Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Bu protokolün genel amacı, kardiyovasküler dokularda glikosilasyon bölgelerinin tanımlanması ve glikan formlarının bileşimsel karakterizasyonu dahil olmak üzere hücre dışı matriks protein bileşimini analiz etmektir. Bu yöntem, yapısal bir matris glikoztlasyonunun kardiyovasküler hastalık sırasında doku fibrozunu nasıl etkilediği gibi doku fibrozu sürecindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, genel glikozilasyon değişikliklerini analiz eden önceki protokollerin aksine, yapısal bir matris proteinlerinin belirli bölgelerinde glikozilasyonun karakterizasyonuna izin vermesi ve daha hedefli takip mekanistik çalışmaları için bir araç sağlamasıdır.

Prosedürleri laboratuvarımızdan Dr.Marika Fava ve Bayan Ferheen Baig gösterecek. Bu yordama başlamak için, tüm ayıklama arabelleklerini metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Daha sonra, 20 ila 50 miligram dokuyu yaklaşık iki milimetre boyutunda üç veya dört küçük parçaya ayırmak için bir neşter kullanın.

Doğranmış dokuyu 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin. Kan kontaminasyonunu en aza indirmek için her yıkama için 500 mikrolitre PBS kullanarak dokuyu beş kez yıkayın. Yıkanmış numuneleri vidalı kapaklı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve doku ağırlığının 10 katı kadar bir sodyum klorür tamponu hacmi ekleyin.

Oda sıcaklığında bir saat boyunca minimum hızda girdap. Daha sonra, ekstraktı yeni santrifüj tüplerine aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüjleyin. Elde edilen doku peletlerini taze sodyum klorür tamponu ile kısaca yıkayın.

Bundan sonra, doku ağırlığının 10 katı bir SDS tamponu hacmi ekleyin ve oda sıcaklığında 16 saat boyunca minimum hızda girdap yapın. Ekstraktı yeni santrifüj tüplerine aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüjleyin. Elde edilen peletleri çift damıtılmış suyla yıkayın.

Doku ağırlığının beş katı bir guanidin hidroklorür tamponu hacmi ekleyin ve oda sıcaklığında 72 saat boyunca maksimum hızda girdap yapın. Elde edilen ekstraktı yeni tüplere aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüjleyin. Proteinin miktarı belirlendikten sonra, glikozilasyon bölgesi doluluğunun değerlendirilmesi için her numune için yeni bir tüpe 10 mikrogram ve doğrudan glikopeptit analizi için ayrı bir tüpe 50 mikrogram alikot edin.

Her birine 10 kat daha fazla etanol ekleyin ve gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüjleyin. Çökelen peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı aspire edin.

Ardından, peletleri oda sıcaklığında 15 dakika kurutmak için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. Her numuneye 10 mikrolitre hazırlanmış deglikozilasyon tamponu ekleyin. Numune tüplerini 50 mililitrelik konik bir tüpün içine koyun ve 25 santigrat derecede iki saat boyunca 45 derecelik bir açıyla inkübe edin.

Bundan sonra, sıcaklığı 37 santigrat dereceye yükseltin ve hafif çalkalama ile 36 saat inkübe edin. Bir dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüjledikten sonra, suyu buharlaştırmak için oda sıcaklığında 45 dakika boyunca bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. Kurutulmuş numuneleri mililitre başına 50 birim içeren 10 mikrolitre O-18 etiketli su ile yeniden süspanse edin PNGase F.Sürekli çalkalama altında 37 santigrat derecede 36 saat inkübe edin, ardından tüm numuneler için çözelti içi tripsin sindirimi yapın ve C-18 temizliğine devam edin.

Başlamak için, reçineyi aktive etmek için C-18 döndürme plakasının her bir oyuğuna 200 mikrolitre metanol ekleyin. Bir dakika boyunca 1.000 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra her bir kuyucuğa suya 200 mikrolitre% 80 ACN ve% 0.1 TFA ekleyin ve bir dakika boyunca 1.000 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra, her kuyucuğa suda% 1 ACN ve% 0.1 TFA içeren bir çözeltinin 200 mikrolitresini ekleyin ve 1.000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Bundan sonra, numuneleri döndürme plakasının kuyucuklarına yükleyin ve bir dakika boyunca 1500 kez G'de santrifüjleyin. Akışı yeniden yükleyin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.

Daha sonra her bir kuyucuğa su içinde% 1 ACN ve% 0.1 TFA içeren 200 mikrolitre çözelti ekleyin ve bir dakika boyunca 1500 kez G'de santrifüjleyin. Bu çözeltinin eklenmesini ve santrifüjlemeyi iki kez tekrarlayın. Daha sonra, her bir kuyucuğa su içinde% 50 ACN ve% 0.1 TFA içeren 170 mikrolitre çözelti ekleyin ve bir dakika boyunca 1500 kez G'de santrifüjleyin.

