Name: Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Keşfedin, bağışıklık yetenekli Danio rerio embriyolarına tümör hücresi transplantasyonu yöntemiyle pediatrik beyin kanserinde uzun vadeli davranış ve ilaç yanıtı analizi. Bu teknik, toksisiteyi minimize ederek canlıda tümör yükü değerlendirmesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Makaledeki mükemmel öneriler ve geliştirmeler için iki yorumcuya teşekkür ediyoruz. Hayvan yetiştiriciliği ve bakımı için Huntsman Kanser Enstitüsü / Utah Üniversitesi&#39;ne teşekkür ediyoruz. Bu çalışma Amerikan Kanser Derneği (# 124250- RSG-13-025-01-CSM), bir NIH hibe (P30 CA042014 CRR programı), Utah Üniversitesi Tohum Hibe Üniversitesi ve Huntsman Kanser Vakfı tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan usulleri, Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC # 16-03019) hayvan bakım kılavuzlarında onaylanmış ve izlenmiştir. 1. Ekipmanın Mikroenjeksiyona Hazırlanması <ol><li> Enjeksiyon plakasının hazırlanması. <ol><li> Yumurta suyunda çözülmüş% 1.2 agaroz solüsyonu hazırlayın (ters osmoz suyunda 0,6 g / L akvaryum tuzu + 0.01 mg / L metilen mavisi). Çözeltiyi, agaroz çözülünceye kadar kaynatın ve sonra 0.05 mg / L metilen mavisi ilave ederek ilave edin. 25 mL son çözeltiyi 10 cm&#39;lik bir Petri kabına dökün ve katılaşmasına izin verin. Geriye kalan 25 mL agaroz solüsyonu, adım 1.1.2&#39;ye kadar bekleyene kadar 42 ° C&#39;lik bir su banyosuna yerleştirin. </li><li> Katılaşmış yüzeyin merkezinde 2 inç çaplı bir beher koyun ve geri kalan 25 mL% 1.2 agaroz dökün. NOT: Bu plakanın çevresine bir enjeksiyon yüzeyi ve ortada bir çekirdeği oluşturur;Iğne boyutu ve tümör süspansiyon kıvamı test etmek için bir alan sağlar. <ol><li> Enjeksiyondan önce en az 30 dakika enjeksiyon plakasını 28 ° C&#39;de veya uzun süre saklama için 4 ° C&#39;de tutun. </li></ol></li></ol></li><li> Enjeksiyon iğneleri hazırlamak. <ol><li> İğneleri, 1,2 mm dış boyut ve 0,9 mm iç boyut (filament olmadan) ile iğne makarasındaki iki iğneye çekerek 10 cm&#39;lik kılcal damarları çekerek yapın. NOT: Her bir iğne, yaklaşık 1.5 cm&#39;lik uca konik olan toplam uzunluğu 6 cm&#39;yi ölçmelidir. </li><li> İğneyi dikkatli bir şekilde plastik parafin film içine sarılmış bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Ucu ucunda bir açıklık olan bir iğne oluşturmak için iğnenin ucunu 45 ° açı ile kesmek için tıraş bıçağı kullanın. NOT: Tipik olarak iğnenin ucundan 0,1 mm ila 0,3 mm kaldırılır. Enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için eğimli bir uç gerekmez. </li></ol></li><li> Mikroenjeksiyon ayarını hazırlayın. <ol> &lt;Li&gt; Transplantasyon için bir stereomikroskop, manipülatör ve bir mikroenjektör dahil olmak üzere standart bir mikroenjeksiyon tertibatı ayarlayın. </li></ol></li></ol> 2. Transplantasyon için Embriyoların Hazırlanması <ol><li> 45 olarak tanımlanan 500 mitfa w2 embriyo 44 (veya kullanıcı tarafından tanımlanan diğer zebra balığı genotiplerinin embriyoları) toplayın ve 28 ° C inkübatörde muhafaza edin. </li><li> 24 hpf&#39;de yumurtalı suda seyreltilmiş 10 mg / mL proteaz kokteyl çözeltisinin 100 μL&#39;sini ekleyerek embriyoları dechorionate edin ve yaklaşık 20 dakika yavaşça sallayın. Artık proteazı çıkarmak için embriyoları 3 kez taze yumurta su ile durulayın. </li><li> Standart evreleme serisi kriterlerine göre tanımlanan uygun gelişim evresi için 48 hpf&#39;de embriyonları tarayın 45 . Not: Transplantasyon için sadece doğru şekilde düzenlenmiş ve morfolojik olarak normal embriyolar kullanılmalıdır. </li><li> UyutmakBir petri kabında% 0.002 Tricaine-S içeren yaklaşık yirmi 48 hpf embriyo yumurta suyunda. Hareketin kesilmesini gözleyerek doğru anestezi teyit edin. </li></ol> 3. Tümör Hücresi Süspansiyonu Oluşturma NOT: Zebra balığı beyin tümörü modelleri genetik olarak onkogenler ve tümör baskılayıcı genlerin 17 , 46 , 47 kombinasyonları ile üretilebilir. Burada, kısa süre önce tarif edildiği gibi, sox10 destekleyicisi tarafından yönetilen NRAS WT , p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNET zebrafish modeli kullanıldı 17 . <ol><li> IACUC onaylı protokollere göre buzlu suya daldırılarak% 0.4 Tricaine-S aşırı doz kullanılarak tüm vücut boyutunun yaklaşık% 20&#39;sinde tümör yükü olan beyin tümörü taşıyan balıkları elite edin. </li><li> Floresan etiketli tümörü bir tıraş bıçağı ve bir flüoresan altında cımbızla parçalara ayırınMikroskop steril tekniği kullanarak ve 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) yerleştirin. NOT: Kesin diseksiyon yöntemleri kullanıcı tanımlı olacak ve tümör türüne ve doku konumuna bağlı olacaktır. Farklı zebra bağı