Name: Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Öğrenin, insan osteosarkom U-2 OS hücrelerinde stres granüllerini sitoplazmik odaklardan ayırt etmek için immünofloresan ve FISH yöntemlerini nasıl kullanacağınızı. Bu protokol, hücresel stres yanıtlarını incelemek için SG oluşumunu ve bileşimini doğru analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu el yazması üzerine faydalı tartışmalar ve geribildirimler için Ivanov ve Anderson laboratuvarlarının üyelerine teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklendi [WP için GM111700 ve CA168872, PI için NS094918], Polonya Ulusal Bilim Merkezi [WS&#39;ye hibe UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054]. WS ayrıca, Polonya&#39;daki Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı (Mobility Plus Programı) ve Lehçe-Amerikalı Fulbright Komisyonu&#39;nu ABD&#39;deki araştırmasına maddi destek verdiği için onayladı.

1. Hücre Hazırlama <ol><li> Şekil 1A&#39;da belirtildiği gibi otoklavlanmış lamelleri, 24 delikli bir plakanın 12 kuyucuğuna ekleyin; Bu, her lamelleri almak için bir vakuma tutturulmuş steril bir Pasteur pipeti kullanılarak yapılabilir. Lamerlerin kuyuya düşmesine izin vermek için emmeyi serbest bırakmak için nazikçe kuyunun kenarındaki lamelleri hafifçe vurun. </li><li> Plaka 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarkom hücreleri, 500 ul&#39;lik bir orta hacimde oyuk başına. Hücrelerin eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı yana çevirin ve yukarı ve aşağı doğru birkaç kez hareket ettirin. </li><li> Lamelleri kuyunun en alt kısmında ve lamel altında kabarcıklar olmadığından emin olmak için nazikçe lamelleri aşağı doğru temiz bir P1000 ucu ile bastırın. </li></ol> 2. Stresli Hücreler <ol><li> Ertesi gün, hücrelerin lamellerin her tarafında eşit olarak dağılmış ve eşit şekilde birleştiğinden emin olmak için plakayı görsel olarak kontrol edin;Erkekler sonuçların tekrarlanabilirliğini olumsuz yönde etkileyebilir. Ters çevrilmiş doku kültürü mikroskopu üzerinde 10X&#39;lik bir hedef kullanın. </li><li> Ortamı 37 ° C&#39;ye ısıtın. Sırasıyla soğuk şok veya ısı şokuya neden olduğundan, hücrelere soğuk veya sıcak ortam uygulamanızdan kaçının. </li><li> İlacı önceden ısıtılmış ortamda seyreltin. Her bir farklı ilaç konsantrasyonu için, 500 uL ortam içeren 2 göz hazırlayın. Pipetleme yaparken kaybedilmesine izin vermek için ek 500 mcL hazırlayın. Alkol 4 tüp, her biri 1.5 mL içerir. <ol><li> Sodyum arsenit için: 500 uL içeren her oyuğa, 1.5 mcL 100 mM sodyum arsenit (nihai konsantrasyon: 100 uM) ekleyin veya 100 mM sodyum arsenit (son konsantrasyon: 50 uM) 0.75 μL ekleyin. </li><li> Vinorelbin için: 500 uL içeren her oyuğa 22.5 μL 10 mM vinorelbin (nihai konsantrasyon: 150 uM) ekleyin veya 18.75 μL 10 mM vinorelbin (nihai konsantrasyon: 100 uM) ekleyin. NOT: Sodyum arsenit<html> Iyi karakterize edilmiş ve sıkça kullanılan bir stres granül uyarıcısıdır ve bu nedenle klasik olarak pozitif bir kontrol olarak kullanılır. </li></ol></li><li> Ortamları B1 - 4 ve C1 - 4 kuyularından çıkarın ve atın. İlaçları medyaya ekleyin ve 60 dakika bekleyin (Şekil 1A). <ol><li> Kuyu B1 ve B2&#39;ye 100 uM sodyum arsenit ile 500 uL orta madde ekleyin. B3 ve B4 kuyularına 50 uM sodyum arsenit ile 500 uL orta madde ekleyin. </li><li> Kuyu C1 ve C2&#39;ye 150 uM vinorelbinli 500 uL orta madde ekleyin. Kuyu C3 ve C4&#39;e 125 uM vinorelbinli 500 uL orta madde ekleyin. </li></ol></li><li> Fiksasyondan 30 dakika önce kolon 2&#39;deki oyukları 5 μL sikloheksimid (1 mg / mL stok) ve kolon 4&#39;deki oyukları 2 uL puromisin (1.25 mg / mL stok) ile muamele edin. 37 ° C inkübatörde plakayı yerleştirmeden önce karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın. </li></ol> 3. Hücre fiksasyonu ve immünofloresans Nt &quot;&gt; NOT: Deneyden önce metanolün -20 ° C&#39;ye soğutulduğundan emin olun Fosfatla tamponlanmış Tuzlu Su (PBS),% 5 Normal At Serumu (NHS) ve% 4 paraformaldehid (PFA ) PBS içinde. <ol><li> Ortamı atın ve lamelleri içeren kuyuları PBS ile yıkayın. Kullanılan ilaçlara bağlı olarak, ilaç içeren medyayı uygun bir şekilde atmak önemli olabilir; Belirli talimatlar için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun. Etkin bir şekilde yıkamak için, sıkıştırılmış bir şişeyi PBS ile doldurun, sıkı bir akış olmadan nazik bir akış sağlamak için ucu kesin ve orijinal PBS&#39;yi aspire ettikten sonra her kuyuya PBS eklemek için kullanın. </li><li> Nazik ajitasyon altında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ~ 250 mcL% 4 PFA kullanarak hücreleri düzeltin. PFA ile lamelin üstünü tamamen örtün; 250 μL yeterli olmalı, ancak değilse daha fazla ekleyin. Bazı hücreler (veya hücrelerin stres tedavileri) bağlanmayı değiştirebileceğinden daima lamellerin üzerine doğrudan pipet koymaktan kaçının.Pipetleme gücü hücreleri uzaklaştırır. </li><li> PFA&#39;yı çıkarın ve doğru şekilde atın. Paraformaldehidi uygun bir şekilde nasıl atacağınız hakkında ayrıntılı bilgi için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun. </li><li> ~ 250 μL metanol (-20 ° C) ekleyin ve nazik sallanan ortamda oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin; Bu her ikisi hücreleri permeabilize eder ve düzleştirir. </li><li> Metanolü çıkarıp atın ve 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında 1 saat boyunca ~ 250 uL% 5 NHS uygulayarak hücreleri bloke edin. Metanolün uygun şekilde atılmasına ilişkin ayrıntılar için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun. </li><li> Birincil antikorlar için, antikorları% 5 NHS&#39;de seyreltin. NOT: Gözlemlenen granüllerin iyi SG&#39;ler olup olmadığını teyit etmek için çoklu SG işaretlerinin kullanımı anahtardır. Kullanılabilecek SG işaretlerinin sayısı, mikroskopta bulunan filtrelere bağlıdır. Standart yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı filtre setleri mevcutsa, 1/250 seyreltme ile G3BP1, eIF4G ve eIF3b&#39;yi kullanın. <ol><lI&gt; Bu deney için (250 ul&#39;lik lamelleri, her biri toplam: 3 mL,% 5 NHS), aşağıdakilerden her birinden 12 μL ekleyin: anti-G3BP1, anti-eIF3b ve anti-eIF4G. Birincil antikorları, 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında veya O / N&#39;de en az 1 saat nazik ajitasyonla kuluçkalayın. </li></ol></li><li> Kuyucukları PBS ile 3 kez yıkayın ve her yıkamayı 5 dakika inkübe edin. </li><li> İkincil antikorlar için, tüm ikincil antikorları (1/250 seyreltme) ve Hoechst boyasını (1/1000 seyreltme)% 5 NHS&#39;de seyreltin. <ol><li> Bu deney için, her birinden 250 μL&#39;de lamelleri toplamı: 3 mL% 5 NHS), aşağıdakilerden her birinden 12 uL ekleyin: Cy2-Fare, Cy3-Tavşan ve Cy5-Keçi (her biri bir 1/250 seyreltme ) Ilave edin ve 3 μL Hoechst boyayı ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca lamelleri ikincil antikorlarla inkübe