Name: Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin fare beyninden sinaptik bölmelerdeki proteinleri izole etmek için beyin membran fraksiyonasyon protokolünü. Bu yöntem sinaptik fonksiyonu ve protein dağılımını anlamak için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Ekonomi ve Sürdürülebilirlik Enstitüsü (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 ve PIE14 / 00034) tarafından desteklenen Institucio Catalana de Recerca Estudis Avançats (ICREA Academia-2010) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, X.M, VF-D ve FC, &quot;Nörofarmakoloji ve Ağrı&quot; akredite araştırma grubuna (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) aittir ve FC için Innovatie kapısı Wetenschap en Technologie (SBO-140028) . Bu çalışma aynı zamanda CAPES (Brezilya )&#39;dan FC&#39;ye &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot; tarafından da desteklendi

Tüm hayvanlara ait deneysel prosedürler, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Rehber 11 ve Avrupa Topluluğunun 86/609 / EEC sayılı kanunları uyarınca, Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi (CEEA) tarafından University of Barcelona tarafından onaylanmıştır. CCE, FELASA ve ARRIVE kuralları. Böylece, fareler gıda ve suya ad libitum erişimi olan standart kafeslerde barındırılır ve kontrollü standart koşullar altında tutulur (7:30 AM, 22 ° C sıcaklık ve% 66 nemden başlayan 12 saat karanlık / hafif döngü). 1. Kesintili Bir Şeker Gradyan Kullanarak Fare Beyin Synaptosomları Alınması Not: Bu yöntem daha önce 10 bildirildi. <ol><li> Yeni izolasyon tamponu (IB), pH 7.4 hazırlayın; 2 M sukroz; 1 M sukroz / 0.1 mM CaCI2; Ve 0.1 mM CaCI2 ( tablo 1&#39;e bakınız). Çözeltileri buzda soğutun. </li><li> SaServikal dislokasyonla beş fare çocuğunu öldürürler. Her bir hayvanın beynini kesip hızla çıkarın. İlgi alanındaki beyin bölgesini (örneğin, hipokampus, 0.25-0.35 g taze doku) parçalara ayırın ve 1 mL IB ile buz üzerinde 5 mL Potter-Elvehjem cam tübüne yerleştirin. </li><li> Dokuyu ısınmayı önlemek için homojenleştirici bir karıştırıcı (dakikada 700-900 devirde 10 vuruşla), tercihen bir buz banyosu içinde dokuyu homojenize edin. </li><li> Homojenize edilmiş dokuyu (1 mL) 6 mL 2 M sukroz ve 2.5 mL 0.1 mM CaCl 2 içeren 15 mL tüp içine yerleştirin. ° C. Tüpü ters çevirerek yavaş yavaş karıştırın. Not: Kalsiyum ilavesi, organeller arasındaki yapışkan etkileşimlerin korunması ve böylece farklı &quot;yoğunlukların&quot; yapısının korunması için gereklidir. </li><li> Çözeltiyi 12 mL&#39;lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve sakroz gradyanı oluşturmak için yavaş yavaş her tüpün üstüne 2,5 mL 1 M sükroz / 0,1 mM CaCl2 ekleyin. Not: Konum etiketleme oKalıcı bir işaretleyici kullanarak santrifüj tüpündeki eğim arabirimi. </li><li> Santrifüj tüplerini IB çözeltisi ile karşılık gelen çelik destekler ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin. </li><li> Tüpleri, 100.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 3 saat boyunca santrifüjleyin. Rotoru tüm çelik desteklerle (gerekirse boş olsa) doldurun. </li><li> Miyelin içeren üst tabakayı atın. Bir Pasteur pipetiyle, synaptosome fraksiyonuna tekabül eden 1.25-M ve 1-M sakroz ara fazları arasındaki beyaz halkayı toplayın. </li><li> Bir santrifüj tüpünde IB kullanarak sinaptozomları 9X hacim ile seyreltin. </li><li> Santrifüj tüplerini IB çözeltisi ile karşılık gelen çelik destekler ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin. </li><li> Tamburları, 15.