Enteroendokrin Hücre Gut Hormon salgısını Çalışması ve Canlı Hücre Görüntüleme için Amaçlanan Kemirgen Küçük Bağırsak Karışık İlköğretim Kültürler

Bu yöntemin genel amacı, bağırsak peptit sekresyonunun ve enteroendokrin hücrelerin canlı hücre görüntülemesinin incelenmesini sağlamak için karışık murin bağırsak hücrelerini izole etmek ve kültürlemektir. Bu yöntemi başlangıçta enteroendokrin hücrelerin in vitro karakterizasyonunu sağlamak için geliştirdik. Enteroendokrin hücreler bağırsak içeriğini izler ve vücut homeostazını düzenler.

Ancak bağırsak epiteli boyunca dağılmış oldukları için incelenmesi zor olmuştur. Burada tarif edilen kalsis, enteroendokrin hücrelerin genetik floresan etiketlemesi ile birleştirildiğinde özellikle yararlıdır, çünkü bu, tek hücreli elektrofizyolojik ve canlı hücre görüntüleme tekniklerinin kullanılmasını sağlar. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızda bir ameliyat sonrası olan Cheryl Brighton olacak.

Başlamak için, izole edilmiş bir fare duodenumunu PBS ile doldurulmuş 10 santimetrelik bir petri kabına aktarın. Forseps kullanarak, bağırsak parçasının bir ucunu dikkatlice yakalayın ve bir pastör pipetinin ucunu lümenine sokun. Ardından bağırsak içeriğini soğutulmuş PBS ile durulayın.

İçeriğin çoğu çıkarılana kadar her iki bağırsak ucu için tekrarlayın. Durulanmış bağırsağı taze soğutulmuş PBS ile doldurulmuş temiz bir petri kabına aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, kas tabakasının çekilmesini önlerken, bağırsak fragmanından herhangi bir adipoze doku ve mezsentary'yi çıkarın.

Daha sonra, dokunun proksimal ucundaki kas tabakasının bir flebini tanımlayın. Daha sonra, iki set ince pazı kullanarak, bağırsağın etrafındaki tabakanın küçük bir miktarını nazikçe çekin. Bağırsağı ve mümkün olduğu kadar kas flebini kavrayın, ardından katmanları nazikçe ayırın ve kas tabakasını bağırsağın etrafından soymaya başlayın.

Kas tabakasının ve epitelin yırtılmasını önlemek için forsepsleri birbirine yakın tutun. Kas tabakasını bağırsak parçasının tüm uzunluğundan çıkarın. Daha sonra bağırsağı uzunlamasına keserek açın ve taze soğutulmuş PBS içeren temiz bir petri kabına aktarın.

Kalan çan veya mukustan yıkamak için dokuyu çalkalayın. Yıkandıktan sonra, yaklaşık bir ila iki milimetre karelik kareler elde etmek için dokuyu cerrahi bir neşter bıçağıyla kesin. Daha sonra, önceden kesilmiş bir uca sahip önceden ıslatılmış bir pastör pipeti kullanarak, elde edilen parçaları yaklaşık 20 mililitre soğutulmuş PBS ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Doku parçalarını ek olarak yıkamak için tüpü hafifçe sallayın ve doku tortusuna izin verin. Doku yerleştikten sonra, PBS'nin çoğunu aspire edin ve numuneyi bir kez daha taze PBS ile yıkayın. Bağırsağı sindirmek için, doku parçalarını soğutulmuş steril DMEM içeren steril 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın, süspansiyonu döndürün, dokunun yerleşmesine izin verin ve ardından ortamı çıkarın.

Doku parçalarına 7 mililitre sindirim ortamı ekleyin ve süspansiyonu döndürün. Süspansiyonu beş dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpü yaklaşık üç saniye boyunca hafifçe çalkalayın.

Sindirilmemiş dokuyu çökeltin ve sindirim ortamını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Yanlışlıkla toplanan herhangi bir dokunun yerleşmesine izin verin ve 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, sindirilmemiş dokuyu içeren 15 mililitrelik santrifüj tüpüne geri aktarın. Mikroskobik gözlem için sindirim ortamının küçük bir hacmini koruyun ve kalıntıları atın.