organlarının ve beyin tümörlerinin diseksiyonu için ayrıntılı prosedürler için listelenen referanslara bakın 17 , 48 . </li><li> Düzgün, bulutlu bir çözüm gelişene kadar p1000 pipet kullanarak tümör kitlesini manüel olarak bozun. Bir pipet ucu veya 40 μm hücre süzgeç kullanarak büyük partikülleri çıkarın (bu tümör bağımlısıdır). Süspansiyonu oda sıcaklığında 290 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Not: Tümör hücrelerini izole etmek için floresanla aktive edilmiş hücre ayırma (FACS) uygulanmaz. Bu, heterojen bir stromal, immün ve tümör hücresi popülasyonunun transplantasyonuna izin verir. </li><li> Steril PBS 100 mcL tümör hücresi pelletini süspanse edin ve 1.5 mL mikroya aktarınSantrifüj tüpü. Hücre süspansiyonu 5 mcL almak ve PBS 250 mcL&#39;de seyreltik. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın. Süspansiyonu 290 xg&#39;de 3 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve istenen hücre konsantrasyonunu elde etmek için pelet steril PBS&#39;de tekrar süspansiyon haline getirin. NOT: Tipik olarak, steril PBS&#39;nin 30-40 μL&#39;sinde yeniden süspanse edilen hücreler, viskoz ve opak olan bir solüsyon üretir (hücre konsantrasyonu ≥100 hücre / nL) ve en başarılı nakiller üretme eğilimindedir. Hücre yaşayabilirliği değerlendirilmemiştir. </li><li> Transplantasyon işlemi sırasında tümör süspansiyonunu 28 ° C&#39;lik bir ısı bloğunda saklayın. </li></ol> 4. Tümörün Süspansiyonunu 2-dpf Embriyo Dördüncü Ventrikülüne Enjekte Etme <ol><li> Bir transfer pipet kullanarak 10-20 anestezi uygulanmış embriyoyu (adım 2.4&#39;ten) enjeksiyon plakasının çevresine aktarın; Embriyolar enjeksiyon plakasına yanal olarak düşmelidir, ventriküller açıkça görülür ve erişilebilir durumdadır. Embriyoları gerektiği gibi ayarlamak için açılandırılmış bir sonda kullanın ve bunları enjeksiyon plakasının dış kenarından uzakta konumlandırın. </li><li> Jel yükleme pipet ipuçları kullanarak enjeksiyon iğne içine 1-2 mikro litre tümör hücre süspansiyonu yükleyin ve manipülatör içine iğne yerleştirin. </li><li> İğneyi 45 ° açı ile tutarak elle manipülatörü indirin. İğne embriyo kafasının hemen üstünde ve yaklaşık 5 mm olana kadar mikromanipülatör üzerindeki düğmeleri x, y ve z yönlerinde ayarlayın. Stereomikroskopun gözlerine bakın ve iğne embriyonun dördüncü ventrikülünü delene kadar yavaşça x yönündeki mikromanipülatörü ayarlayın. İğnenin kalbe veya sarıyı delmesine izin vermeyin. <ol><li> Tümör hücresi süspansiyonunu enjekte etmek için mikroenjektöre bağlanan ayak pedalına basın. NOT: Enjeksiyon basıncı ve süresi iğne deliğinin boyutuna göre değişir, ancak iyi bir başlangıç ​​noktası 5 - 10 PSI ve 50 - 100 ms&#39;dir.Enjekte edilen tümör hücrelerinin hacmi, eğer istenirse mineral yağı içine enjeksiyon yoluyla standart yağ düşürme teknikleriyle değerlendirilebilir 49 . Damla çapı 0,1 mm olan 500 pL&#39;lık enjeksiyonlar tipik olarak en iyi sonuçları verir. </li></ol></li><li> Enjekte edilen embriyoları enjeksiyon plakasından hafifçe durulayın ve taze yumurta suyunu kullanarak bir petri kabına koyun. Yumurta suyundaki embriyoları, kalan prosedürler için veya tanklarda yetişene kadar koruyun (adım 4.9.1&#39;de açıklandığı gibi). </li><li> Enjekte edilen embriyoları bir floresan stereomikroskop altında inceleyin. Enjeksiyon basıncının, açısının, iğne boyutunun ve hücre süspansiyon viskozitesinin tümör hücrelerinin ventrikül alanının% 25-50&#39;sini doldurduğunu doğrulayın. Bu parametreleri gerektiği gibi ayarlayın. </li><li> Kalan embriyolar için 4.1-4.5 adımlarını tekrarlayın. Ek embriyoları gerektiği gibi anestezi altına alın (2.4. Adımda açıklanmıştır). NOT: Deneyimli bir kullanıcı 3-4 saat içinde 300 embriyona kadar enjekte edebilir. </li><li> Embriyoları tekrar yerleştirin28 ° C inkübatör gece boyunca. </li><li> Ertesi gün, açıklandığı gibi, normal kalp ve beyin gelişimi gibi morfolojik ve fizyolojik özellikleri inceleyerek embriyo sağkalımını değerlendirin. </li><li> Tarama için embriyoları 2.4. Adımda tarif edildiği gibi transplant sonrası 1 gün sonra (dpt) anestezi altına alınız. <ol><li> Bir petri kabının ortasına% 4 metilselüloz eklemek için bir transfer pipeti kullanın ve embriyonları metilselüloz damlasına ekleyin. Floresan bir mikroskop kullanarak tutarlı bir engraftment boyutu için açılı bir prob ve ekran kullanarak embriyoların (ventral tarafı ışık kaynağı bakan) yönlendirin. Ventrikül ile sınırlı olmayan tümör hücreleri veya ventrikül alanının% 25&#39;inden daha azını oluşturan tümör hücreleri içeren embriyoları çıkarın. Not: Tutarlı engraftman, ventrikül alanının% 25-50&#39;sini kapsayan tek bir tümör kitlesi olan embriyolar olarak