Flaş-ve-Freeze: Elektron Mikroskobu ile Membran Dinamikler Yakalama Yeni Bir Tekniği

Bu prosedürün genel amacı, optogenetik kullanılarak nöronal aktivitenin indüklenmesini takiben elektron mikroskobu ile zar dinamiklerini yakalamak ve ardından stimülasyondan sonra hücreleri tanımlanmış zaman noktalarında dondurmaktır. Bu yöntem, sinirbilim ve hücre biyolojisindeki sinaptik vezikül geri dönüşümünün mekanizmaları ve belki de çok hızlı bir zaman ölçeğinde modelleme hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, elektron mikroskobu kullanarak bir hücre içindeki morfolojik değişiklikleri milisaniye zaman ölçeğinde görselleştirebilmesidir.

Prosedür, bir yüksek lisans öğrencisi olan Shuo Li ve bir araştırma görevlisi olan Sumana Raychaudhuri tarafından gösterilecektir. Her ikisi de laboratuvarımdan. Fiksatifi hazırlamadan önce, iki mililitrelik kriyojenik dosyayı numune numaralarına göre bir kalemle etiketleyin.

Daha sonra tüm fiksatif reaktifleri birleştirin ve her bir şişeye bir mililitre fiksatif hacim ayırın. Tüpleri kapattıktan sonra, sabitleyicileri hemen sıvı nitrojene batırın ve şişeleri kapalı bir strafor kutuda saklayın. Ardından, otomatik bir serbest ikame ünitesini ve yüksek basınçlı dondurucuyu sıvı nitrojenle doldurun.

Daha sonra serbest ikame ünitesinin numune odasına küçük bir aseton kabı yerleştirin ve ikame ünitesinin sıcaklığı eksi 90 santigrat dereceye ulaşana kadar bekleyin. Işık stimülasyon protokolünü programlamak için, dokunmatik ekranlı monitörün ışık stimülasyonu penceresinde düzenle'ye tıklayın. Başka bir pencere açılacaktır.

Karanlık faz için 15 saniye girin. Dönem için 100 milisaniye. Nabız için 10 milisaniye ve tek bir 10 milisaniyelik uyaran için periyot sayısı için bir milisaniye.

Ana ekranda, ışık stimülasyon kutusunun işaretli olduğunu onaylayın ve numune saklamaya ve ardından düzenlemeye tıklayın. Yeni pencerede, her kanalda iki numune saklamak için iki seçmek için artı veya eksi düğmesini kullanın ve depolama sıvısı nitrojeninin etkin seçildiğini onaylayın. Şimdi bir stereo mikroskop altında, ortadaki siyah bir plakanın kuyusuna bir safir disk hücresi tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.

Ardından 100 mikronluk bir ara parça halkası gelir. Boş bir safir diskin bir tarafını önceden ısıtılmış tuzlu su çözeltisine batırın ve diski tuzlu tarafı aşağı bakacak şekilde ara halkanın üzerine yerleştirin. Başka bir 100 mikron ara halkası yerleştirin.

Ve son safir diskin üstünde 400 mikronluk bir ara halka ve fazla sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdı kullanın. Numuneleri tutarken safir diskler arasında herhangi bir hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun. Ardından tüm tertibatı iki şeffaf yarım silindir arasına yerleştirin ve dondurma işlemini başlatmak için üst kırmızı kapağı kapatın.

Dondurma işlemi tamamlandığında kırmızı kapak otomatik olarak tekrar açılacaktır. Tüm numuneler donduğunda, saklama dewarının kapısını açın ve dewar'ı tezgah üstüne aktarın. Numune haznesini saklama haznesinden sıvı nitrojenle doldurulmuş özel bir numune tepsisine aktarın.

Ve numune kabını serbest bırakmak için düğmenin kilidini açın. Ardından, şeffaf yarım silindirleri numune kabından çıkarmak için sıvı nitrojen soğutmalı uçlara sahip bir cımbız kullanın. Ve ortadaki siyah plakaları dikkatlice sıvı nitrojen içeren küçük bir kaba aktarın.

Dondurulmuş numuneleri her zaman sıvı nitrojen altında tutmaya ve numuneleri her zaman önceden soğutulmuş cımbızla tutmaya özen gösterin. Cımbızları tekrar önceden soğutun ve ilk orta plakayı hızlı bir şekilde önceden soğutulmuş asetona aktarın. Safir diski plakadan ayırmak için plakayı hafifçe sallayın ve hafifçe vurun.