Süspansiyonun çok fazla kript içermediğinden emin olmak için sindirim ortamının içeriğini ışık mikroskobu altında izleyin. Daha sonra, 7 mililitre taze sindirim ortamı ekleyin ve sindirim prosedürünü bir kez daha gerçekleştirin. Kript parçası süspansiyonunu hazırlamak için, bağırsak parçalarına 7 mililitre taze sindirim ortamı ekleyin.

Dokuyu on dakika boyunca 37 santigrat derecede bir suda inkübe edin. Numuneyi bu sefer her beş dakikada bir daha uzun ve daha kuvvetli bir şekilde çalkalamak. Sindirilmemiş dokuyu çökeltin ve sindirim ortamını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Yanlışlıkla toplanan herhangi bir dokunun yerleşmesine izin verin ve 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, sindirilmemiş dokuyu içeren 50 mililitrelik santrifüj tüpüne geri aktarın. Bağırsak parçalarına 7 mililitre taze sindirim ortamı ekleyin ve bir sonraki sindirime başlayın. Daha sonra, önceki sindirimden toplanan ortamı oda sıcaklığında 100 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.

Supernatent'i attıktan sonra, hücre peletini önceden ısıtılmış kültür ortamının 5 mililitresinde nazikçe pipetleme ile yeniden süspanse edin. Ardından, numuneyi bir kenara koyun ve hücre süspansiyonunun küçük bir alikotunu toplayın. Işık mikroskobu altında, numunenin izole edilmiş kript parçaları içerdiğini onaylayın.

Dokunun sindirimini 2-3 kez daha veya dokunun çoğunluğu sindirilene kadar tekrarlayın. Sindirim süpernatantları toplandıktan sonra, hepsini birleştirin ve numuneyi üç dakika boyunca toom sıcaklığında 100x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve topaklar görünmeyene ve anoikis'i önleyen 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenmiş 5 mililitre önceden ısıtılmış kültür ortamı olana kadar hafifçe pipetleyerek peleti yeniden askıya alın.

Son olarak, sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için hücre süspansiyonunu 100 mikronluk bir filtreden süzün. Filtreyi, Y-27632 ile desteklenmiş 2 mililitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ile yıkayın. Hücreleri tohumlamadan önce, bazal membran matrisi ile kaplanmış plakayı inkübatörden çıkarın.

Fazla bazal membran matris çözeltisini plakadan çıkarın ve her bir oyuğa 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenmiş 250 mikrolitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin. Yavaş bir zikzak hareketiyle gerçekleştirilen damla damla pipetleme ile 24 oyuklu plakanın oyuğu başına 250 mikrolitre hücre süspansiyonu tohumlayın. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Burada, 18 ila 24 saatlik kültürden sonra alınan birincil ince bağırsak hücrelerinin tek katmanlarının mikroskop görüntüleri sunulmaktadır. İn vitro olarak kültürlenen birincil ince bağırsak hücreleri, hücre içi kalsiyumu veya siklik AMP'yi yükselten uyaranlara yanıt verdi ve hücreler bombesin ile tedavi edildiğinde glukagon benzeri peptit-1 salınımında iki kat artışa neden oldu ve forskolin ve IBMX ile aynı anda uyarıldığında on bir kat sekresyon artışı. Son olarak, pro-glukagon promotörün kontrolü altında GCAMP 3'ü eksprese eden transgenik farelerden üretilen kültürler kullanılarak, primer ince bağırsak L hücrelerinin, gelişmiş floresan ile gösterildiği gibi, sitozolik kalsiyumda bir artışla bombesin ve potasyum klorür stimülasyonuna yanıt verdiği gösterilmiştir.

Gösterilen prosedür, birçok turun zor bulduğu kültürel ince bağırsak hücrelerine odaklanmıştır. Hem murin hem de insan kökenli diğer bağırsak segmentlerinin kültürü için de benzer bir pratik kullanıyoruz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir.

Hiçbir iki preparat aynı değildir, bu nedenle her bir sindirimin alikotlarını mikroskop altında incelemeyi unutmamak önemlidir. Bu, ilerlemeyi değerlendirmenize ve sarsıntının yoğunluğunu ve sindirim sayısını buna göre uyarlamanıza olanak tanır.