Bu eklemeyi ve santrifüjlemeyi bir kez daha tekrarlayın. Kombine elute'u oda sıcaklığında iki saat kurutmak için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. Kurutulmuş numuneleri kullanıma hazır olana kadar 80 santigrat derecede saklayın.

Bundan sonra, glikozit doluluk değerlendirmesi için amaçlanan numuneler üzerinde sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi analizi yapın. Doğrudan glikopeptit analizine yönelik numuneler için, önce metin protokolünde belirtildiği gibi standart TMT sıfır etiketlemesi ile devam edin. Başlamak için, her 10 mikrolitre TMT sıfır etiketli numuneye 50 mikrolitre sağlanan bağlayıcı tampon ekleyin.

Daha sonra, 50 mikrolitre homojen gliko, reçine süspansiyonunu yeni 1.5 mililitrelik tüplere yakalar ve 2500 kez G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. 1200 RPM'de çalkalarken oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 2.000 kez G'de iki dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı yeni tüplere aktarın.

Bundan sonra, yıkama işlemine başlamak için karıştırmak üzere pipeti kullanarak her bir reçine tüpüne 150 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. 1200 RPM'de çalkalarken oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İki dakika boyunca 2500 kez G'de santrifüjledikten sonra, yıkamayı tamamlamak için her bir süpernatanı ilgili süpernatan depolama tüpüne aktarın.

Bu yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, 75 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve bir pipetle karıştırın. 1200 RPM'de çalkalarken oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

İki dakika boyunca 2500 kez G'de santrifüjleyin ve her süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Karıştırmak için bir pipet kullanarak 75 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve ardından numunelerin inkübasyonunu ve santrifüjlenmesini tekrarlayın. Her elutu ilgili tüpe aktarın.

Kombine elütu 2500 kez G'de iki dakika santrifüjledikten sonra, reçinenin tamamen çıkarılmasını sağlamak için her bir süpernatanı yeni tüpe aktarın. Bundan sonra, elute'u oda sıcaklığında iki saat kurutmak için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. Kurumuş glikopeptitleri çift damıtılmış suda 15 mikrolitre% 2 ACN ve% 05 TFA içinde yeniden süspanse edin.

Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi kütle spektrometresi analizi gerçekleştirin. Bu çalışmada, kardiyovasküler dokudan elde edilen ECM proteinleri, ECM bileşiminin sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi analizinin yanı sıra dolaylı ve doğrudan glikopeptid analizi için hazırlanmıştır. Temel strateji, sodyum klorür, SDS ve guanadin hidroklorür ile sıralı inkübasyonlara ve ardından dolaylı veya doğrudan glikopeptid analizine dayanmaktadır.

Ekstraksiyonun etkinliği, görselleştirme için gümüş lekeli bis-tris akrilamid jeller üzerinde izlenir. Çalıştırılan üç ekstrakttan, ECM glikoproteinlerinin çoğunluğu guanadin hidroklorür alikotlarında görülür. ECM glikoproteinleri, kısa ve çeşitli N ve O-bağlı oligosakkaritlerle birlikte büyük ve tekrarlayan glikozamin glikan zincirleri ile dekore edilmiştir.

Deglikosilasyonun etkinliği, glikozaminik glikanları sindiren enzimlerin ve daha küçük N ve O'ya bağlı oligosakkaritleri hedef alan enzimlerin eklenmesiyle görülür. Glikoproteinler daha sonra NXT veya NXS dizileri içinde oksijen 18 ile etiketlenmiş deamide edilmiş asparaginlerin varlığı ile tanımlanır. İki 11 pozisyonunda deamide edilmiş bir asparagin ile bir dekorin peptidi için temsili bir HCD tandem kütle spektrumu burada gösterilmiştir.

HCD ETD fragmantasyonu daha sonra glikoprotein ile zenginleştirilmiş ECM ekstraktını analiz etmek için kullanılır. ETD tandem kütle spektrumu, glikan bileşiminin karakterizasyonuna izin verir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık iki ila üç hafta sürmelidir.

Bu glikoproteomik, fibroz fonksiyonunun fizyolojik ve patolojisini keşfetmemize izin verir, sadece proteomikteki değişiklikler üzerinde değil, aynı zamanda düşünce şekerlerinin bileşimi üzerinde de bulunur. Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometresi ile protein glikozilasyonunda bir çalışma için numunelerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem kardiyovasküler hastalık hakkında bilgi verebilse de, solunum yolu hastalıkları veya kanser gibi hacim fibrozu olan diğer patolojilere de uygulanabilir.