edin. Bu ve takip eden adımlar sırasında plakayı bir kutu ile örterek veya doku kültürü çanağının üstüne folyo koyarak örnekleri ışığa karşı koruyun. </li></ol></li><li> Biz yıkaHer biri 5 dakika PBS ile üç kez. </li><li> Etiket cam slaytlar üzerine montaj orta kullanarak lamelleri monte edin. Montaj ortamını, 37 ° C&#39;lik bir ısı bloğunda 10 dakika boyunca ısıtın; Bu viskozite azalır ve pipetlenmeyi kolaylaştırır. Kesilmiş bir P200 ucu ile, cam slayt üzerine lamel başına ortalama 25 μL pipetleme; 4-8 lamelleri, mikroskop aşamasının buna izin verdiklerini varsayarak bir cam slaydına sığabilir. İnce forseps kullanarak, lamelini kuyudan slayda aktarın, hücrenin yüzeyi ayağın altına yerleştirdiğinizden emin olun. Temiz bir P200 ucu kullanarak, lamel aşağı doğru bastırın. </li><li> Tüm lamelleri monte edildikten sonra, laboratuar dokusunu slayt üzerine sıkıca basarak aşırı montaj ortamını temizlemek için katlanan laboratuar dokularını kullanın. Fazla montaj ortamını boşaltmak için H 2 O içeren bir sıkıştırma şişesi kullanın ve sonra suyun alınması için katlanmış laboratuvar dokusu ile lekelenmeyi tekrarlayın. </li></ol> 4. Fluorescence In Situ &lt;/ Em&gt; Hibridizasyon (FISH) <ol><li> Bir kılavuz olarak 1 ve 2.1-4 adımlarını kullanarak hücreleri plaklayın ve tedavi edin; Aşağıdaki deneyde sadece 3 lamel batması gerektiği için, hücreleri 1 sütununa yerleştirmeniz yeterlidir. </li><li> Tüm tamponların hazırlandığından emin olun ( yani PBS içinde% 4 PFA, suda% 70 etanol, 2X Tuzlu Sodyum Sitrat (SSC) ve% 5 NHS), metanol -20 ° C&#39;ye soğutulur ve bu da Hibridizasyon fırını uygun sıcaklığa kadar ısıtılır. </li><li> Hücreleri yıkamak ve düzeltmek için 3.1-3.3 adımlarını uygulayın. </li><li> 10 dakika boyunca -20 ° C metanol ekleyerek hücreleri geçirir hale getirin. </li><li> Metanolü çıkarın ve lamelleri% 70 etanol içinde inkübe edin. Plakayı gece boyunca 4 ° C&#39;ye yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için parafilm kullanarak tabakayı mühürleyin. </li><li> Ertesi gün, etanolü çıkarın ve 500 μL 2x SSC ilave ederek hücreleri yeniden su haline getirin. Lamelleri, oda sıcaklığında nazik ajitasyonla 5 dakika inkübe edin. </li><li> 2x SSC&#39;yi çıkarın ve 500&#39;ü ekleyinΜL 2X SSC. Nazik ajitasyonda 5 dakika inkübe edin. </li><li> Hibridizasyon fırınının altına parafilm bir parça koyun. Her lamel için parafilm üzerine hibridizasyon tamponu pipet 25 mcL. (Bu noktada, lamelleri hücre tarafında olan) 24 yuvalı lamel kaldırın ve hibridleştirme tampon üzerinde lamel hücre tarafı aşağı yerleştirin. Bunu 42 ° C&#39;de veya isteğe bağlı olarak 65 ° C&#39;de 15 dakika boyunca yapın. NOT: Bu adımı 65 ° C&#39;de tamamlamak hücresel RNA&#39;ları denatürecektir; PolyA proteinlerle etkileşimler tarafından maskelenirse, bu sinyali artırabilir. </li><li> Hibridizasyon tamponu içinde Biotin-Oligo (dT) probunu (100 ng / μL) 2 ng / ml&#39;lik bir konsantrasyona kadar seyreltin; Lamel başına 25 μL yeterlidir. </li><li> Her lamel için, parafilm üzerine Biotin-Oligo (dT) içeren hibridizasyon tamponu pipetle 25 mcL. Forseps ile lamel Pick up ve yavaşça bir laboratuar dokusu üzerine lamel kenarına dokunmak aşırı kaldırmak içinHibridizasyon tamponu. Lamelini, Biotin-Oligo (dT) ile hibridizasyon tamponuna aktarın; Hücre tarafını aşağıya tutmayı unutmayınız. </li><li> Buharlaşmayı sınırlandırmak için lamelleri bir hibridizasyon kutusuna yerleştirin. Lamelleri Biotin-Oligo (dT) ile melezleme tamponu içinde 42 ° C&#39;de 60 dakika inkübe edin. </li><li> 42 ° C&#39;ye dengelenmesine izin vermek için melezleme fırınına 2x SSC yerleştirin. </li><li> 24-yuva çanağındaki çukurlara ~ 500 uL ısıtılan 2x SSC ilave edin ve lamelleri kuyuya aktarmak için forseps kullanın. 10 dakika inkübe edin. </li><li> Yukarıdaki yıkama adımını 42 ° C&#39;de iki kez ve oda sıcaklığında iki kez tekrarlayın. </li><li> Geleneksel bir antikor yerine Biotin-Oligo (dT) saptamak için bir streptavidin florokrom kullandığınızdan emin olun, 3.5-3.10 adımlarını tamamlayın. </li></ol> 5. Translasyonel Durumu Değerlendirmek için Ribopuromycylation Testi <ol><li> Adım 1&#39;de belirtildiği gibi lamelleri Üzerinde U2OS plakaları plaka, ancak koşul başına sadece bir lamel slayt (buOlgu, 3 lamelleri: tedavi edilmedi, 100 uM sodyum arsenit ve 150 uM vinorelbin) ( Şekil 1A). </li><li> 2. adımda protokolü kullanarak, adım 2.1-2.4&#39;i tamamlayan hücreleri stres haline getirin. </li><li> Fiksasyondan 5 dakika önce, 2 μL puromycin (stok: 1.25 mg / mL, 5 μg / mL&#39;lik bir nihai puromisin konsantrasyonu elde etmek için 500 μL&#39;de 2 μL seyreltin) ve 2.9 μL emetin (stok: 20 μg / mL; 2.9 uL, zaten puromisin içeren aynı çözeltiye) 0.5 mL içeren her kuyuya ilave edildi. </li><li> Puromisin tespit etmek için bir anti-puromisin antikor (1/1000 seyreltme) kullanarak, yukarıda belirtildiği gibi 3.1-3.10 adımlarını tamamlayın. İdeal olarak, kalan kanallarda iki SG işaretçisi kullanın. </li><li> Puromisin sinyalini nicelleştirirken, tüm görüntüleri aynı pozlamayı kullanarak alın. En parlak (çekilmemiş) örneği kullanarak ve doygunluk olmadan mümkün olduğunca parlak bir görüntü alarak bu pozlamayı seçin. NOT: Anti-puromycin floresan sinyalinin yoğunluğuBir amino asit yerine puromisin olduğu için devam eden çeviri, yeni proteine ​​dahil olur ve proteinin erken terminasyonunu zorlar. </li></ol> 6. Görüntü Edinimi ve Analizi <ol><li> Stres Granüllerinin Miktar Tayini <ol><li> SG&#39;leri ölçmek için 40X&#39;lik bir objektif kullanarak örnek başına 100&#39;den fazla hücre toplamı olan 3 - 5 görüntü elde edin. Alternatif olarak, diğer hedefleri kullanarak görüntüler elde edin, ancak&gt; 100 hücre lâtivite için sayılır ve büyütme granülleri net bir şekilde görselleştirmek için yeterince büyük olduğundan emin olun. Bunu lamelini beş kabaca eşit bölgelere bölerek ve her bölgeden rastgele bir alan seçerek yapın ( Şekil 1B ); Işaretçilerin birlikte yerelleştirilmesini değerlendirmek için aynı alanın görüntüleri tüm kanalları içermelidir. </li><li> Tüm görüntüler edinildikten sonra, kanalları birleştirin. Bazı kamera yazılımı bunu otomatik olarak yapar, diğerleri manuel birleştirmeyi gerektirir; Bu ile yapılabilirImageJ tüm görüntüleri açıp ardından [Resim | Renkli | Birleştirme Kanalları]. </li><li> Hoechst&#39;i çekirdek markörü olarak kullanarak, çekirdek sayısını sayarak toplam hücre sayısını elle sayın. Hücre başına ikiden fazla SG içeren hücrelerin sayısını manuel olarak hesaplayın. NOT: Örneğin, G3BP1 (yeşil), eIF4G (kırmızı) ve Hoechst (mavi) görüntüleyen birleştirilen bir üç kanallı görüntü kullanarak mavi kanalı kullanarak çekirdeği (veya hücre sayısını) sayın. Daha sonra, SG pozitif hücreleri hücre başına iki veya daha fazla sarı odak olan hücreler olarak sayın. Granüller, G3BP1&#39;den yeşil olarak, sarı renkte görünür ve eIF4G&#39;den gelen kırmızı, eğer birlikte yerelleştirilmişse sarı görünür. </li><li> 3-5 bağımsız bölgeden gelen verileri birleştirerek SG pozitif olan hücrelerin yüzdesini belirleyin ve hesaplayın: SG pozitif / çekirdek sayısı) * 100 = SG-pozitif hücrelerin yüzdesi </li></ol></li><li> Hat Yerinde Tarama Analiziyle Kolokalizasyonu Değerlendirme - Manuel Yöntem <ol><li> AçıkImageJ. () Adresinden ücretsiz indirebilirsiniz </li><li> ROI yöneticisini açın: [Analiz et | Araçlar | ROI yöneticisi ...]