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı atın ve tekrar süspansiyon haline getirin.1.1 mL İB çözeltisi ile pellet. Bu sinaptozomal çözeltiden 100 uL toplayın ve 11,000 x g ve 4 ° C&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. </li><li> Sinaptosomal pelleti% 5 sodyum dodesil sülfat (SDS) içinde tekrar süspanse edin ve bu numuneyi -20 ºC&#39;de saklayın. Not: Bu numune daha fazla Western blot analizi için toplam synaptosome fraksiyonuna tekabül edecektir. Geriye kalan sinaptozom fraksiyonu (~ 1 mL) ya kullanılıncaya kadar -20 ºC&#39;de dondurulabilir veya daha sonraki sübsimaptik fraksiyonasyon için işlenebilir. Sinaptozomlar veya saflaştırılmış sinapslar, toplam hipokampal hacimde% 1 ila% 2&#39;yi temsil eder. </li></ol> 2. Pre-, Post- ve Ekstrasinaptik-izolasyon <ol><li> 2x taze çözündürme tamponu, pH 6.0; 1x çözündürme tamponu, pH 6.0; Çözünürlük tamponu, pH 8.0; Ve 0.1 mM CaCI2 ( tablo 1&#39;e bakınız). Çözeltileri buzda soğutun. Not: Bu solüsyonların pH değeri doğru olmalıdırİyi bir subsynaptik fraksiyonlamayı elde etmek için ayarlanır. </li><li> 1 mL&#39;lik yeniden askıya alınan sinaptosom fraksiyonunu yavaş yavaş seyreltin (adım 1.12&#39;ye bakın), 5 mL, 0.1 mM CaCl2 ile seyreltin. </li><li> Aynı hacimde (5 mL) buzda soğutulmuş 2x çözünürlük tamponu (pH 6.0) ilave edin ve buz üzerinde bir kapta yüksek çalkalama altında buz üzerinde 50 dakika inkübe edin. Not: pH 6.0&#39;da Triton X-100&#39;in% 1&#39;i tüm plazma membran proteinlerini çözünürken, sinaptik kontaklar veya kavşaklar ( örn . Pre ve postsinaptik yapılar) içindeki proteinleri korur. </li><li> Solüsyonu bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpleri, eşdeğer hacimde 0.1 mM CaCl2 ve 2x çözünürlük tamponu çözeltisi (pH 6.0) ile karşılık gelen çelik destekler içinde ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin. </li><li> Tüpleri, 40.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Nihai süpernatan, ekstrasinaptik fraksiyonu temsil eder,Ve pelet sinaptik kavşaklara ( yani pre ve postsinaptik fraksiyonlara) karşılık gelir. </li><li> Ekstrasinaptik fraksiyonu içeren süpernatanı, 4,000 xg ve 4 ° C&#39;de santrifüje tabi tutulan bir 15 mL 10K filtre tüpü kullanarak nihai 200 μL hacme konsantre edin. </li><li> Elde edilen konsantre ekstrasinaptik fraksiyonu (200 μL), 5 hacim (1 mL) önceden soğutulmuş (-20 ° C) aseton ile -20 ° C&#39;de bir gece boyunca çöktürün. </li><li> Ertesi gün, extrasinaptik fraksiyonu 18,000 x g ve -15 ° C&#39;de 30 dakika santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, aseton süpernatantını atın ve herhangi bir aseton izini kaldırmak için peleti kurutun. </li><li> Son olarak,% 5 SDS 200 mcL ile ekstrasinaptik protein içeren pelletini tekrar süspanse edin. Gerekirse peleti son haline getirin. </li><li> Bunu bozmadan, pre ve postsinaptik fraksiyonları içeren pelleti 2 mL 1x çözünürlük tamponu, pH 6.0 ile dikkatlice yıkayın. Tamponu atın. </li><li> süspanse edinPellet, bir cam Pasteur pipet kullanılarak 10 mL 1x çözünürlük tamponu, pH 8.0 ile karıştırılır. Not: pH 8.0&#39;da Triton X-100&#39;in% 1&#39;i presinaptik uzmanlaşmayı çözünürken, çözünmeyen postsinaptik yoğunluğu 4 korur. </li><li> Süspansiyonu buz üzerinde bir kabın içindeki yüksek çalkalamayla 50 dakika inkübe edin. </li><li> Solüsyonu bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpleri, karşılık gelen çelik destekler içine ve kapatma kapaklarına 1x çözünürlük tamponu çözeltisi, pH 8.0 ile tartın ve dengeye getirin. </li><li> Tüpleri, 40.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin; Elde edilen süpernatant presinaptik fraksiyona ve pelletin postsinaptik fraksiyona karşılık gelir. </li><li> Adımlar 2.6-2.9&#39;da tarif edildiği gibi, presinaptik fraksiyonu içeren süpernatanın işlemden geçirilmesi. </li><li> 200 μL% 5 SDS ile postsinaptik fraksiyon içeren pelleti tekrar süspanse edin. Peleti sonlandır, iF gerekli. </li></ol> 3. Membran fraksiyonlamasını doğrulamak için numuneleri immunoblot ile analiz edin <ol><li> Her bir fraksiyondaki protein miktarını ( yani toplam, ekstra, ön, ve son sinaptik fraksiyonlar), biyinkoninik asit protein testini kullanarak belirleyin. </li><li> Her bir fraksiyondan 20 μg protein alın ve SDS-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) numune tamponu içerisinde 50 μL&#39;lik nihai bir hacme kadar seyreltin. 