tanımlanır. Tarama amacıyla, bir floresans1X objektif, 0.15 sayısal diyafram açıklığı, 0.7-1.6X aralığında bir büyütme ve 50 ms ila 1 sn pozlama süresi olan tereomikroskop. Tüm görüntülerde, GFP veya RFP kanalına ek olarak parlak alan kanalından yararlanın. </li><li> Tümörlerin bakımı için nakledilen embriyoları 8 dpf&#39;de (6 dt) 45 büyüyecek şekilde tanklara yerleştirin. </li></ol></li></ol> 5. Hücresel Davranışlar İçin Transplante Embriyoların Görüntülenmesi <ol><li> 3-8 dpf (1-6 dpt) embriyoları anestezi ve% 1.2 düşük eriyikli agaroz monte (dorsal tarafı lamel bakacak şekilde). Göç, hücre bölünmesi veya hücre-hücre etkileşimleri gibi hücresel davranışları görselleştirmek için istenen uzunlukta bir lazer tarayıcı konfokal mikroskop kullanarak monte edilmiş embriyoların zaman atlamalı görüntüsünü gerçekleştirin, gerektiği gibi 38 , 43 , 53 . NOT: Bir 1024 x 1,024 en / boy oranını kullanın, 8 &amp; #181 s / piksel. Tarama ortalamasını kullanın ve tüm tümör kütlesinin (1,000-1,500 μm) yakalanmasını sağlamak için z-derinlik boyutlarını tanımlayın. Ayrıca, invaziv davranışları izlemek için, 40x bir objektif kullanarak her 10-15 dakikada bir bir görüntü elde ederek, 4 saatlik zaman aşımı deneyleri gerçekleştirin. Dedektör duyarlılığı, tümör kütlesinin yoğunluğuna bağlı olarak değişir ve lazer gücü mikroskopa bağlı olacaktır, ancak genellikle% 15 ila 40 arasında olması önerilir. </li><li> Görüntüleme tamamlandıktan sonra, açılı bir prob kullanarak agarozdan kurtulmuş embriyo serbest bırakın ve taze yumurta suyuyla bir petri kabına aktarın. </li></ol> 6. Transplante Embriyolara İlaç İdaresi ve Tümör Yükü Değerlendirmesi 17 <ol><li> Embriyoları 3 dpf&#39;de anestezikleyin ve ventral tarafı ışık kaynağına bakacak şekilde% 4 metilselülozda yönlendirin. Tedavi öncesi embriyoları flüoresans mikroskopu kullanarak görüntüleyin 17 . </li><li> PlaNakledilen embriyoları, 12 delikli bir plakada 3 dpf&#39;de, 0.5 mL yumurta suyunda oyuk başına 10 embriyo ile yıkayın. İstenilen nihai konsantrasyonu elde etmek için uygun miktarda ilacı ekleyin ( örn. 50 uM MEK inhibitörü) ve embriyoları 28 ° C inkübatöre döndürün. Ertesi gün, ilaçla muamele edilmiş yumurta suyunu ince gözenekli bir transfer pipetiyle çıkarın ve taze bir muamele ekleyin. Embriyolar 8 dpf&#39;ye ulaşana kadar bunu tekrarlayın. </li><li> 8 dpf&#39;de, ilaç tedavisindeki embriyoları alın ve taze yumurta suyuna koyun. % 4 metilselülozda embriyoları ve orient (ventral tarafı ışık kaynağına bakan) anestezi. Görüntü embriyoları, bir flüorür mikroskopu kullanarak muamele sonrası tedavi. 17&#39;de tarif edildiği gibi uygun bir yazılım kullanarak tümör alanını ölçün. </li><li> Embriyoları tedavi başına uygun şekilde ayırın ve büyümek için tanklara yerleştirin. 4-9 hafta sonra, balıkları anestezi altına alın ve genel bir tümör yükü için standart flüoresan stereomikroskop kullanarak değerlendirin; d17 kaçınılmaz </li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, tam yetkili bir bağışıklık sistemi geliştirecek bir 2-dpf embriyonunun ventrikülüne zebra balığı tümör hücrelerinin enjeksiyonunu içeren basit ve etkili bir nakil testini ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Şu ana kadar, zebra balığı CNS-PNET 17 ve melanoma (veriler gösterilmemiştir), tümör hücresi davranışı ve istilasına ilişkin uzun vadeli çalışmalar için başarıyla nakledilmiştir. Bu protokolün kritik aşamaları, uygun iğne deliği boyutunu ve uygun tümör hücresi süspansiyonunu ve konakçı embriyoları yeterince anestezi altına almayı içerir. Her bir araştırmacı için, bu tekniğin daha da optimizasyonu, tümör hücre konsantrasyonunun, enjeksiyon basıncının ve embriyo yönlendirmesinin ayarlanmasını içerebilir. Buna ek olarak, farklı tümörlerden kaynaklanan süspansiyonların viskozitesinde heterojenlik olabilir, bu nedenle farklı tümör tipleri, yeniden askıya alma ve nakil için az çok zor olabilir. Bununla birlikte, iğne deliği boyutunu ayarlayarak ve farklıTümör süspansiyonunun kiralık seyreltmelerinde, tümör viskozitesi ile ilgili zorlukların üstesinden gelmek mümkündür. Deneyimimizde, seyrek hücrelerin / ventriküldeki tutarsız hücre kitlelerinin en yaygın nedenleri şunlardır: 1) tümör hücresi süspansiyonu çok seyreltik; 2) iğne deliği boyutu çok küçük; 3) enjeksiyon süresi ve basıncı çok düşük; Ve / veya 4) kalan doku tümörden filtrelenmedi ve iğneye yerleştirildi. Enjeksiyondan sonra tümör hücresi süspansiyonu ventrikülden dışarı aktığında muhtemelen: 1) iğnenin ventrikül tabanına yerleştirilmesi; 2) yüksek bir enjeksiyon basıncı ve zamanı; Ve / veya 3) çok büyük bir iğne deliği ebadı. Nakledilen embriyoların düşük sağkalımı, şu