. </li><li> Birleştirilmiş görüntüyü ImageJ&#39;de açın: [File | Açık]. </li><li> ImageJ araç çubuğunda bulunan çizgi aracını kullanarak, SG&#39;den önce ve sonra eklediğinizden emin olarak bir SG&#39;den geçen bir satır ekleyin. ROI yöneticisi penceresinde [Ekle] öğesini tıklatarak bu satırı ROI yöneticisine ekleyin. </li><li> Her işaretçinin granüle lokalizasyonu değerlendirmek için birleştirilmiş görüntüyü ayrı kanallara bölün. [Image | Renkli | Bölünmüş Kanal]; Bu, birleştirilen görüntüyü üç siyah-beyaz görüntü haline bölecektir. </li><li> Siyah-beyaz görüntüde satırın seçili olduğundan emin olun; Çizgi resimde göründüğü takdirde seçilir. Değilse, ROI yöneticisi penceresinde paneldeki çizgiyi tıklayın; ROI yöneticisi penceresinde çizgi mavi renkte vurgulanır ve çizgiyi siyah-beyaz görüntüde görünür hale getirecektir. Hat hala görünmüyorsa, &quot;show all&quot; seçeneğinin ch olduğundan emin olunROI yöneticisinde ecked ve ardından resimdeki satırı tıklayın. </li><li> Satırın yoğunluğunu analiz edin: [Analiz et | Arsa Profili]; Bu, hat boyunca sinyalin yoğunluğunu gösteren &quot;Plot Profile&quot; penceresini ortaya çıkaracaktır. </li><li> &quot;Plot Profile&quot; penceresinde, [Listele] &#39;ye tıklayın; bu, grafikten ham verileri içeren bir pencere açar. Bu penceredeki tüm verileri kopyalayın ve bir elektronik tablo dosyasına yapıştırın. Bunu yapmak için, penceredeki tüm verileri seçin: [Düzenle | Hepsini seç]. Tarihi kopyalayın: [Düzenle | Kopya]. Bir elektronik tablo dosyasını açın ve verileri yapıştırın: [Düzenle | Yapıştırmak]. </li><li> Her bir kanal için 6.2.6 - 6.2.8 adımlarını tamamlayın. Değerlendirilen kanalı takip ettiğinizden emin olun. </li><li> Bir elektronik tabloda, sonuçların bir çizgi grafiği oluşturun. [Control] &#39;e basarak ve her sütunun üstündeki harfi tıklatarak veri içeren sütunları seçin. Ardından, çizgi grafiğini seçin: [Insert | Çizgi grafiği]. </li><li> Bu analizi mult için tekrarlayınÇoklu bağımsız deneyler boyunca granülleri zorlayın. </li></ol></li><li> Hat Tarama Analizi ile Kolokalizasyonu Değerlendirme - ImageJ Plugin <ol><li> RGB profil aracını ImageJ web sitesinden indirin ve yükleyin (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Doğru takıldığında, kırmızı, yeşil ve mavi (RGB) çizgili simgeler araç çubuğunda görünmelidir. </li><li> ImageJ&#39;de görüntüyü ( örn. Tiff, JPG) açın: [File | Açık]. </li><li> ImageJ araç çubuğunda bulunan RGB simgesini tıklayın. </li><li> Bir SG aracılığıyla uzanan ve bitişik bölgeleri dahil etmeyi seçerek bir çizgi eklemek için tıklayın ve sürükleyin; Histogramın bir resmi bir pop-up pencerede görünür. </li><li> Verileri bir resim olarak kaydedin: [File | Farklı Kaydet | TIFF]. Alternatif olarak, verileri yukarıdaki 6.2.8 adımıyla başka bir grafik programında dışa aktarın ve grafiklerden çizin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+mRNA+translation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li>
<li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNP+granules%3A+Assembly%2C+function%2C+and+connections+with+disease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+ternary+complex+%28eIF2-GTP-tRNA%28i%29%28Met%29%29-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li>
<li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+and+cell+signaling%3A+more+than+just+a+passing+phase%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li>
<li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26(2015).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li>
<li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%2C+P-bodies+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li>
<li>Aulas, A., Van de Velde,, C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS%3A+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?</a> Front Cell Neurosci. 9, 423(2015).</li>
<li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li>
<li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+protein+aggregation+run+amuck%3A+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li>
<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li>
<li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li>
<li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib%2C+a+multikinase+inhibitor%2C+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12(2010).</li>
<li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li>
<li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors%3A+role+of+reoxygenation%2C+free+radicals%2C+and+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li>
<li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li>
<li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li>
<li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li>
<li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li>
<li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li>
<li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li>
<li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+%28RPM%29+applied+to+inert+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li>
<li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li>
<li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li>
<li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li>
<li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li>
<li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+binding+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li>
<li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+%28TDP-43%29+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li>
<li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li>
<li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation%2Fdissolution+to+mTORC1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Birden fazla hastalıkta immünhistolojik çalışmalarla kanıtlandığı üzere, kronik stres, farklı hücre içi odakların oluşumuna yol açar. Örneğin, çoğu nörodejeneratif hastalıklar, çözünmeyen proteinlerin hücre içi agregaları ile karakterizedir. Bu agregalarda SG ile ilişkili proteinlerin bulunması, bu tür odakların SG&#39;ler olduğu sonucuna varmak için temel oluşturur. Yeni stres uyarıları ile tedavi edilen hücrelerde SG belirteç pozitif sitoplazmik odağı gözlendiğinde de benzer bir sonuç çıkarılmıştır. Bu protokol, i...