100 ºC&#39;de 5 dakika kaynatın. </li><li> Proteinleri SDS-PAGE elektroforezi% 10 ile, indirgeyici koşullar altında% 4 konsantre jel ile ayırın. Elektrofor, 80 V&#39;luk sabit gerilimle boyanın alt jöse girene kadar voltajını 120 V&#39;a çıkarın. </li><li> Proteinleri bir PVDF zarına aktarın ve sürekli dalgalanma altında oda sıcaklığında 45 dakika için IB engelleme çözeltisiyle bloke edin. </li><li> Memeyi, belirtilen primer antikor ile gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin ( örn. Anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-sinaptofizin veya anti-GPR37) ile seyreltildi. </li><li> Bağlanmamış birincil antikoru ortadan kaldırmak için membran yıkama çözeltisi ile üç kez (her biri 10 dakika) yıkanır. </li><li> Karışık koşullar altında oda sıcaklığında sürekli çalkalama altında belirtilen ikincil antikor ile inkübe edin. </li><li> Bağlanmamış sekonder antikor ortadan kaldırmak için membran yıkama çözeltisi ile üç kez (her biri 10 dakika) yıkanır. </li><li> Membranı kimyasal parlak substratla inkübe edin (karanlık koşullar altında ve üretici tarafından sağlanan A ve B oranının 1: 1&#39;ini takiben karışımı hazırlayın). </li><li> Membranı bir kemilüminesan algılama cihazında analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="https://archive.org/details/textbookofphysio1897fost">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).</li>
<li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+fine+structure+of+the+nervous+system%22">The fine structure of the nervous system</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22357909">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li>
<li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presynaptic+particle+web%3A+ultrastructure%2C+composition%2C+dissolution%2C+and+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li>
<li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li>
<li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+adenosine+A%281%29+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li>
<li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li>
<li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1%2C+P2X2%2F3%2C+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1%2C+P2Y2%2C+and%2For+P2Y4+Receptors+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li>
<li>Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits%3A+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li>
<li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+parkinson%27s+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus%3A+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li>
<li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+Report%3A+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li>
<li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%25+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart%3A+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li>
<li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li>
<li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li>
<li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li>
<li>Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li>
<li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li>
<li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pael+receptor%2C+endoplasmic+reticulum+stress%2C+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9(2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada sunulan protokol, herhangi bir beyin bölgesindeki spesifik proteinlerin subsinaptik dağılımının incelenmesi için güçlü bir biyokimyasal araç oluşturur. Bununla birlikte, tekniğin doğasında bulunan ve burada vurgulanmayı hak eden bazı dezavantajlar vardır. Örneğin, ana sınırlamalardan biri, tüm subsinaptik fraksiyonların immünoblot analizini gerçekleştirmek için makul miktarda proteini saflaştırmak için gereken nispeten büyük miktarda dokudur. Bu sorun, sinapsların (yani sinaptozomların) toplam hipokampal ...