nedenlerden kaynaklanabilir: 1) embriyoları uzunca bir süre anestezikle; 2) enjeksiyon plakasındaki embriyoların kuruması için bırakılması; 3) hava kabarcıklarının ventriküle enjekte edilmesi; Ve / veya 4) beyin gibi yaşamsal organların delinmesi veKalp, çünkü iğne ventrikül içinden geçti. Yetişkinlerde veya embriyonik zebra balığı beyindeki önceki tümör transplantasyon yöntemleri, yetişkinlerde (genetik olarak, farmakolojik olarak veya radyasyon yoluyla) immün baskılamaya dayanır veya embriyonlardaki 38 , 43 , 52 , 53 , 54&#39;teki insan veya fare hücrelerinin kısa süreli çalışmaları ile sınırlıdır . Örneğin, fare beyin tümörleri, kısa süreli (~ 2 gün) klinik öncesi ilaç tahlilleri 54 için deksametazon-immüno-baskılanmış, 30-dpf, küçük yaştaki zebrafish içine intranazal olarak enjekte edilebilir 54 . Bununla birlikte, bu deneylerde enjeksiyon yeri kafatası ve beyin dokusu tarafından örtülmüş ve muhtemelen normal beyin dokularına zarar verecek ve konakçı yaşayabilirliğini ve engraftman etkinliğini azaltacaktır. Yakın zamanda tarif edilen diğer bir metot, insan gliobununInvazyon ve uyuşturucu tepkisinin kısa vadeli analizini mümkün kılan zebra balığı embriyolarının orta beyin bölgesine dönüştürülmesi. Yine, enjeksiyon alanının kesin konumu değişkendir ve muhtemelen normal dokuya zarar verir. Dolayısıyla embriyonik beyin transplantasyonlarının daha önceki yöntemleri, bu çalışmaların kısa vadeli analizlerle ( yani 2 ila 14 gün arasında) sınırlandırılması nedeniyle, konakçıların yaşayabilirliğini tehlikeye atarak, belirsiz enjeksiyon bölgelerinden dolayı bireysel enjeksiyonlar arasında değişkenlik artıyor ve uzun süreli anti- Hücre davranışlarının ve ilaç yanıtlarının ya da çok nesiller boyunca yeniden transplantasyonun uzun vadeli analizi. Burada açıklanan yöntem, zebrafish embriyonik ve bağışıklık sistemi zayıflatılmış transplantasyon tekniklerindeki mevcut kısıtlamaları ele almaktadır; bunlar, araştırmacıların şunları yapmalarına olanak tanır: 1) Çevredeki dokuya asgari zarar verilerek tekrarlanabilir şekilde enjekte edilir; 2) enjeksiyon alanını doğrudan en üst düzeye çıkarmak için görselleştirin.Engraftment verimliliği; 3) günde yüzlerce embriyo nakli; 4) tümörlerin bağışıklık kazanmış hayvanlarda büyümesine izin verin; 5) zebra balığı ömrü boyunca tümör hücresi davranışı ve dayanıklı ilaç tepkilerinin izlenmesine izin vermek; Ve 6) tümör gelişiminde veya ilaç relaps mekanizmalarında potansiyel çalışmalar için birçok kuşağa tümörlerin yeniden nakline izin verir. Ayrıca, bu protokol, araştırmacıların, farklı bağışık nüfuslar da dahil olmak üzere, konukçu yanıtını değerlendirmek için herhangi bir zebra balığı genotipini kullanmalarını sağlar. Bu öznitelikler, bu yöntemi zaten zebrafish&#39;te standart mikroenjeksiyonlar gerçekleştiren herhangi bir laboratuvar tarafından kolayca adapte edilebilir hale getirir. Son olarak, bu yöntem zebrafish beyin tümörlerinin ortotop enjeksiyonları için ideal olsa da, karaciğer veya pankreas gibi diğer tümör tiplerini naklederken, ortotopik bölge bağışıklık yeterliliğinden daha önemli olabilir ( örneğin, bir araştırmacı, stromal Mikro çevre, tümör büyümesi). Bu senaryoda,Yeni geliştirilen immün yetersiz zebrafish modelleri, ortotopik tümör transplantasyonlarının yapılması için daha uygun olabilir 11 . Bu protokol, tümör hücresi rekabet testlerini yapmak ve ikili etiketli tümörleri enjekte etmek için kullanılmıştır. Ayrıca ilacın suya ilavesiyle transplant sonrası embriyoların tedavisini içeren kimyasal bileşiklerin tümörojenez üzerindeki etkinliğinin değerlendirilmesi için potansiyel bir tedavi stratejisi de tartışılmıştır. Transplantasyondan önce tümör hücrelerinin ex vivo tedavisi için bir yöntem daha önce bildirilmiştir17. Ek olarak, nakledilen tümörler, tümör gelişimi ve kemorezistans 17 çalışmalarında faydalı olacak çok turlu yeniden nakil için toplanmıştır. Şu anda, klinik öncesi çalışmalar, potansiyel bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için fare zenogreftlerine bağımlıdır. Bununla birlikte, bu çalışmalar çok zaman alıcıVe masraflı. Zebra balığı ile insanlar arasındaki onkojenik sinyal yollarının yüksek derecede korunması göz önüne alındığında, bu yöntemin, klinik öncesi ve klinik denemelere giren etkili bileşiklerin daha hızlı tanımlanabilmesini sağlamak için konvansiyonel fare ve insan hücre çalışmalarını tamamlaması beklenebilir. Sonuçta bu yöntem, birincil hasta tümörlerinin hızlı kimyasal taramasında yararlı olabilir ve bu da kişiselleştirilmiş ilaç girişimini ilerletebilir. Ancak, zebra balığı (yetişkin veya embriyo) insan hücrelerinin uzun vadeli büyüme koşulları belirlenmelidir.