Hücreler, strese tepki vermek için birçok mekanizma kullanmaktadır. Bazı tepkiler, transkripsiyon sonrası seviyede gerçekleşir ve mRNA translasyonunu ve / veya stabilitesini düzenleyen 1 , 2&#39;yi içerir . Stres modüle mRNA translasyonel durma ve bozulma, en sık karakterize Stress Granules (SGs) 3 , özel nonmembranöz hücresel odakların oluşumu ile ilişkilidir. SG&#39;ler, strese tepki veren translasyonel olarak tutuklanmış hücrelere ( örneğin, oksidasyon, ısı şoku, besin açlığı ve viral enfeksiyon) translasyon yapmayan mRNA&#39;ları konsantre eden sitoplazmik odaklardır 4 . Sıralanmamış mRNA&#39;lara ek olarak, SG&#39;ler translasyon başlatma faktörleri, RNA-bağlayıcı proteinler ve çeşitli sinyal proteinleri içerir 5 . SG&#39;ler, inhibe edilmiş protein translasyonu ve değiştirilmiş RNA metabolizmasının biyolojik belirteçleridir ve hücre sağkalımı ve apoptoz, sinyal yolağı ile ilişkilendirilmiştirS ve nükleer süreçler 5 . SG&#39;ler dinamik varlıklardır ve oluşumu hücresel çeviri durumu ile sıkı sıkıya bağlıdır 6 . Görünüşte sağlam görünmelerine rağmen, çoğu SG proteini bileşeni saniyede bir kalış süresi ile hızlı bir şekilde içeri ve dışarı götürülür. SG&#39;ler dakikalar ila saatler sürmesine rağmen, bileşenlerinin çoğu hızlı akış halindedir. Çeviri başlangıcının engellenmesi ve bunun sonucunda translasyon polisomlarının çözülmesi SG&#39;lerin oluşumunu teşvik eder; Dolayısıyla, SG&#39;ler polisomları tercüme etmekle dengelidir. Bu polisome / SG dengesi, iyi niyetli SG&#39;leri diğer stres kaynaklı odaklardan ayıran anahtartır 6 , 7 . Çevirinin başlatılmasının durdurulması, mRNA, çeviri başlatma faktörleri (eIF) ve 40S ribozomal altbirimleri (ler) i içeren, çeviri-yetkili ön başlatma komplekslerinin dönüşümünü gerektirir<html> O-ismi 48S kompleksleri), SG&#39;ler 4 , 6&#39;ya kaynaşabilen translasyonel olarak durmuş komplekslere (48S * kompleksleri) dönüştürür. SG&#39;ler, 48S kompleks oluşumunun akış aşağısındaki iki farklı adımda translasyonel durma ile desteklenir: kapak bağlayıcı eIF4F kompleksinin işlevleriyle ( örneğin eIF4A altbirimini hedef alan) müdahale veya translasyon başlatma faktörü eIF2&#39;nin α altbiriminin fosforilasyonu, bunların biri tarafından aracılık edilir Veya dört eIF2 kinazın daha fazlasını içerir. Stabil 48S komplekslerinin ( yani, 40S ribozomal altbirimler ve seçilen translasyon başlatma faktörleri) varlığı SG 8 , 9&#39;un bir işaretidir. SG&#39;ler viral enfeksiyonlar, nörodejenerasyon, otoimmünite ve kanser gibi çeşitli patolojik durumlarla bağlantılı olmuştur 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Birkaç SG bileşeninin mutasyona uğramış formları , nöronların nöronal ölümde etkin rol oynayabilen hücre içi patolojik kapanımları sergilediği nörodejeneratif hastalıklarla ( örn. Amiyotropik lateral skleroz) ilişkilidir 13 . Bazı virüsler, SG oluşumunu engellemek ve viral replikasyonu artırmak için SG bileşenlerini kaçırır 14 . Son çalışmalar aynı zamanda SG&#39;leri kansere 15 ve kanserli hücre sağkalımına kemo- ve radyoterapi tedavileri 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 bağlar. Bu bulgular SG biyolojisine büyük ilgiyi uyandırırken, yayınlanan raporların birçoğu, iyi niyetli SG&#39;lerin oluşumunu diğer stres kaynaklı odaklardan ayırmak için önemli kontrollerden yoksundur. SG&#39;ler başlangıçta, T-hücresi ntra-hücresel antijen 1 (TIA-1) ve Poli-A-bağlayıcı Protein (PABP) de dahil olmak üzere seçilen mRNA-bağlayıcı Proteinler (RBP&#39;ler) oluşan doku dışı sitoplazmik odak olarak tanımlandı; Çeviri başlatma faktörleri; Poliadenile mRNA; Ve küçük ribozomal altbirimler 4 , 6 , 21 , 22 . Geleneksel olarak, bileşimleri immün boyama ve floresan etiketli proteinlerin ektopik ekspresyonu 23 , 24 gibi tekniklerle belirlenmiştir. Son derece dinamik doğalarından dolayı, SG proteinleri ve / veya mRNA&#39;ların immüno-yerelleştirilmesi , SG&#39;leri 23 , 24 tespit etmek için tanımlayıcı metodoloji olmaya devam etmektedir. Bugüne kadar, birçok RBP ve diğer proteinler (120&#39;den fazla farklı protein) SG bileşenleri 11 olarak tanımlanmaktadır. Birçok SG lokalize proteinler, hem strese bağlı hem de bağımsız bir şekilde lokalizasyonlarını değiştirir ve diğer hücre içi bölmelerde ve odaklarda birikebilir, doğru SG belirteçlerini seçmek ve SG&#39;leri diğer stres kaynaklı streslerden ayırmak için işlevsel kriterleri kullanmak önemlidir odak. İyi niyetli SG&#39;ler mRNA, çeviri başlatma faktörleri ve küçük ribozomal altbirimleri içerir ve translasyonla dinamik denge içindedir. Bu basit iş akışı, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olup olmadığını belirlemek için tasarlanmıştır. Bu iş akışı, SG&#39;leri incelemek için yaygın olarak kullanılan hücreler olan U2OS hücrelerini kullanan birkaç deneysel yaklaşımı içerir. Bu hücreler, büyük bir sitoplazmaya sahip oldukları için nispeten düz oldukları için idealdirler ve cam lamellerine kuvvetle bağlanırlar. SG&#39;leri incelemek için başka hücre türleri de kullanılabilir, ancak zamanlama, ilaç konsantrasyonu ve SG-çekirdeklenme proteinlerinin bolluğu arasındaki farklılıkların kinetiği ve bileşimi değiştirebileceğinin farkında olmak önemlidirsition. Ek olarak, bazı hücreler, bazı SG markerlerinin noktasal lokalizasyonuna neden olan kabarık bir görünüm veren hücre yüzeyindeki blebleri oluşturarak paraformaldehit fiksasyonuna tepki verir; Dikkatli bir analiz yapılmaksızın bunlar SG olarak yanlış sınıflandırılabilir. Bu, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olarak tanımlanması için gerekli tüm ölçütlerin değerlendirilmesinin gerekliliğini vurgulamaktadır. SG 20&#39;yi teşvik eden bir kanser terapisi olan Vinorelbin (VRB) ve sağlam ve iyi karakterize edilmiş bir SG indüktörü olan Sodyum Arsenit (SA) bu protokoldeki deneyler için stres olarak kullanılır. Kanonik SG&#39;ler, sitoplazmik odaklarda kolokalize olan çoklu SG işaretçileri (hem proteinler hem de mRNA&#39;lar) içerir. Bu protokol sırasıyla protein markerlerinin ve poliadenile mRNA 22&#39;nin lokalizasyonunu saptamak için hem immünofloresans hem de floresan yerinde hibridizasyon (FISH) kullanır. Kısaca, dolaylı