Biyolojik Örneklerden Kanser Kök Hücrelerini Algılamak ve Arıtmak İçin DNA Boya Tarafından Tetiklenen Yan Populasyon Fenotipi Kullanmak

Bu prosedürün genel amacı, yan popülasyon hücrelerinin boya ekstrüzyon kapasitesine dayalı olarak biyolojik örneklerde varsayılan kanser kök hücre popülasyonlarını tespit etmektir. Bu yöntem, kanser kök hücresi araştırmalarında, biyolojik örneklerden kanser kök hücrelerinin tespiti ve saflaştırılması için güvenilir araçlarla ilgili önemli bir soruyu ele almaktadır. Bu tekniğin ana avantajı, işlevsel işaretleyicileri dağıtması ve bu nedenle daha iyi çözünürlük sağlamasıdır.

Ek olarak, bu ABC ilaç taşıyıcılarının ekspresyonu kanser kök hücreleri arasında yüksek oranda korunur ve bu nedenle bu tekniği birçok farklı kanser varlığı için kullanabiliriz. Bu tekniğin etkileri, anti-kanser kök hücre terapötiklerinin keşfine doğru uzanır, çünkü yüksek oranda saflaştırılmış kanser hücrelerinde gen ekspresyonu profili oluşturma ve hedef doğrulama gibi aşağı akış analizlerini kolaylaştırır. Dolayısıyla bu yöntem, kanser kök hücrelerinin özellikleri hakkında fikir verebilir.

Bu yöntemi, kemik iliği gibi popülasyonları ifade eden ABC ilaç taşıyıcısını içeren bir sistem olarak nitelendirmek için de kullanabiliriz. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Elisabeth Hoflehner olacak. Başlamak için, istenen insan kanseri hücre hattını% 10 FBS, iki milimetre L-glutamin ve antibiyotiklerle desteklenmiş 10 ila 30 mililitre RPMI 1640 ortamında 37 santigrat derecede kültürleyin.

Hücreler yaklaşık% 70 ila 90 birleşime ulaştığında, ortamı çıkarın ve hücreleri kültür kabı yüzeyinden ayırmak için iki mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Daha sonra, hücreleri 10 mililitre kültür ortamı ile yıkayın, süspansiyonu 15 mililitrelik temiz bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede 250 kez G'de döndürün. Hücreler peletlendikten sonra, suprenatı atın ve peleti bir mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunun küçük bir alikotunu tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Test numunelerini hazırlamak için, mililitre başına on ila altı hücreye bir kez hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri taze kültür ortamında askıya alın. Hücre yoğunluğunu ayarladıktan sonra, numunenin üç mililitresini test olarak etiketlenmiş 15 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.

Ardından, numuneye 10 mikromolar menekşe boya ekleyin ve süspansiyonu hafifçe girdaplayın. Daha sonra, 500 mikrolitre boya içeren hücre süspansiyonunu kontrol olarak etiketlenmiş iki akış sitometri tüpüne aktararak inhibisyon kontrollerini hazırlayın. İlkine 50 mikromolar Verapamil ekleyin.

Ve ikinci tüpe 20 mikromolar Fumitremorgin C. Ve çözeltileri nazikçe pipetleyerek karıştırın. Tüm tüpleri kapaklarla örtün ve karanlıkta 37 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin.

Numuneleri her 15 dakikada bir hafifçe çalkalayın. Boyama tamamlandıktan sonra, inhibisyon kontrollerini üç ila dört mililitre buz gibi soğuk PBS'de yıkayın. Ve daha sonra antikorlarla birlikte boyama için test numunesinin alikotlarını hazırlayın.

Bu alikotları da yıkayın ve potansiyel hücre agregalarını uzaklaştırmak için tüm numuneleri 70 mikronluk kesilmiş süzgeçlerden süzün. Daha sonra süspansiyonları 250 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Elde edilen peleti 100 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse ettikten sonra, hücreleri ışıktan korunan buz üzerinde tutun.