Tümör hücrelerinin bağışıklık sistemi zayıflatılmış hayvanlara, özellikle fare ksenograftlarına transplantasyonu, kanser hücresi çoğalması 1 , 2 , sağkalım, istila ve metastazı 3 , 4 kontrol eden mekanizmaların incelenmesinde ve bir platform sağlamak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir Ilaçların taranması için 5 , 6 , 7 . Daha yakın zamanlarda, primer tümör numunelerinin bağışıklık sistemi zayıflatılmış farelere transplantasyonu, tanı ve klinik öncesi ilaç tarama amaçları için hastadan türeyen ksenograft (PDX) modelleri üretmek için kullanılmıştır ve kişiselleştirilmiş ilaç girişiminin omurgasıdır 8 , 9 , 10 , 11 . Bununla birlikte, önemli kanıtlar, immün sistemin modüle edilmesininKök, tümör davranışı ve hasta sonuçları üzerinde dramatik bir etkiye sahip olabilir 12 , 13 . Bu, xenografta dayalı tekniğin, insan bağışıklık hücrelerinin tümör hücreleri ile birlikte nakledilmesiyle fare bağışıklık sisteminin yeniden yapılandırıldığı &quot;hümanize&quot; farelerin yeniden tasarlanmasını sağlamıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım tekniğe bağlı değişken tekrarlanabilirlik ve toksisitelerle birlikte halen teknik açıdan zorlayıcıdır, buna ek olarak önemli maliyet 14,15. Bu nedenle, bağışıklık yeterliliğine sahip hayvanlarda yeni transplantasyon tekniklerine, bağışıklık ve tümör spesifik kanser progresyonu ve ilaç tepkisi mekanizmalarının keşfedilmesini hızlandırmak için ihtiyaç duyulmaktadır. Zebra balığı, insan kanserinin araştırılması için alternatif bir hayvan modelidir ve 20&#39;den fazla kanser modeli kurulmuştur ve bunlarda 16 , son derece habis beyin 17 , mela<html> Noma 18 , 19 , 20 ve pankreas kanseri 21 , 22&#39;nin yanı sıra birçok lösemi 23 , 24 , 25 , 26 , 27&#39;yi içerir . Zebra balığı sisteminin iki özelliği, kanser araştırmaları için özellikle müsait olmasını sağlar: 1) saydam hayvanların optik berraklığı, basit mikroskopi teknikleri kullanılarak kanser hücre davranışlarının ( ör. Çoğalma, hayatta kalma, istila ve yayılma) doğrudan görselleştirilmesine olanak tanır ve 2) Dişi zebra balığı, günde 200 embriyo üretebilir ve düşük sayıyla genetik veya uyuşturucu taramasında hızlı hayvan sayısının ölçeklenmesine izin verir. Buna ek olarak, zebra balığı ve insanların kanser genomları (onkogenler ve tümör süpresör genler dahil) oldukça korunumludurF &quot;&gt; 28, mekanik ve uyuşturucu keşiflerinin memelilere hızla çevrilmesine izin veren bu özellikler, zebra balığı, görüntüleme, ölçeklenebilirlik ve sistemin düşük maliyetinden yararlanan transplantasyon teknikleri için ideal bir hayvan modeli haline getirir. Bağışıklık-zedelenmiş zebrafish&#39;de önceki tümör nakli çalışmaları, kendini yenileme kabiliyetlerinin, tümör malignitelerinin ve istilanın / yayılmanın tanımlanmasını kolaylaştırdı 11,29. Bağışıklık sistemleri yaklaşık 20 gün 11 , 30 boyunca etkili şekilde bastırılmış γ-ışınlarına maruz kalmış erişkinlere transplantasyon yapıldıktan sonra tümör hücresi davranışına ilişkin kısa vadeli çalışmalar yapılabilir. Yetişkin zebrafish&#39;in deksametazon ile tedavisi reddedilmeden önce 30 güne kadar B ve T hücrelerini bastırır 31 . Daha az yaygın bir diğer strateji klonal zebra balığı soyları kullanmaktadırBağışıklık sahibi bir evsahipliğinde uzun vadeli araştırmaları mümkün kılan 32 . Bununla birlikte, sınırlı sayıdaki klonal suşlar üretilmiştir ve doğurganlığın düşük olması nedeniyle sürdürülmesi zordur. Buna ek olarak, kurulan zebra balığı tümör modellerinin çoğu diğer genetik kökenlerde üretilir, bu nedenle bu tümörler bağışıklık sistemini baskılamadan klonal suşlara nakledilemezler 11 , 33 , 34 . Uzun vadeli transplantasyon çalışmalarını iyileştirmeye yönelik daha yeni yaklaşımlar, çoklu kanserleri başarıyla nakletmek için kullanılan 35 ve 36 nolu başarıyla kullanılan B ve T hücre işlevleri ile birlikte rag2 E450fs mutant hattının geliştirilmesini içermektedir. Klon zebra bağı soyları veya bağışıklık sistemi tehlikeye atılan bir ev sahibi için gereksinimi ortadan kaldırmak için, bazı gruplar erken aşamadaki embriyoları kullandı ( yani, &gt; 72 hpOst-fertilizasyon (hpf)), bu embriyolar henüz 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 adaptif bir