immünofloresan antikorları ( yani,e. Birincil antikorlar) belirli bir proteine ​​özeldir. Daha sonra, florokromlara bağlanan ikincil antikorlar (genellikle türe özgü) birincil antikoru tanır ve hedef protein lokalizasyonunu ortaya çıkarır. Floresan mikroskopi, hücre içindeki lokalize sinyali saptamak için kullanılır. Farklı türlerde üretilen antikorların kullanılması ve bunları farklı renkte sekonder antikorlar ile bulgulanması, çoklu antikorların kolokalizasyo- nunu saptamayı sağlar ve protein hedeflerinin aynı yerde bulunduğu- nu gösterir 23 . İyi niyetli SG&#39;lerde yerelleştirilmek üzere doğrulanmış belirteçleri seçmek önemlidir. BALIK, belirli bir RNA veya DNA sekansı 25 ile baz çiftleşen etiketli bir prob kullanır. MRNA&#39;yı tespit etmek için, bu protokol, mRNA&#39;nın poliA kuyruğuna melezleşen (veya baz çiftleri) biyotinlenmiş bir oligo (dT) 40 probu kullanır ( yani, poliA FISH). Streptavidin, biyotin için yüksek bir afiniteye sahip olduğu için, biyotinlenmiş prob, flüoresanla konjüge edilmiş streptavidin kullanılarak tespit edilir. SG&#39;leri değerlendirirken, iyi niyetli SG&#39;lerde olduğu gibi poliA FISH ile bir immünofloresansın bir SG işaretleyicisi tespit etmesi önemlidir, iki sinyal de aynı yerde bulunur. Bu protokolü kullanarak, kolokalizasyonu birden fazla yolla değerlendirilir. Çok kanallı ( yani RGB: kırmızı, yeşil ve mavi) görüntüde, kolokalizasyon, örtüşen sinyalin rengini değiştirecektir ( örn., Birleştirilmiş kırmızı ve yeşil sarı görünür) 23 . Ek olarak, kolokalizasyon, çizgi tarama analizi kullanılarak grafiksel olarak nicelenir ve burada her bir renk yoğunluğu verilen bir çizgi 8 , 20&#39;de ölçülür. Bu protokol, ImageJ 26 kullanan iki satır tarama analiz yöntemlerini tanımlamaktadır. Bir prosedür elle yapılmış ve tüm süreç boyunca devam etmektedir.Le, diğeri makroyu veya manuel adımları otomatikleştiren basit bir programı kullanır. Makro prosedürü anlamak için manuel programı incelemek önemlidir. SG&#39;ler, translasyonun bastırıldığı hücrelerde oluşur; Bu nedenle, SG&#39;li hücreler, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla azalmış küresel translasyon seviyeleri göstermelidir. Deneysel olarak ribopuromisilasyon kullanılır. Puromisin, fiksasyondan önce kısa bir süre boyunca hücrelere eklenir ve puromisin aktif olarak şekillenen polipeptidlere dahil olur ve böylece sonlanma 27 , 28 olur . Yeniden başlatmayı önlemek için emetine uygulanması gerekir 29 . Puromisin daha sonra anti-puromisin antikoru kullanılarak tespit edilebilmekte ve aktif translasyonun anlık görüntüsü verilmektedir. Bu yöntem hızlı olduğu için, belirli bir amino asitten yoksun (ve potansiyel olarak hücreleri ön gerilimine sokan) bir besiyeri ile öncesi aç bırakmayı gerektirmeyen veProtein translasyonunun subselüler lokalizasyonu. SG&#39;leri içeren hücrelerin komşu hücrelere 31 kıyasla çok daha düşük translasyon sergilediğini göstermek için &quot;tıklama-it&quot; kimyası 30 ile birleştirilmiş metionin analog L-azidohomoalain (AHA) gibi tadil edilmiş amino asit analoglarını kullanan diğer yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu teknik metionin açlığın- dan sonra 15-30 dakika süreyle nabız etiketlemesi gerektirir. Metilin açlığı ilave bir stres oluştururken, uzun etiketleme zamanı ( yani 15-30 dakika), devam etmekte olan tercümenin kümülatif olarak ölçülmesine ve aynı zamanda yeni sentezlenmiş proteinlerin sentez alanlarından son hedeflerine hücre. Buna karşılık, ribopuromisilasyon çok daha hızlıdır ve glikoz açlığı ile SG&#39;leri indüklemek için kullanılan glikozsuz ortam gibi herhangi bir ortamla uyumludur. Kanonik SG&#39;ler dinamik dengedeAktif olarak polisomları çevirirken. Bu deneysel olarak polisomları stabilize eden veya bozucu ilaçlarla örneklerle tedavi ederek değerlendirilebilir, böylece SG&#39;ler ile polisomlar arasındaki dengeyi de yükseltir 23 . Sikloheksimid (veya benzer şekilde davranan emetin) ribozomları mRNA üzerine &quot;dondurarak&quot; uzamayı engeller, böylece SG&#39;leri oluşturabilen mevcut polisomal olmayan mRNP&#39;lerin havuzunu düşürür. Deneysel olarak, bu iki şekilde kullanılabilir: SG oluşumunu önlemek için stres öncesi sikloheksimid (veya emetin) ekleyerek veya SG&#39;ler oluştuktan sonra sikloheksimit (veya emetin) ekleyerek, gerilme maddesini çıkarmadan, SG&#39;nin bozulmasına neden olan durmuş gibi Preinitiasyon kompleksleri yavaş yavaş polisom fraksiyonuna kabul edilir. Buna karşılık, puromisin, prematüre terminasyona neden olur ve polisome ayrışmasını teşvik eder ve SG&#39;lere montaj yapabilen başlatıcı mRNA&#39;ların havuzunu arttırır. Deneysel olarak, puromisin tedavisi, SG sayısını arttırır veya thresholü düşürürD olarak derecelendirilmiş stres veya ilaç dozajına tepki olarak form verdiklerini göstermektedir. Puromisin&#39;in etkisini değerlendirirken, puromisin&#39;in ilacın etkisini arttırması ve SG&#39;leri gösteren hücrelerin yüzdesini arttırması beklendiğinden ilâçın maksimal bir alt seviyesinin kullanılması önemlidir; ilaç görülmezse bu gerçekleşemez / Stres başlangıçta hücrelerin% 100&#39;ünde SG oluşturur. Bu, SG&#39;leri parçalara ayıran ve hücrelerin ~% 95&#39;inde başlangıçta SG&#39;leri görüntülediğinde, mümkün olan en büyük düşüşün gözlenebileceği ve doğru şekilde nicelleştirilebileceği siklooksit tedavisi ile çelişir. Bu protokol memelilerdeki SG&#39;leri incelemek için bir çerçeve sağlar. Yöntemler şunları içerir: (1) varsayılan SG&#39;lerdeki klasik SG ile ilişkili belirteçler eIF4G, eIF3b ve Ras GTPaz aktive edici protein bağlama proteini 1 (G3BP1) arasındaki kolokalizasyonu değerlendirmek için immünofloresan boyama ve ImageJ analizi; (2) oligo (dT) floresan in situ hibridizasyon (polyA FISH) poliadenile mRNA tespit etmek için; (3) stres kaynaklı odakların polisomlarla dinamik denge içerisinde olup olmadığını belirlemek için sikloheksid ve puromisin tedavisi; Ve (4) varsayılan SG&#39;leri içeren hücrelerin translasyonel durumunu değerlendirmek için ribopuromisilasyon. Birlikte, bu tahliller, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olarak sınıflandırılabileceğini belirleyebilir.