Sinaptik yayın, sinapsın fiziksel bütünlüğüne, Foster ve Sherrington&#39;ın 1897&#39;de erken öngördüğü bir kavrama dayanır. Bu nedenle, hem normal hem de patolojik koşullardaki sinaptik fonksiyonu aydınlatmak için temel sinir iletim bileşenlerini ( örn. Iyon kanalı, reseptör vb. ) Dağılımını anlamak önemlidir. Elektron mikroskobu (EM), prototipik merkezi sinir sistemi (CNS) sinapslarının mevcut ultrastrüktürel görüşüne muazzam katkılarda bulunmuştur. Öyle ki, EM, oldukça düzgün bir mesafeden (~ 25 nm) 2 bir yarık ile ayrılan pre-ve postsinaptik yoğunluklar arasındaki farkları ince bir şekilde belirledi. İlginç olarak, postsinaptik aparat, plazma membranının altında, postsinaptik yoğunluk veya PSD 2 olarak adlandırılan nispeten sürekli, elektron-yoğun bir kalınlaşma sergilemektedir. Tersine, presinaptik cihazda,E süreksiz sitomatrix ağı, sinaptik veziküllerin plazma membran aktif bölgesine 3 hizalanması ve docklanması için gerekli plazma membranının hemen altında düzenlenmiştir. Bu nedenle, EM, yapısal olarak korunmuş SSS sinapsları içindeki protein dağılımını araştırmak için altın deneysel yaklaşımı oluşturmaktadır. Bununla birlikte, elektron mikrografları tarafından sağlanan bilgiler statiktir. Gerçekten de, biriken kanıtlar in vivo sinapsların son derece dinamik olduğunu ve böylece sürekli sinaptik bulaşmada dramatik yapısal değişikliklerin yaşandığını göstermektedir. Buna ek olarak, sinapsların morfolojisi ve bileşimi, farklı CNS bölgelerinde ve gelişim, olgunlaşma, yaşlanma ve nöropatolojik koşulların gelişimi üzerine değişebilir. Genel olarak, fizyolojik koşullarda farklı sinaptik bölmelere ait proteinlerin izole edilmesine odaklanan bir protokol, sinaptik işleyişin daha kapsamlı bir çalışması için değerli bir araçtır. <p cLass = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada, farklı sinaptik membran bölmelerinin, yani ekstra, ön ve postsinaptik zar alanlarının hazırlayıcı biyokimyasal zenginleşmesine izin veren, bu tür tamamlayıcı deneysel yaklaşımı açıklıyoruz. Bu membran fraksiyonasyon yöntemi, önce Philips ve ark . (2001) 4 , pre ve postsinaptik aparat içinde oluşan yapışkan etkileşimleri zayıflatan bir pH kaymasına dayalıdır. İlk olarak, pH 6.0&#39;da hafif deterjanlar kullanarak, pre ve postsinaptik aparatı tutan ve çözünürleştirilen ve böylelikle sinaptik kontaklardan ekstraksiyona tabi tutulabilen ekstrasinaptik membran alanından muhafaza edilen adherens kavşağını ayırt etmek mümkündür. Daha sonra, yumuşak deterjanlar varlığında pH&#39;ı 6.0&#39;dan 8.0&#39;a yükseltmek, presynaptik aktif bölgeyi postsinaptik yoğunluğa sıkıca bağlayan adherens bileşkesinin mukavemetini zayıflatır. Bu nedenle, presinaptik bölme öyleYağlanmış ve çoğunlukla korunan postsinaptik yoğunluktan ayrılabilir, çünkü kullanılan deterjan konsantrasyonu çözünürlüğünü arttırmaz 4 . İlginç bir şekilde, fraksiyonasyon etkinliği, sonunda% 90&#39;dan daha yüksek olarak, farklı alt sinaptik belirteçler tarafından teyit edilebilir: i ) presinaptik aktif bölgeden sinaptozomal bağlantılı protein 25 (SNAP-25); Ii ) synaptophysin, extrasinaptik fraksiyondan ( yani, aktif bölge dışındadır ve mikrozomlar dahil); Ve iii ) postsinaptik yoğunluğa göre postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD-95). Özellikle, bu beyin zar fraksiyonasyon yöntemi başarıyla kullanılmıştır. Buna göre, alfa-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolpropionik asit (AMPA) reseptörleri 5 , adenosin A 1 reseptörü (A 1 R) 6 gibi farklı reseptörlerin alt sinaptik lokalizasyonunu kesin olarak saptamak mümkün olmuştur ,Adenosin A 2A reseptörü (A 2A R) 7 , adenosin trifosfat (ATP) P2 reseptörleri 8 , nikotinik asetilkolin reseptör altbirimleri 9 ve Parkinson hastalığına bağlı reseptör GPR37 10&#39;dur . Bununla birlikte, birtakım sınırlamalar, belirli bir nöronal proteinin sinaptik dağılımının doğru bir şekilde değerlendirilmesini engelleyebilir. Dolayısıyla, bu prosedürde, tüm protokolü tam olarak tanımlamakla kalmamakla birlikte, oldukça fazla miktarda doku, düşük protein verimliliği ve verimliliğin doğrulanması için zorunlu gereksinim gibi dikkate alınması gereken bazı kritik noktaları vurguluyoruz Kesin ayrımı yapmadan önce her ayrım.