bağışıklık sistemi geliştirmediğinden insan tümör hücresi transplantasyonu için. Bununla birlikte, bu yöntemler, insan kanseri hücrelerinin veya transplantasyon tekniğinin kendisinin kendisini öldürdüğü, uzun süreli çalışmaları ve yeniden nakilleri önlediği için, tümör hücresi davranışının veya ilaç tepkisinin kısa vadeli analizi ile sınırlıdır (genellikle 2 haftadan az). Bu protokol, 2 gün sonrası dölleme (dpf) embriyo beyninin dördüncü ventrikülünün lümenine modifiye edilmiş embriyonik transplantasyon yöntemini ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Ev sahibi toksisite en aza indirir ve tümör hücrelerinin uzun vadeli engraftment için zebra balığı beyin tümörü modelleri ile kombine edilebilir. Böylece, bu teknikTümör hücrelerinin yeni nesillere yeni nesillere yeniden nakli yapılması, tümör heterojenitesi, konak / immün yanıtlar, ilaç yanıtları veya metastatik potansiyel üzerine gelecekteki çalışmaların kolaylaştırılması için düşüktür. Bu yöntem aynı zamanda basit, verimli ve ölçeklenebilir, çünkü günde tek bir kullanıcı tarafından 300 nakil yapılabilir,% 90&#39;a kadar engraftment uygulanır. Bu, tek primer tümörlerin genetik veya ilaç tarama projeleri için 2 dpf&#39;de yüzlerce embriyoya hızlı bir şekilde yayılmasına veya birkaç ay boyunca farklı ana bilgisayar geçmişinde beyin tümör hücresi davranışını doğrudan görselleştirmesine olanak tanır.

<table><tbody><tr><td>Evde</td><td></td> <td>yumurta suyu</td><td>ile embriyoların muhafaza edilmesi, enjeksiyon plağı yapılması&nbsp;</td></tr><tr><td>Metilen Mavisi&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>mantar büyümesini önlemek için yumurta suyuna ekleyin</td></tr><tr><td>Petri kabı Thermo</td><td>Fisher</td><td>FB0875711Z&nbsp;</td><td>embriyoları barındırmak, enjeksiyon plakası yapmak</td></tr><tr><td>50 ml ve nbsp; beher (2 inç çap)</td> <td>Enjeksiyon plakası yapan</td> <td>herhangi bir ticari marka</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville</td><td>CA3510-8</td><td>enjeksiyon plakası yapımı</td></tr><tr><td>Cam Kap</td><td>Enjeksiyon plakası yapan</td><td>herhangi bir ticari marka</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-10</td><td>tümör diseksiyonu</td></tr><tr><td>Jiletli</td><td>Thermo Fisher</td><td>12640</td><td>iğne hazırlama, tümör diseksiyonu</td></tr><tr><td>Parafilm ile sarılmış cam slayt</td><td>Herhangi bir ticari marka</td><td></td><td>iğne hazırlama</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin 1x, pH 7.4</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10010023</td><td>tümör resüspansiyonu</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci, 40 & m</td><td>Corning Falcon</td><td>352340</td><td>tümör resüspansiyonu</td></tr><tr><td>1.000 ve mikro; L filtre uçları</td><td>herhangi bir ticari marka</td><td></td><td>tümör resüspansiyonu</td></tr><tr><td>100 ve mikro; L filtre uçları</td><td>herhangi bir ticari marka</td><td></td><td>tümör resüspansiyonu</td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>21-108</td><td>tümör resüspansiyonu</td></tr><tr><td>15 mL konik tüpler</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>21-103&nbsp;</td><td>tümör resüspansiyonu</td></tr><tr><td>1.7 mL mikrotüpler</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-281</td><td>tümör resüspansiyonu</td></tr><tr><td>Mikropipetler</td><td>Herhangi bir ticari marka</td><td></td><td>tümör resüspansiyonu ve nakli</td></tr><tr><td>Cam kılcal damar (filament yok)</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; TW120-4</td><td>tümör nakli</td></tr><tr><td>İğne çektirme</td><td>Sutter Aletleri</td><td>P-97</td><td>tümör nakli</td></tr><tr><td>Mikroyükleyici uçları</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>tümör nakli</td></tr><tr><td>Mikroenjektör</td><td>Harvard Aparatı</td><td>PLI-90</td><td>tümör nakli</td></tr><tr><td>Trikain-S (MS-222)</td> <td>Western Chemical</td><td>TRS1</td><td>tümör nakli, anestezik</td></tr><tr><td>Açılı Prob</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10140-02</td><td>embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>Transfer Pipeti</td><td>Herhangi bir ticari