<table><tbody><tr><td>U-2 İşletim Sistemi ATCC</td><td></td><td>ATCC & kayıt; HTB-96 ve ticaret;</td><td>Yaygın olarak yazılan "U2OS" 37 &° C'de kültür; %5 altında CO2 %10 FBS/DMEM</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4.5 g/L glikoz, piruvat ve fenol içerir kırmızı %10 FBS, 10 mM HEPES ve penisilin/steptomisin ile desteklenmiştir Önceki ilaç(lar)ın seyreltilmesini önceden ısıtın</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td><td>Ortam HEPES'i desteklemek için kullanılır</td></tr> (<tr><td>1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>Ortam</td></tr><tr><td>penisilin, streptomisin</td> takviyesi için kullanılır <td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>Ortamı desteklemek için kullanılır</td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>laboratuvar dokuları (kimwipes)</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme Kapak Camları için Kapak Camı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>Kullanmadan önce otoklavlanmış Doku kültürü başlığında steril tutun</td></tr><tr><td>Sodyum (meta)arsenit & ge; % 90 (SA)</td> <td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>Suda 1 M konsantrasyona kadar çözün, ardından 100 & mikroya seyreltin; Çalışma stoğu olarak M</td></tr><tr><td>Vinorelbine (VRB)</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td><td>Suda 10 mM'ye çözün</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>Translasyon seviyesini değerlendirmek için kullanılır (ribopuromisilasyon) -Aktif translasyon ile SG bağlantısını değerlendirmek için kullanılır Suda 10 mg / mL'ye seyreltin</td></tr><tr><td>Emetin dihidroklorür hidrat</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>Genel çeviri seviyesini değerlendirmek için puromisin ile kombinasyon halinde kullanılır Aktif çeviri ile SG bağlantısını değerlendirmek için kullanılır -Su içinde 10 mg / mL'ye seyreltin</td></tr><tr><td>Sikloheksimid (CHX)</td> <td>Sigma</td><td>C4859</td><td>Aktif çeviri ile SG bağlantısını değerlendirmek için kullanılır Su içinde 10 mg / mL'ye</td></tr><tr><td>seyreltin Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td> <td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>İmmünofloresan</td></tr> <tr><td>için yıkama tamponuParaformaldehit reaktif sınıfı, kristal (PFA)</td> <td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Çeker ocakta sıcak PBS'de% 4'lük bir çözelti yapın, eriyene kadar karıştırın Alikotlar -20 ° C'de saklanabilir; Birkaç ay boyunca C Tehlikeli, havalandırma kullanın Özel atık</td></tr><tr><td>Metanol, ACS</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>-20 °C'ye kadar prechill; Kullanmadan önce C Özel atıklara atın</td></tr><tr><td>Normal At Serumu (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td><td>PBS içinde %5'e seyreltin 4 °C'de saklamak için sodyum azid ekleyin; C İmmünofloresan için engelleme çözeltisi</td></tr><tr><td>Etanol, Saf, 200 Kanıt (% 100), USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>Su ile% 70'e seyreltin</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları Fisherbrand</td><td></td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>fare anti G3BP1 antikoru (TT-Y)</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>4 & derecede saklayın; C 1/100 seyreltme</td></tr><tr><td>tavşan anti eIF4G antikoru (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>4 &°C'de saklayın; C 1/250 seyreltme</td></tr><tr><td>keçi anti eIF3 & eta; (N-20) antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&eta; ayrıca eIF3b olarak da bilinir 4 &°C'de saklayın; C 1/250 seyreltme</td></tr><tr><td>fare anti puromisin 12D10 antikoru</td><td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>4 derecede saklayın; C 1/1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Üretici başına suda sulandırın s talimatları daha sonra 4 &° C'de saklayın; C 1/250 seyreltme</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Tavşan IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>Üreticiye göre suda sulandırın s talimatları daha sonra 4 derecede saklayın; C 1/2.500 seyreltme</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Eşek Anti-Keçi IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>Üreticiye göre suda sulandırın s talimatları daha sonra 4 derecede saklayın; C 1/250 seyreltme</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>İkincil antikorlarla inkübe edin Stok çözeltisi 0.5 mg / mL dH20'da , ışıktan koruyun -4 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson İmmünoresearch</td><td>016-160-084</td><td>Üretici başına suda sulandırın s talimatları, ardından 4 &° C'de saklayın; C 1/250 seyreltme</td></tr><tr><td>oligo- (dT) 40x prob biyotinillenmiş</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td> <td>/</td> <td>Suda 100 ng / mL'ye kadar sulandırın, alikot ve -20 ° C'de saklayın; C Kullanmadan önce 1/50 oranında hibridasyon tamponunda seyreltin Özel sipariş</td></tr><tr><td>hibridasyon kutusu</td> <td>/</td><td>/</td> <td>Altına nemlendirilmiş kağıt ekleyerek herhangi bir saklama sürgü kutusuyla bir nem odası yapın - kutuyu önceden ısıtın önceki kullanım</td></tr><tr><td>20x SSC tamponu</td><td>Thermo fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>RNase Serbest su kullanarak 2x SSC'ye seyreltin (DEPC ile işlenmiş) RT 'da saklayın BALIK</td></tr> <tr><td>için yıkama tamponuPerfectHybPlus Hibridizasyon Tamponu</td><td>Sigma</td><td>H7033-50ml</td> FISH slayt montaj ortamı <td>için blok ve prob inkübasyon tamponu</td></tr><tr><td></td><td>ev yapımı</td> <td>/</td> <td>Karışım 5 g " soğukta çözünür" 20 mL PBS içinde poli (vinil alkol) sonikasyon ile karıştırın, ardından RT 'de O / N karıştırın 5 mL gliserol ve 0.2 mL %20 sodyum azid ekleyin ve RT 'da 16 saat karıştırın 20 dakika boyunca 20.000 g'da santrifüjleme, büyük pelet Aliquot viskoz sıvıyı atın, -20 ° C'de uzun süreli depolama; C, 1 hafta 4 & derece; C</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td> <td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Poli (vinil alkol)</td> <td>Sigma</td><td>P-8136-250G</td><td>Vinol yapmak için reaktif</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G5516-100ML</td> Vinol sodyum azit <td>yapmak için reaktif</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002-5G</td><td>Çözeltiyi bloke etmek için koruyucu madde ve vinol Suda% 20 seyreltme yapın</td></tr></tbody></table>