<table><tbody><tr><td>Sükroz</td><td>Pankreac Qu&iacute; mica SL, Barselona, İspanya</td><td>1,316,211,211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Pancreac Qu&iacute; mika SL, Barselona, İspanya</td><td>2,112,211,210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Pankreas Qu&iacute; mica SL, Barselona, İspanya</td><td>1,313,961,210</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör kokteyl Set III</td><td>Millipore, Darmstadt, Almanya</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, ABD</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mika SL, Barselona, İspanya</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, ABD</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, ABD</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, ABD</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Mavi</td><td>Pankreac Qu&iacute; mica SL, Barselona, İspanya</td><td>1,311,651,604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, ABD</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, ABD</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız kuru süt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barselona, İspanya</td><td>1,216,591,211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barselona, İspanya</td><td>1,314,941,210</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO<>sub4</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barselona, İspanya</td><td>1,316,781,211</td><td></td></tr><tr><td>Temel 20 pH</td><td>Crison, Alella, İspanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Uyarlanabilir Homojenizatör</td><td>VWR, Radnor, PA, ABD.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Şeffaf Tüpler (14x89mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td>344059</td><td>Ultrasantrifüj nedeniyle çökmeyi önlemek için tüpler kullanıldığında neredeyse tamamen doldurulmalıdır.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Santrifüj filtreler Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Almanya</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5430R</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barselona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Görüntüleyici 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Barselona, İspanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Cam Pastör Pippetes 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, ABD</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Kompakt Balans EK-610</td><td>A& D, Tokyo, Japonya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce ve ticaret; BCA Protein Test Kiti</td><td>Pierce Biyoteknoloji, Rockford, IL, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal batı pico kemilüminesan substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GR 200 Hassas Terazi</td><td>A& D, Tokyo, Japonya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Francisco Ciruela Laboratuvarı'nda üretilen ve doğrulanan ev yapımı antikor anti-GPR37.</td><td></td><td>0.250 & mu'luk bir nihai konsantrasyonda kullanılan birincil antikorlar; g / mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-sinaptofizin</td><td>Abcam, Cambridge, Birleşik Krallık</td><td></td><td>1: 10.000</td></tr><tr><td>HRP konjuge keçi anti-fare IgG Thermo</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD'de</td> seyreltilmiş birincil antikorlar.<td></td><td>İkincil antikor seyreltilmiş 1: 10.000</td></tr><tr><td>HRP konjuge keçi anti-tavşan IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD.</td><td></td><td>İkincil antikor 1:30.000 seyreltilmiş</td></tr></tbody></table>