marka</td><td></td><td>embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>Tümör resüspansiyonu sırasında gerekli</td>olan<td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td> Tümör resüspansiyonu</tr><tr><td>sırasında gerekli</td>olan<td>mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td>tümör nakli</td></tr><tr><td>Floresan Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>görüntüleme tümör nakli</td></tr><tr><td>Mikroskop Kamera</td><td>Olympus</td><td>DP-72</td><td>görüntüleme tümör nakli</td></tr><tr><td>Metilselüloz ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7140</td><td>görüntüleme tümör nakli</td></tr><tr><td>Kuluçka</td> makinesi <td>Embriyoları koruyan, enjeksiyon plakasını ısıtan</td><td>herhangi bir ticari marka</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga</td><td>Enjeksiyon plakası yapan</td><td>herhangi bir ticari marka</td><td></td></tr><tr><td>Ölçek</td><td>Enjeksiyon plakası yapan</td><td>herhangi bir ticari marka</td><td></td></tr><tr><td>Eldiven</td><td>Herhangi bir ticari marka</td><td></td><td>protokolün tüm yönleri</td></tr><tr><td>Düşük Eriyik Agaroz</td><td>Embriyoların herhangi bir ticari marka</td><td></td><td>konfokal görüntülemesi</td></tr><tr><td>Cam Alt Çanak</td><td>Mattek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td>embriyoların konfokal görüntülenmesi</td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FLUOVIEW FV1200</td><td>embriyoların konfokal görüntülenmesi</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td></td><td>Dekoryonat embriyoları 11459643001 teşhisi</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Herhangi bir ticari marka</td><td></td>, <td>tümör / tümör hücrelerini yeniden askıya alır</td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>Herhangi bir ticari marka</td><td></td><td>ilaç tedavisi Embriyoların</td></tr> ince <tr><td>delikli transfer pipeti</td><td>Herhangi bir ticari marka</td><td></td><td>ilaç tedavisi</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Herhangi bir ticari marka</td><td></td><td>Süspansiyondaki tümör hücrelerini saymak için</td></tr><tr><td>N2</td><td>Herhangi bir ticari marka</td><td></td><td>Mikroenjektör kurulumu için</td></tr></tbody></table>

zebra balığı pediatrik beyin tümörlerinin tümör hücre davranışının ve İlaç yanıtının uzun vadeli İncelenmesi için bağışıklık yetenekli ev sahibi olarak transplantasyonu

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tümör hücresi transplantasyonu, kanser hücresi büyümesi, göç ve konukçu yanıtını kontrol eden mekanizmaları tanımlamak ve tedaviye potansiyel hasta yanıtını değerlendirmek için önemli bir tekniktir. Mevcut yöntemler, tümör greftinin reddinden kaçınmak için, syngeneic veya bağışıklık sistemi zayıflatılmış hayvanların kullanılmasına büyük ölçüde bağımlıdır. Bu yöntemler, genellikle bağışıklık-tümör hücresi etkileşimlerinin analizini engelleyen ve / veya spesifik genetik geçmişlerle sınırlı olan spesifik genetik kökenlerin kullanılmasını gerektirir. Zebrafish&#39;de alternatif bir yöntem, 3 gün önce embriyonik beynin tamamlanmamış bağışıklık sisteminden yararlanır ve burada tümör hücreleri kısa vadeli tahliller ( yani 3-10 gün) için nakledilir. Bununla birlikte, bu yöntemler, tümör hücresi davranışının ve ilaç tepkisinin uzun süreli çalışılmasını engelleyen konakçı öldürücüğe neden olur. Bu protokol, zebrafish beyin tümörü dokusunun uzun vadeli ortotopik transplantasyonu için basit ve etkili bir yöntem açıklamaktadır.2 günlük bağışıklık yeteneğine sahip bir zebra bifsi dördüncü ventriküle. Bu yöntem şunları sağlar: 1) istila ve yayma gibi tümör hücresi davranışlarının uzun süreli çalışılması; 2) uyuşturucuya dayanıklı tümör tepkisi; Ve 3) tümör gelişiminin incelenmesi ve / veya farklı konakçı genetik kökenlerin etkisi için tümörlerin yeniden transplantasyonu. Özetle, bu teknik, kanser araştırmacılarına uzak aylardaki engraftment, istila ve büyümeyi değerlendirmelerine izin verirken, aynı zamanda birçok ay boyunca kimyasal ekranlar ve hücre rekabeti analizleri yapmaya izin verir. Bu protokol, diğer tümör tiplerine yönelik çalışmalara kadar genişletilebilir ve kemorezistans ve metastaz mekanizmalarını aydınlatmak için kullanılabilir.