sitoplazmik odakları memeli stres granülleri olarak sınıflandırma yöntemleri

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Hücrelere genellikle ani çevresel değişikliklerle meydan okunur. Stres koşullarına maruz kalan hücrelerde oluşan stres granülleri (SG), hücre içi metabolizma ve sağkalımın çeşitli yönleriyle ilişkilendirilir. SG&#39;ler, hücresel sinyal yollarını, transkripsiyon sonrası gen ifadesini ve stres tepki programlarını modüle eder. Bu mRNA içeren granüllerin oluşumu doğrudan hücresel translasyona bağlıdır. SG birleşimi, inhibe edilen translasyon başlatma tarafından tetiklenir ve SG ayrılması, translasyon aktivasyonu veya inhibe edilmiş translasyon uzamayla desteklenir. Bu ilişki SG kompozisyonu ile daha da vurgulanır. Çekirdek SG bileşenleri, başlatma öncesi kompleksler, mRNA ve seçilen RNA bağlayıcı Proteinler (RBP&#39;ler) durdu. SG montajının amacı, translasyonel olarak duran oda temizleme mRNA&#39;larını saptayarak hücresel enerjiyi muhafaza etmek ve strese duyarlı proteinlerin geliştirilmiş translasyonuna izin vermektir. Additi&#39;deDurgun çeviri preinitiation kompleksleri gibi temel bileşenlere, SG&#39;ler diğer proteinlerin ve sinyal moleküllerinin bolluğunu içerir. SG oluşumundaki bozukluklar hücresel stres uyarlamasını bozabilir ve böylece hücre ölümünü hızlandırabilir. SG&#39;ler ve benzeri RNA içeren granüller nörodejeneratif bozukluklar ve kanser dahil bir dizi insan hastalığına bağlıdır ve son zamanlarda RNA granül alt tiplerinin sınıflandırılmasına ve tanımlanmasına ilgi uyandırmaktadır. Bu protokol, memeli SG&#39;leri karakterize etmek ve ölçmek için yapılan tahlilleri açıklamaktadır.

Stres kaynaklı odaklanma alanları mutlaka SG değildir. SG&#39;ler, mRNA&#39;lar, translasyon başlatma faktörleri ve RNA-bağlayıcı proteinleri içeren sitoplazmik odaklar olarak sınıflandırılır ve aktif translasyon ile denge halindedir. Yukarıdaki protokol, belirli bir stresin iyi niyetli SG&#39;ler oluşturup oluşturmadığını karakterize etmek için bir kalıp olarak kullanılabilir. SG&#39;ler, hem proteinleri hem de mRNA&...

Stres Granülleri (SG), çeşitli streslere maruz kalan hücrelerde oluşan doku dışı yapısal sitoplazmik yapılardır. SG&#39;ler mRNA&#39;lar, RNA-bağlayıcı proteinler, küçük ribozomal altbirimler, translasyona bağlı faktörler ve çeşitli hücre sinyal proteinlerini içerir. Bu protokol, iyi niyetli SG&#39;leri tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanan bir iş akışını tanımlamaktadır.

Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Bu iş akışının genel amacı, sitoplazma içinde tanımlanan odakların, hücre fizyolojisinde önemli roller oynayan RNA granülleri olan gerçek stres granülleri olup olmadığını belirlemektir. Bu iş akışının temel avantajı, stres granüllerinin tüm temel özelliklerini test etmesidir. Bu iş akışı insan osteosarkom U-2 OS hücreleri için sunulmuş olsa da, diğer hücre hattı türlerine ve primer hücrelere de uygulanabilir.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, stresle indüklenen tüm odakların stres granülleri olmaması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. İş akışımız, bunları ayırt etmek için gerekli olan tüm deneyleri kapsamaktadır. Bu prosedürü Anais Aulus ile birlikte uygulamalı olarak göstereceğim.Paul Anderson ve Pavel Ivanov'un laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyız. Başlamak için, hücreleri metin protokolünde açıklandığı şekilde 24 kuyucuklu plakalara yerleştirilmiş lamel camlar üzerine ekleyin. Gece boyunca süren inkübasyonun ardından, 24 kuyucuklu plakanın B1'den B4'e ve C1'den C4'e kadar olan kuyucuklarındaki kültür ortamını aspire edin.B1 ve B2 kuyucuklarına 100 µM sodyum arsenit eklenmiş besiyerinden 500 µL, ardından B3 ve B4 kuyucuklarına 50 µM sodyum arsenit eklenmiş besiyerinden 500 µL ekleyin. Sonrasında, C1 ve C2 kuyucuklarına 150 µM vinorelbin içeren besiyerinden 500 µL ekleyin. Son olarak, C3 ve C4 kuyucuklarına 125 µM vinorelbin eklenmiş besiyerinden 500 µL ekleyin. Plakayı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, ikinci sütundaki hücrelere 1 mg/mL sikloheksimid çözeltisinden 5 µL ve dördüncü sütundaki hücrelere 1,25 mg/mL puromisin çözeltisinden 2 µL ekleyin. Çözeltileri karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın ve plakayı inkübatöre geri koyarak 30 dakika daha inkübe edin.Hücreleri tespit etmek için, kuyucuklardaki medyumu uzaklaştırın ve hücreleri yaklaşık 250 microliters PBS ile yıkayın. Hücreleri tespit etmek için, lamelin üst kısmının tamamen kaplandığından emin olarak yaklaşık 250 microliters tamponlanmış %4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin. Ardından, plakayı oda sıcaklığında bir sarsıntılı platform üzerinde 15 dakika bekletin.Ardından, paraformaldehiti uzaklaştırın ve uygun şekilde atın. Hücreleri permeabilize etmek ve düzleştirmek için yaklaşık 250 µL buz soğukluğunda metanol ekleyin. Plakayı, bir sarsıcı üzerinde oda sıcaklığında beş dakika daha inkübe edin.Permeabilizasyon tamamlandığında, metanolü dökün ve oda sıcaklığında bir saat boyunca yaklaşık 250 microliter bloklama tamponu uygulayarak hücreleri bloklayın. Ardından, üç mililitre bloklama tamponuna G3BP1, eIF4G ve eIF3B antikorlarından 12 microliter ekleyerek primer antikor çözeltisini hazırlayın. 24 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 250 microliter antikor çözeltisi ekleyin.Plakayı oda sıcaklığında, bir sarsıcının üzerinde en az bir saat inkübe edin. Bir saatlik inkübasyonun ardından antikor solüsyonunu uzaklaştırın ve hücreleri yaklaşık 250 µL PBS ile beş dakika boyunca yıkayın. Ardından, sekonder antikor solüsyonunu hazırlamak için üç mL bloklama tamponuna 12 µL Anti-Mouse Cy2, Anti-Rabbit Cy3 ve Anti-Goat Cy5 antikorları ile birlikte üç µL hooks boyası ekleyin.Her kuyucuğa 250 µL sekonder antikor çözeltisi ekleyin ve örnekleri ışıktan korumak için plakayı kapatın. Plakayı oda sıcaklığında, bir sarsıcının üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, antikor çözeltisini uzaklaştırın ve hücreleri beş dakika boyunca PBS ile yıkayın.Viskoziteyi azaltmak için kapatma ortamını 37 °C'lik bir ısıtıcı blokta 10 dakika boyunca ısıtın. Ardından, önceden kesilmiş 200 µL'lik bir pipet ucu kullanarak, etiketlenmiş bir cam lam üzerine 25 µL kapatma ortamı yerleştirin. İnce uçlu pensle, lameli kuyucuktan lama aktarın ve üst kısmı, hücreler kapatma ortamına bakacak şekilde ters çevirin.Lamelleri aşağı bastırmak için temiz bir P200 uç kullanın. Tüm lameller yerleştirildikten sonra, bir laboratuvar mendilini lama sıkıca bastırarak fazla montaj ortamını temizleyin. Ardından, lamı suyla durulayın.Ardından hemen laboratuvar peçetesiyle tekrar kurulayın. Ön fiksasyonu yapılmış hücreleri, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 µL buz gibi soğuk metanol ile inkübe ederek permeabilize edin. Daha sonra, plakanın boşaltılmış kuyucuklarına yaklaşık 250 µL %70 etanol ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için plakayı parafilm ile kapatın.Plakayı dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından etanolü uzaklaştırın ve 500 µL 2XSSC ekleyerek hücreleri rehidre edin. Lamelleri oda sıcaklığında, bir sarsıcının üzerinde beş dakika boyunca inkübe edin.Ardından, çözeltiyi dökün ve bir kez daha 500 µL SSC ekleyin. Plakayı hafif ajitasyonla beş dakika daha inkübe edin. Sonrasında, bir hibridizasyon fırınının tabanına parafilm serin ve üzerine pipetle 25 µL hibridizasyon tamponu ekleyin.Laminat camı 24 kuyucuklu plakadan transfer ederek, hücrelerin hibridizasyon tamponuna bakacak şekilde üst kısmını ters çevirin. Laminat camları 42 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Hibridizasyon fırınındaki parafilm üzerine 25 µL biotin oligo dT çözeltisi pipetleyin.Ardından, bir pens yardımıyla lamelini kaldırın ve fazla hibridizasyon tamponunu temizlemek için kenarını bir laboratuvar peçetesine bastırın. Hücrelerin alta bakacak şekilde olduğundan emin olarak lameli biotin oligo dT çözeltisine aktarın ve 42 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Hibridizasyon tamamlandığında, 24 kuyucuklu plağın kuyucuklarına yaklaşık 500 µL önceden ısıtılmış 2XSSC ekleyin.Ardından, bir pens yardımıyla lamelli kuyuya aktarın ve 42 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri antikor çözeltisi ile daha fazla boyadıktan sonra, örnekleri bir floresan mikroskobu kullanarak inceleyin. Burada, G3BP1, eIF4G ve eIF3B stres granül belirteçleri ile boyanmış herhangi bir granül veya odak içermeyen, işlem görmemiş U-2 OS hücrelerinin görüntüleri sunulmuştur.Sodyum arsenit veya vinorelbin ile işlem görmüş U-2 OS hücrelerinde, G3BP1, eIF4G ve eIF3B içeren sitoplazmik odakların oluşumu tetiklenmiştir. Bu belirteçlerin ko-lokalizasyonu, her kanal için artırılmış büyütmede gerçekleştirilen çizgi tarama analizi ve ardından elde edilen grafiklerin üst üste bindirilmesi ile doğrulanmıştır. Ayrıca, işlem görmüş hücrelerde tanımlanan sitoplazmik odakların, poly A FISH ile gösterildiği üzere mRNA içerdiği saptanmıştır.Oligo dT sinyali G3BP1 sinyali ile aynı bölgede konumlanmış olup stres granüllerinin kimliğini doğrulamıştır. Uzmanlaşıldığında, bu iş akışının tamamı düzgün şekilde yürütüldüğü takdirde üç gün içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, immünofloresans ve floresan hibridizasyonun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Stres granüllerinin doğru karakterizasyonu ve tanımlanması için kritik olan adımlar. Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür uygulanırken, kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanımı ve yeterli havalandırma gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