beyin membranı fraksiyonu: bir<emex vivo</em&gt; subsınaptik protein lokalizasyonunu değerlendirmede yaklaşım

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Sinaptik protein kompozisyonunun ve fonksiyonunun değerlendirilmesi sinirbiliminde önemli bir zorluk oluşturmaktadır. Bununla birlikte, sinapslarda oluşan sinir iletimini değerlendirmek kolay değildir çünkü dinamik protein-protein etkileşimleri ve fosforilasyon olayları tarafından yüksek derecede düzenlenir. Buna göre, sinaptik bulaşmayı incelemek için herhangi bir yöntem kullanıldığında, bu geçici fizyolojik değişiklikleri korumak temel hedeftir. Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz. Başka bir deyişle, protokol, presinaptik, postsinaptik ve extrasinaptik bölmelerden protein zenginleştirmesini gerçekleştirmek için bir biyokimyasal metodoloji açıklamaktadır. Birincisi, sinaptozomlar veya sinaptik terminaller, kesintili bir sükroz gradyeni aracılığıyla tüm sinaptik bölmeleri içeren sinir hücrelerinden elde edilir. Not, bu başlangıç ​​sinaptik zar hazırlığının kalitesi critical. Ardından farklı subynaptik bölmelerin izolasyonu, diferansiyel pH koşullarında hafif deterjanlar kullanılarak hafif çözünürlükle elde edilir. Bu gradyan ve izopiklik santrifüjlerle ayrılmaya izin verir. Son olarak, farklı subjunaptik bölmelerdeki protein zenginleştirmesi ( yani, öncesi, sonrası ve ekstrasinaptik membran fraksiyonları), iyi karakterize edilmiş sinaptik protein işaretleyicileri ( örn., SNAP-25, PSD-95 ve sinaptofizin) kullanılarak imünoblot analizi ile doğrulanır Sırasıyla), böylece belirli bir nöronal proteininin sinaptik dağılımının doğrudan değerlendirilmesini sağlar.

Tanımlanan metodoloji genel olarak sinirsel proteinlerin alt sinaptik analizi için ve özellikle sinaptik reseptörlerin 5 , 6 , 7 , 8 , 9 izolasyonu ve biyokimyasal olarak karakterize edilmesi için büyük ölçüde kullanılmaktadır. İlginçtir, burada gösterilen temsili sonuç, yetim bir G proteinine bağlı reseptörün, yani Parkinson ...

Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Bu prosedürün genel amacı, fare beyninden farklı sinaptik kompartmanlara ait proteinleri izole etmektir. Kinetik iletim bileşenlerinin dağılımının tanımlanması, hem normal hem de patolojik koşullarda sinaptik fonksiyonun anlaşılması için gereklidir. Biriken kanıtlar, in vivo sinapsların son derece dinamik olduğunu ve sinaptik iletimi sürdüren dramatik yapısal değişiklikler geçirebildiğini göstermektedir.Sinapslar klasik olarak elektron mikroskobu aracılığıyla çalışılmıştır. Bu membran fraksiyona yöntemi, farklı pH koşulları altında hafif deterjanlar kullanılarak yapılan lazer silinmesinin ardından saniyelik santrifüjasyon kombinasyonuna dayanmaktadır. Kısaca, fare beyni çıkarılır ve hipokampus bölgesi, kırık buz üzerine yerleştirilmiş soğuk bir kap içerisinde dikkatlice diseke edilir.Hippocampuslar, buz gibi soğuk izolasyon tamponu içeren bir Potter-Elvehjem cam tüpüne toplanır. Ardından, toplanan doku bir homogenizatör karıştırıcı kullanılarak homojenize edilir. Daha sonra homojenize edilen doku, bir sükroz kalsiyum çözeltisi ile karıştırılır.Ardından doku ekstraktının üzerine konsantre bir sükroz kalsiyum çözeltisi eklenir. Örnekler daha sonra santrifüj edilir. Sinaptozomları içe

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

, Memeli hücrelerinin mikroskop lamelleri yerinde Subselüler fraksiyonasyon protein localisation görselleştirme sağlar .

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Bu işlem yetişkin fare beyin mitokondri ilişkili ER membranlar veya MAM ve MAM ve mitokondriyal hazırlıkları glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain fraksiyonları izole etmek için nasıl göstermektedir.

