalsiyumsuz ES'yi nazikçe silerek temizleyin ve kabın yüzeyine altı damla daha TS ekleyin.

Her iki retinayı da yeni TS damlalarına transfer edin. Ardından tritürasyon pipetini, küçük çaplı ağza sahip bir pipetle değiştirin. Pipeti duruladıktan sonra, içine bir damla TS doldurun. Bu pipeti kullanarak, bazı ommatidiyaları pigment hücrelerinden ayırmak için her iki retinayı hızlı ve tekrarlı bir şekilde aspire edin ve dışarı verin. Bu işlem sırasında TS bulanıklaşacaktır.

Ardından, her iki retinanın kalıntılarını TS'nin başka bir damlasına aktarın. Sonra, izole edilmiş ommatidaları içeren bulanık TS damlasını pipete çekin. Çözeltiyi banyo haznesine boşaltın. Retina tamamen çözünene kadar bu işlemi, çapı giderek küçülen tritürasyon pipetleri ile tekrarlayın.

Şimdi, bir dakika bekleyin. Bu bekleme süresince, izole edilen ommatidialar odacığın tabanına bağlanacaktır. Bir dakika sonra, perfüzyon sistemini kullanarak 1.5 millimolar kalsiyum içeren ES akıtmaya başlayın.

Hazne doldurulurken, toprak hattı telinin ve emme tüpünün tamamen daldığından emin olun. İşleme geçmeden önce solüsyonun 60 ila 90 saniye boyunca akmasına izin verin. Başlamak için, banyodaki ommatidyaları dikkatlice incelemek üzere 40x objektifini kullanın.

Ommatidyumu oluşturan uzamış fotoreseptör hücre gövdelerinin aksonlarından ayrılmış olduğunu ancak canlı kaldığını gözlemleyin. Şimdi deney için uygun bir ommatidyum seçin. Aşağıdaki kriterleri karşıladığında seçim yapın.

Dış membran pürüzsüz ve bozulmamış olmalıdır. Uzun eksen, elektrodun distal taraftan yaklaşımına neredeyse dik bir açıda olmalıdır. Ayrıca, ommatidyum herhangi bir fazla doku ile çevrelenmiş olmamalıdır.

Seçim yapıldıktan sonra, ommatidyumu görüş alanının merkezine getirin. Şimdi bir pipeti deney için uygun olan hücre içi solüsyonla doldurun. Ardından pipeti elektrot tutucuya yerleştirin.

Ardından, biraz pozitif basınç oluşturmak için pipet tüpüne üfleyin ve tüp valfini kapatarak basıncı sabitleyin. Sonra, pipeti banyo haznesine yerleştirin ve yamalı pipetten gelen pozitif basınç nedeniyle membranda küçük bir çöküntü gözlemlenene kadar onu ommatidium'un distal bölümüne yakın bir yere yönlendirin. Şimdi, 100 hertz hızında iki milivoltluk sürekli kare voltaj darbeleri uygulamak için kayıt yazılımındaki membran test modülünü açın.

Ardından, patch clamp amplifikatör kontrollerini kullanarak, kare darbe tabanını sıfır akıma ayarlamak için bağlantı potansiyelini sıfıra ayarlayın. Daha sonra, pipetteki basıncı tahliye etmek için valfi açın ve negatif basınç oluşturmak için nazikçe aspire edin. Bu işlemden sonra pipet hücre membranına yapışmalıdır.

Bu gerçekleştiğinde, basıncı sabitlemek için vanayı kapatın. Şimdi elektrot direncini kontrol edin. Direnç, 100 ile 150 megaohm arasına yükselmiş olmalıdır.

Ardından, valfi tekrar açarak pipetteki negatif basıncı serbest bırakın. Direnç şimdi bir ila iki gigaohm arasına sıçramalıdır; bu durum, pipet ile hücre arasında bir C oluştuğunu gösterir. Daha sonra, patch clamp amplifikatörünü kullanarak pipetin kapasitif akımını dengeleyin.

Tüm hücre konfigürasyonunu oluşturmak için ağız aspirasyonu kullanarak hücre membranını patlatın. Elektrot içerisinde hızlı, kısa ve güçlü negatif basınç darbeleri oluşturun. Tüm hücre konfigürasyonu elde edildiğinde, kapasitansta ani bir artış meydana gelecektir.

Ardından, patch clamp amplifikatörünü kullanarak tutma potansiyelini gerekli voltaja ayarlayın ve seri dirençteki kapasitif akımları dengeleyin. Şimdi Faraday kafesinin siyah Fransız perdesini kapatın ve deneye başlayın. Floresan boya Lucifer yellow içeren bir patch pipeti ile tüm hücre konfigürasyonu elde edildikten sonra, ommatidyumu oluşturan fotoreseptörlerden yalnızca birinin boya ile yüklendiği görülebilir.

Bu fotoreseptör aynı zamanda ommatidyumdaki komşularından elektriksel olarak izole edilecektir. Yabanı tip sineklerden ve InaC veya InaD genlerinde mutasyonlar bulunan sineklerden elde edilen, tüm hücre voltaj klemp uygulanmış ommatidyumlar, sürekli sönük ışığa yanıt olarak kuantum tümsekleri göstermiştir. Her iki mutantta da yabanı tip sineklere kıyasla tümseklerin yavaş bir sonlanması gözlemlenmiştir.

Saniyede 150.000 foton şiddetinde verilen 500 milisaniyelik ışık darbelerine karşı normalleştirilmiş yanıtlar, değişen fizyolojileri net bir şekilde örneklendirmektedir. Bu preparasyon kullanılarak, bir milisaniyelik kısa süre boyunca verilen loş ışığa karşı tüm hücre voltaj klempli kuantum sıçrama yanıtlarını ölçmek bile mümkün olmuştur. Bu tür tek foton yanıtları; yaban tipi, arrestin mutant ve ninaC mutant sineklerde karşılaştırılmıştır.

Her iki mutant da bir dizi tümsekle yanıt verdi. Saniyede 15.000 foton olarak verilen 500 milisaniyelik bir ışık palsine verilen normalize edilmiş yanıtlar. Böylece, makroskobik yanıtın yavaş sonlanması arrestin-2 ve ninaC mutantlarında gözlemlenmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, Drosophila fotoreseptör hücrelerinden tüm hücre kayıtlarının nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik doğru şekilde uygulandığı takdirde bir saat içinde tamamlanabilir. Bu teknik; araştırmacıların TRP kanallarını ve inositol lipid sinyallemesini, ayrıca memelilerde bulunan ve görüntü oluşturmayan ışığa bağımlı aktivitelerde rol oynayan intrinsik olarak ışığa duyarlı retinal ganglion hücrelerinin işlevini daha iyi anlamalarının önünü açmıştır.