methods-to-classify-cytoplasmic-foci-as-mammalian-stress-granules

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Vonaesch, P. ve ark., Memeli Hücrelerinin Bakteriyel Meydan Okumasından Sonra Stres Gralüleri Oluşumunun İmmünofloresan Analizi. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, epitel hücrelerinin patojenik bakteri Shigella flexneri ile enfekte edilmesini ve bunun sonucunda oluşan konak hücresel yanıtını göstermektedir. Bakteriyel efektör proteinler, konak translasyonunu bozarak stres granülleri adı verilen zarsız organellerin oluşumunu tetikler; bu organeller hücrenin enfeksiyona adaptif yanıtını...

Kanserli epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonu sırasında stres granülleri oluşumu

Bu video, mRNA'lar, RNA bağlayıcı proteinler (RBP'ler) ve diğer çeşitli proteinlerden oluşan memeli stres granüllerini karakterize etmek ve ölçmek için bir testi göstermektedir.

Memeli Stres Granüllerini Karakterize Etmek ve Ölçmek için Bir İmmünofloresan Testi

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Stres granüller (SGS) takılmıştır ribonükleoprotein parçacıklar (RNP) ve çeşitli gerilimlere, hücresel yanıt olarak önemli sitoplazmik RNA ihtiva eden granüller bulunmaktadır. SG-Dinamiği stresten sonra transfekte primer hücrelerde SGS etiketli bileşeninin lokalizasyonu görselleştirerek canlı hücrelerde takip edilebilir.

Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme

Bu protokolün amacı, mast hücresi salgısının fonksiyonel genomik analiz sağlayacak bir yöntem geliştirmektir. Protokol çıkar ve gerçek zamanlı gen ile cotrasfected bir flüoresan raportör geninin salınımının nicel değerlendirilmesine dayanır salgılama granülün en morfolojisinin analiz eder.

Mast Hücre Salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için

Sosyal amip Dictyostelium discoideum, yakın zamanda protein yanlış katlanması ve proteostazı incelemek için bir sistem olarak kurulmuştur. Burada, D. discoideum'da sıcaklığa bağlı protein agregasyonunu ve hücresel stres tepkisini incelemek için yeni bir görüntüleme tabanlı metodoloji açıklıyoruz.

Protein Kalite Kontrol Sistemi incelenmesi<em&gt; D. diskodeyum</em&gt; Sıcaklık kontrollü Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak

Hücrelere bakterilerle ve birkaç farklı stresle meydan okuduktan sonra, memeli hücrelerinde stres granülü oluşumunun nitel ve nicel analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, konakçı-bakteriyel etkileşimlerin geniş bir aralığında hücresel stres granül tepkisini araştırmak için uygulanabilir.

Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Burada, izole ve fare peritoneal mast hücreleri yetiştirmek için bir protokol mevcut. Biz de onların fonksiyonel karakterizasyonu için iki protokol tarif: hücre içi ücretsiz Ca2 + toplama ve degranulation tahlil floresan bir görüntüleme dayalı yayımlanan β-hexosaminidase Renkölçer miktar üzerinde.

Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca2 +-görüntüleme ve Degranulation deneyleri

Floresan mikroskopi görüntülerinde belirli hücre bölmelerinde hücresel cisimlerin hızlı araştırılması ve doğru analizi için oluşturulmuş serbestçe kullanılabilir bir iş akışı salıyoruz. Bu kullanıcı dostu iş akışı açık kaynak yazılım Icy üzerinde tasarlanmıştır ve aynı zamanda ImageJ işlevleri kullanır. Boru hattı görüntü analizi nde bilgi olmadan uygun fiyatlı.

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Bu çalışma, izole beyin mikrogliasında intranükleer akış sitometrisi kullanılarak küresel histon modifikasyonlarının ölçülmesi için bir protokolü açıklamaktadır. Çalışma ayrıca veri toplama için kullanılan mikroglia izolasyon protokolünü de içermektedir.

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini

Öğrenin, insan osteosarkom U-2 OS hücrelerinde stres granüllerini sitoplazmik odaklardan ayırt etmek için immünofloresan ve FISH yöntemlerini nasıl kullanacağınızı. Bu protokol, hücresel stres yanıtlarını incelemek için SG oluşumunu ve bileşimini doğru analiz etmenizi sağlar.

Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri

Daha fazla video keşfet