Mitokondri ilişkili ER Membranlar (MAM) ve Glycosphingolipid zenginleştirilmiştir Microdomains (GEM&#39;lerle): Fare Beyin izolasyon

Nöronal membran kaçakçılığı dinamik plazma membran proteini kullanılabilirliği ve önemli ölçüde etkiler sinir iletimini kontrol eder. Bugüne kadar, yetişkin nöronlar nöronal endositik ticaretini ölçmek için zor olmuştur. Burada, akut beyin dilimleri yüzey protein ifade ex vivo hızlı değişiklikleri ölçmek için son derece etkili, nicel bir yöntem açıklanmaktadır.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Bu makalede, bir sükroz gradyanı üzerinde süreksiz bir ultra-santrifüj ile sinaptik plazma membranı ile bağlantılı proteinlerin zenginleştirme göstermektedir. Post-sinaptik yoğunluk proteinlerin takip eden hazırlama de tarif edilmektedir. Protein preparatları western blotting ya da 2 boyutlu DIGE analiz için uygundur.

Süreksiz Sukroz Degrade&#39;yi kullanma Sinaptik Plazma Membran ve postsinaptik Yoğunluk Proteinlerin Hazırlanması

Sinaptik plastisiteyi ve hafızayı kontrol eden moleküllerin ve yolakların tanımlanması, sinirbilimde hala büyük bir zorluktur. Burada, işitsel bir öğrenme paradigmasında öğrenme ve hafıza konsolidasyonu sırasında sinapsların moleküler yeniden düzenlenmesinde rol oynadığı varsayılan sinaptik proteinlerin göreceli nicelleştirilmesini ele alan bir iş akışı açıklanmaktadır.

İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

Sinaptik vezikül endositoz sinaptik vezikül protein ile erimiş pHluorin ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu vezikül Alım tarafından algılanır.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

Elektrokonvulsif nöbet (ECS) Elektrokonvulsif terapi şiddetli depresyon için bir deneysel hayvan modeldir. ECS synaptogenesis ve sinaptik plastisite yol hipokampüs, faaliyet genel olarak uyarır. Burada, ECS indüksiyon Sıçanlarda nöbet kaynaklı sinaptik protein değişimler incelemek için kendi hippocampi hücre altı ayırma yöntemleri açıklanmaktadır.

Elektrokonvulsif nöbetler fareler ve onların Hippocampi ayırma nöbet kaynaklı değişiklikleri postsinaptik yoğunluğu proteinlerde incelemek için

Burada, plazma zarı Derneği düzeyinin kantitatif analiz için periferik ilişkili protein fluorescently öğesini gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi membran Hesaplamalı ayrışma ve plazma zarı floresan marker ile etiketli hücrelerdeki gözlenen sinyal sitoplazmik bileşeni dayanmaktadır.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

Burada, bir sinaptik protein ayirt boyama kullanarak işaret protein, confocal mikroskobu ve bilgisayar tabanlı analiz göre dağılımını belirlemek için nicel bir yaklaşım açıklar.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

Bu protokol, apex2 etiketli membran proteininin en iyi korunmuş hücre ultrayapısı içinde iletim elektron mikroskobu ile lokalize edilebildiği kriyoAPEX yöntemini açıklar.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Bu protokol, fare beyninden son derece saf sinaptozomlar, sinaptik veziküller ve diğer sinaptik fraksiyonları elde etmek için sağlam ve ayrıntılı bir yöntem sunar. Bu yöntem, protein lokalizasyonunun ve fonksiyonunun kompartmanlı çözünürlükle biyokimyasal analizi de dahil olmak üzere sinaptik süreçlerin değerlendirilmesini sağlar.

Sinaptik Bileşenlerin Murin Beyinden İzolasyonu için Hücre Altı Fraksiyonasyonu

Öğrenin fare beyninden sinaptik bölmelerdeki proteinleri izole etmek için beyin membran fraksiyonasyon protokolünü. Bu yöntem sinaptik fonksiyonu ve protein dağılımını anlamak için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir

Daha fazla video keşfet