Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri

Bu iş akışının genel amacı, sitoplazma içinde tanımlanan odakların, hücre fizyolojisinde önemli roller oynayan RNA granülleri olan iyi niyetli stres granülleri olup olmadığını belirlemektir. Bu iş akışının ana avantajı, stres granüllerinin tüm temel özelliklerini test etmesidir. Bu iş akışı insan osteosarkomu U-2 OS hücreleri için sunulmuş olsa da, diğer hücre hatları ve birincil hücre tiplerine de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü strese bağlı tüm odaklar stres granülleri değildir. İş akışımız, onları ayırt etmek için gerekli tüm deneyleri içerir. Bu prosedürü Anais Aulus ile göstereceğim.

Paul Anderson ve Pavel Ivanov'un laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyız. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi 24 oyuklu plakaya yerleştirilmiş lameller üzerine tohum hücreleri. Gece boyunca inkübasyondan sonra, kültür ortamını 24 oyuklu plakanın B1'den B4'e ve C1'den C4'e kadar aspire edin.

B1 ve B2 kuyularına 100 mikromolar sodyum arsenit ile takviye edilmiş ortamdan 500 mikrolitre ekleyin, ardından B3 ve B4 kuyularına 50 mikromolar sodyum arsenit ile takviye edilmiş ortamdan 500 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, C1 ve C2 kuyularına 150 mikromolar vinorelbin içeren ortamdan 500 mikrolitre ekleyin. Son olarak, C3 ve C4 kuyularına 125 mikromolar vinorelbin ile takviye edilmiş 500 mikrolitre ortam ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, iki sütundaki hücrelere mililitre sikloheksimid çözeltisi başına bir miligram beş mikrolitre ve dördüncü sütundaki hücrelere, mililitre puromisin başına 1.25 miligram iki mikrolitre ekleyin. Çözeltileri karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın ve 30 dakikalık ek bir inkübasyon için plakayı inkübatöre geri koyun.

Hücreleri sabitlemek için, ortamı kuyulardan çıkarın ve hücreleri yaklaşık 250 mikrolitre PBS ile yıkayın. Hücreleri sabitlemek için yaklaşık 250 mikrolitre tamponlu %4'lük bir paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve lamel üst kısmının tamamen kaplandığından emin olun. Ardından, plakayı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir tezgah külbütörü üzerinde bırakın.

Ardından, paraformaldehiti çıkarın ve uygun şekilde atın. Hücreleri geçirgen hale getirmek ve düzleştirmek için yaklaşık 250 mikrolitre buz gibi soğuk metanol ekleyin. Plakayı bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında beş dakika daha inkübe edin.

Geçirgenlik tamamlandıktan sonra, metanolü atın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca yaklaşık 250 mikrolitre bir bloke edici tampon uygulayarak hücreleri bloke edin. Daha sonra, üç mililitre bloke edici tampona G3BP1, eIF4G ve eIF3B'ye karşı 12 mikrolitre antikor ekleyerek birincil antikor çözeltisini hazırlayın. 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 250 mikrolitre antikor çözeltisi ekleyin.

Plakayı oda sıcaklığında en az bir saat boyunca bir külbütör üzerinde inkübe edin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, antikor çözeltisini çıkarın ve hücreleri beş dakika boyunca yaklaşık 250 mikrolitre PBS ile yıkayın. Daha sonra, ikincil antikor çözeltisini hazırlamak için 12 mikrolitre Anti-Mouse Cy2, Anti-Rabbit Cy3 ve Anti-Goat Cy5 antikorlarını, üç mililitre bloke edici tampona üç mikrolitre kanca boyası ile birlikte ekleyin.

Her oyuğa 250 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve örnekleri ışıktan korumak için plakayı örtün. Plakayı bir saat boyunca oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, antikor çözeltisini çıkarın ve hücreleri beş dakika boyunca PBS ile yıkayın.