Daha sonra, mor boya ile boyanmış hücrelere uygun bir flurokrom konjuge antikor paneli ekleyin. Süspansiyonları girdaplayın ve karanlıkta dört santigrat derecede 20 ila 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri üç ila dört mililitre buz gibi soğuk PBS'de yıkayın, istenirse numuneyi süzün.

Ve sonra beş dakika boyunca dört santigrat derecede 250 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peletlenmiş hücreleri 100 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Son olarak, mor boya ile boyanmış hücrelere 7-AAD ekleyin.

Ve örnekleri karanlıkta beş ila 10 dakika inkübe edin. Akış sitometresini kullanarak hücreleri analiz etmek için, bir FSC SSC nokta grafiği üzerinde uygun bir hücre popülasyonunu kapılayın. Ardından, farklı FSC sinyalleri kullanarak, seçilen popülasyondan tüm hücre agregalarını hariç tutun.

Canlı hücre popülasyonunu elde etmek için pozitif 7-AAD boyaması ortaya çıkaran hücreleri hariç tutun. Mavi ve kırmızı boya emisyonu için bir nokta grafiği oluşturmak için, y ekseninde mavi floresan kanalını ve x ekseninde kırmızı floresan kanalını görüntüleyin. Her iki kanalı da doğrusal moda geçirin ve dedektör voltajını, yan popülasyon grafiğin sol alt kısmında yer alacak şekilde buna göre ayarlayın.

Ardından, yan popülasyonu kapılayın. Ve satın almayı durdurun. Ardından, inhibisyon kontrollerini yükleyin ve verileri alın.

Son olarak, x ekseninde mor boyanın kırmızı çiçeklenmesini ve logaritmik modda çizilen y ekseninde uygun bir çiçeklenme kanalını gösteren bir nokta grafiği oluşturun. Numuneyi yükleyin, ardından dedektör voltajlarını buna göre ayarlayın ve incelenen yüzeyi ifade eden yan popülasyon hücrelerinin fraksiyonunu belirleyin. Ardından, verileri kaydedin.

Burada, insan yumurtalık kanseri hücrelerinde gerçekleştirilen yan popülasyon analizinin temsili sonuçları sunulmaktadır. Mavi ve kırmızı-mor emisyon analizi ile ayırt edilen yan popülasyon, nokta grafiğinin sol alt çeyreğinde tanımlandı ve analiz edilen tüm popülasyonun %0.70'ini oluşturdu. Akış inhibitörlerinin daha sonra kullanılması, daha önce tanımlanmış hücreler için gözlemlenen çiçeklenme sinyalinin kaybolmasına neden oldu ve yan popülasyon fenotiplerini doğruladı.

Son olarak, insan yumurtalık hücreleri de ABCG2 ekspresyonu açısından karakterize edildi. Tanımlanan yan popülasyona karşılık gelen hücrelerin% 0.67'sinde ABCG2 pozitif boyanma gözlendi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür uygun şekilde yapılırsa yaklaşık iki ila üç saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, yan popülasyon fenotipinin kesinlikle optimal bir boya konsantrasyonunun hücre yoğunluğu oranına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, deneyden önce her iki değişkenin de hidrasyonu şiddetle tavsiye edilir. Bu prosedürü takiben, yan popülasyon hücrelerini daha fazla karakterize etmek ve böylece gelecekteki ilaç geliştirme için yeni kanser kök hücresine özgü hedefleri belirlemek için gen ekspresyon profillemesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra bu teknik, kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların hem farelerde hem de erkeklerde doku kök hücrelerinin ve kanser kök hücrelerinin özelliklerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, menekşe boya ile tetiklenen yan popülasyon SA'nın nasıl gerçekleştirileceği ve kendi laboratuvarınızdaki biyolojik örneklerde varsayılan kanser kök hücrelerinin nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Biyolojik numunelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürle çalışırken KKD ve biyolojik güvenlik kabinlerinin kullanımı gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.