Ardından, ikame ünitesindeki bir numune odasına açık bir kriyojenik fiksatif dosyası yerleştirin. Safir diski şişeye aktarın. Ve hemen şişeyi kapatın.

Tüm örnekler aktarıldığında, uygun serbest ikame programı parametrelerini ayarlayın ve programı başlatın. Ücretsiz ikame programının sonunda, kriyojenik dosyaları numune odasından kimyasal bir davlumbaza aktarmak için eldiven kullanın ve her şişeye oda sıcaklığında aseton eklemek için bir pipet kullanın. Her şişedeki yıkamayı bir ila iki saatlik bir süre içinde dört ila altı kez taze asetonla değiştirin.

Daha sonra, 120 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında iki ila üç saatlik bir inkübasyon için her bir şişeye taze hazırlanmış% 30 epoksi reçine ekleyin. İnkübasyonun sonunda, orbital çalkalayıcı üzerinde üç ila dört saatlik bir inkübasyon için %30 epoksi reçineyi %70 epoksi reçine ile değiştirin. Daha sonra, her bir diski hücre tarafı yukarı bakacak şekilde bir gömme kapsülünün kapağına aktarmak için cımbız kullanın ve dört santigrat derecede bir gece inkübasyon için disklere% 90 epoksi reçine ekleyin.

Ertesi sabah, her bir safir diski yeni bir gömme kapsülünün kapağına aktarın ve kapağı taze hazırlanmış% 100 epoksi reçine ile doldurun. Son %100 epoksi reçine inkübasyonundan sonra, numuneleri 48 saat boyunca 60 derecelik bir fırında polimerize edin. Numuneler polimerize olduğunda, safir disk reçine bloğunun üst kısmına yerleştirilecek şekilde ilk numuneyi stereo mikroskobun üzerine baş aşağı yerleştirin ve numunenin üstünden ince bir reçine tabakası çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın.

Ardından, safir diski epoksi reçineden ayırmak için diskin kenarı boyunca sığ bir çizgi kesmek için tıraş bıçağını kullanın. Diski reçinenin geri kalanından ayırmak için diski yaklaşık 10 saniye sıvı nitrojene batırın. Reçineyi diseksiyon mikroskobu altında aktarın ve numuneyi mikroskop aşamasına bantlayın.

Dört ila 10X büyütme kullanarak, hücrelerin olduğu bir alan bulun ve ilgilenilen alanın etrafında ikiye iki milimetrelik bir alanı kesmek için çift kenarlı bir tıraş bıçağı kullanın. Daha sonra hücreleri epoksi reçineden yapılmış silindirik bir kukla blok üzerine monte etmek için süper yapıştırıcı kullanın ve bloğu bir saat boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin. Ultra mikro bir cilt üzerinde kesitlere ayrıldıktan sonra, numuneleri 930.000X büyütmede görüntüleme için bir transmisyon elektron mikroskobuna aktarın.

Bu görüntüde, bir fare hipokampal nöronundaki presinaptik zarın aktif bölgesi içinde ışık başlangıcından 15 milisaniye sonra kaydedilen ekzositoz yoluyla sinaptik vezikül füzyonu gösterilmektedir. Işık başlangıcından 100 milisaniye sonra, aktif bölgeye bitişik bir endositotik çukur gözlemlenebilir, bu da sinir hücresi tarafından ultra hızlı endositozu gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, numunelerin flaş ve dondurma deneyleri ile nasıl işleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Unutmayın, glutaraldehit, osmiyum tetroksit ve sıvı nitrojen ile çalışmak gerçekten tehlikeli olabilir ve bu nedenle koruyucu giysi giydiğinizden emin olun. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedürlerin dondurma kısmı 12 numune için birkaç saat içinde yapılabilir, ancak görüntüleme ve görüntü analizi de dahil olmak üzere prosedürlerin geri kalanı günler veya haftalar hatta aylar sürebilir ve bu nedenle gerçekten uzun bir prosedür olabilir. Proteinleri lokalize ederseniz veya dinamiklerini görselleştirirseniz, sedefli proteinlerden antijenikliği veya sedeflenmeyi korumak için farklı protokoller kullanabilir ve bu teknikleri kullanarak dinamiklerini görselleştirebilirsiniz.