Viskoziteyi azaltmak için montaj ortamını 37 santigrat derece ısı bloğunda 10 dakika ısıtın. Ardından, önceden kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, 25 mikrolitre montaj ortamını etiketli bir cam slayt üzerine yerleştirin. İnce forsepslerle, lameli kuyudan slayta aktarın, üst kısmı hücreler montaj ortamına bakacak şekilde ters çevirin.

Lameli aşağı bastırmak için temiz bir P200 ucu kullanın. Tüm lameller monte edildikten sonra, bir laboratuvar mendilini sürgüye sıkıca bastırarak fazla montaj ortamını çıkarın. Daha sonra slaytı suyla yıkayın.

Ve hemen bir kez daha laboratuvar dokusuyla kurulayın. Önceden eklenmiş hücreleri, oda sıcaklığında 250 mikrolitre buz gibi metanol ile 10 dakika inkübe ederek geçirgen hale getirin. Daha sonra, plakanın boşaltılan kuyucuklarına yaklaşık 250 mikrolitre% 70 etanol ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için plakayı parafilm kullanarak kapatın.

Plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, etanolü çıkarın ve 500 mikrolitre 2XSSC ekleyerek hücreleri yeniden sulandırın. Lamelleri oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde beş dakika inkübe edin.

Ardından, çözeltiyi atın ve bir kez daha 500 mikrolitre SSC ekleyin. Hafif çalkalama ile plakayı beş dakika daha inkübe edin. Daha sonra, parafilmi bir hibridizasyon fırınının altına yerleştirin ve üzerine 25 mikrolitre bir hibridizasyon tamponu pipetleyin.

Lameli 24 oyuklu plakadan aktarın, hücreler hibridizasyon tamponuna bakacak şekilde üst kısmı ters çevirin. Lamelleri 42 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Hibridizasyon fırınındaki parafilm üzerine 25 mikrolitre biyotin oligo dT solüsyonu pipetleyin.

Ardından, forseps kullanarak, lamel alın ve fazla hibridizasyon tamponunu çıkarmak için kenarını bir laboratuvar dokusuna karşı kurulayın. Lameli biotin oligo dT çözeltisine aktarın, hücrelerin yüzü aşağı bakacak şekilde olduğundan emin olun ve 42 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Hibridizasyon tamamlandıktan sonra, 500 kuyulu çanağın kuyucuklarına yaklaşık 2 mikrolitre önceden ısıtılmış 2XSSC ekleyin.

Daha sonra, forseps kullanarak, lamel kuyuya aktarın ve 10 dakika boyunca 42 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri antikor çözeltisi ile daha fazla boyadıktan sonra, örnekleri bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Burada, stres granül belirteçleri G3BP1, eIF4G ve eIF3B ile boyanmış herhangi bir granül veya odak içermeyen işlenmemiş U-2 OS hücrelerinin görüntüleri sunulmaktadır.

Sodyum arsenit veya vinorelbin ile muamele edilen U-2 OS hücrelerinde, G3BP1, eIF4G ve eIF3B içeren sitoplazmik odakların oluşumu indüklenmiştir. Bu belirteçlerin birlikte lokalizasyonu, her kanal için artan büyütmede gerçekleştirilen çizgi tarama analizi ve ardından elde edilen grafiklerin süper montajı ile doğrulandı. Ek olarak, tedavi edilen hücrelerde tanımlanan sitoplazmik odaklar, poli A BALIK tarafından gösterildiği gibi mRNA içeriyordu.

Oligo dT sinyali, G3BP1 sinyali ile birlikte lokalize edilerek stres granüllerinin tanımlandığını doğrular. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm bu iş akışı düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse üç gün içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, immünofloresan ve floresan hibridizasyonun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Gerilim granüllerinin doğru karakterizasyonu ve tanımlanması için kritik olan adımlar. Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür gerçekleştirilirken KKD kullanımı ve yeterli havalandırma gibi önlemler her zaman kullanılmalıdır.