Tümör nakli ve engraftment Prosedürün şematik bir taslağı Şekil 1&#39;de gösterilmektedir. Flüoresan olarak etiketlenmiş tümör hücreleri birincil organ sitinden çıkarılır ve tek hücre süspansiyonu 2-dpf mitfa w2 zebra balığı embriyolarının 44 dördüncü ventrikülüne transplantasyon için üretilir. Şekil 2 , sox10 promotörünün p53- yetersiz oligonöral prekürsör hücrelerde mCherry ile kaynaştırılmış vahşi tip NRAS veya aktive NRAS&#39;nin ekspresyonunu yönlendirdiği , merkezi sinir sistemi primitif sinir ektodermal tümörünün (CNS-PNET) bir zebra balığı modeli kullanan bu yöntemin temsili sonuçlarını göstermektedir 17 . Melanoforlardan yoksun mitfa w2 zebrafish 44 mutantı daha kolay görselleştirmek için kullanıldıTümör hücreleri transplantasyondan sonra ve / veya yetişkinliğe kadar. Casper 50 gibi ilave görüntü netliği sağlamak için başka pigment mutantları da kullanılabilir. Transplantasyondan 24 saat sonra, tümör hücreleri çevresindeki beyin dokularına işgal altında görülebilir ( Şekil 2A , 3 dpf, oklar). Tümör greftleri önümüzdeki hafta ventrikül ve çevresindeki beyin dokusunda büyümeye devam eder ( Şekil 2A , 8 dpf). Şu anda, böbreklerin bölgesindeki flüoresans da gözlemlenebilir ( Şekil 2A , yıldız). Bunun nedeni böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi için floresan boyaların kullanıldığı önceki çalışmalarla uyumlu olan organik kirliliğin transplantasyondan filtrelenmesine bağlı olabilir. Tümör hücreleri çoğalmaya ve işgal etmeye devam eder, bu nedenle 28 dpf kadar bir tümör kitlesi zebra balığı beyin boyunca görülebilir ( Şekil 2A , 28 dpf). <p class="jove_content" fo:keep-together.Within-page = &quot;1&quot;&gt; Bu teknik, enjeksiyon yeri konakçıya asgari hasarla doğru olarak hedef alınabileceğinden, tekrarlanabilir kıvamda yüzlerce embriyoya tümör hücrelerinin hızlı bir şekilde nakledilmesini sağlar. MCherry etiketli beyin tümör hücreleri ile nakledilen temsil eden bir embriyo grubu, Şekil 2B&#39;nin üst panelinde gösterilmektedir. Tümör oluşumu genellikle embriyonların% 80-90&#39;ında sağlanır ve tümör nakilleri yetişkinliğe kadar devam eder; Şekil 2B&#39;nin alt panellerinde üç temsilci örneği gösterilmektedir. Bu, tümör nakillerinin hasat edilmesine ve dondurulmasına veya birkaç nesilde yeniden nakline izin verir. Tümör invazyonu ve ilaç yanıtları Şekil 3A , ya GFP (Tümör A) ya da mCherry (Tümör B) ile etiketlenmiş iki farklı tümörün, tümüyle tümüyle hasat edildiği bir ortak transplantasyon şemasını göstermektedirVeya ayrılma (FACS&#39;nin burada kullanılmadığını, ancak gerekirse FACS&#39;ye göre sıralanmış tümör hücrelerinin kullanılabileceğini unutmayın). Tümör A ve B farklı yerlerde olabilir, farklı onkogenlerle indüklenebilir veya farklı genetik geçmişlerde indüklenebilir. Her bir tümör tek hücreli bir süspansiyon halinde işlenir ve tümör hücreleri daha sonra 1: 1 oranında karıştırılır ve 2-dpf embriyoya nakledilir. Bundan sonra, tümör B&#39;ye karşı tümör A&#39;nın engraftment, büyüme, istila ve yayılımı gibi tümör özellikleri, teknik ve genetik zemin için iç kontrollere izin veren aynı konukçuda gözlemlenebilir. Şekil 3B&#39;de , optik tectumdan bir NRAS tahrikli, mCherry etiketli zebra balığı CNS-PNET ve serebellumdan bir GFP etiketli CNS-PNET toplandı ve tek hücre süspansiyonlarına işlendi. Hücreler sayıldı ve her bir tümörden eşit sayıda hücre birlikte karıştırıldı ve 2-dpf embriyolarına nakledildi. Dört dTransplantasyondan aylar sonra, embriyolar konfokal mikroskop ile görüntülendi. Tectum tümör hücrelerinin (kırmızı) ana beyne (oklar) serebellar tümörden daha fazla göç ettiğini gösteren temsili bir embriyo gösterilmiştir. Floresan etiketli tümör hücreleri ile nakledilen embriyolar, tümör büyümesini inhibe eden bileşikleri tanımlamak için ilaç tedavisi rejimlerinde kullanılabilir. Şekil 3C , tümör nakillerinin tedavi edilmesi ve görüntülenmesi için tipik bir zaman çizelgesidir. Transplantasyondan 24 saat sonra, embriyonlara, tutarlı doğum boyu için erişilir ve tedavi gruplarına ayrılır. Verilen örnekte, NRAS ile çalışan , mCherry etiketli zebrafish CNS-PNET&#39;ler ile nakledilen embriyolar 50 uM dimetil sülfoksit (DMSO) veya MEK inhibitörü (AZD6244) ile muamele edilmiştir. Şekil 3C&#39;de ana hatları çizildiği gibi, embriyolar 5 gün süreyle muamele edilir ve 8 dpf&#39;de görüntülenir . Şekil 3D (sol paneller) temsilci gösterir<html> E hayvanları iki tedavi grubundan ayırır. 17&#39;de tarif edildiği gibi, MEK inhibitörü ile muamele edilen embriyolar, DMSO ile muamele edilenlerden daha düşük floresan miktarına sahiptirler. Hayvanlar görüntülendikten sonra, ilaçsız tanklara aktarılır ve iki ay boyunca tümör büyümesi izlenir. Verilen örnekte, MEK inhibitörü tedavisi, yetişkin balıklarda dayanıklı bir yanıt ile sonuçlanır ( Şekil 3D , sağ paneller). İlaç tedavisi, görüntüleme ve kantifikasyon hakkında daha ayrıntılı bilgi için bkz. Referans 17 . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig1.jpg" /> Şekil 1: 2-dpf Zebra balığı Embriyolarının Dördüncü Ventrikülüne Tümör Hücre Transplantasyonunun Protokol Şeması. Alternatif son nokta analizleri de dahil olmak üzere protokolün 3. ila 4. bölümlerinin genel şeması (bölüm 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu figürden daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig2.jpg" /> Şekil 2: Tümör Emeği ve Progresyon. (A) mCherry ile etiketlenen Zebra balığı primer CNS-PNET 17 tümör hücreleri, 2-dpf embriyoların dördüncü ventrikülüne nakledildi. 3 dpf&#39;de, tümör hücreleri çevreleyen beyin dokusunda istila edilir (oklar). 8 dpf&#39;de tümör hücreleri ventrikülde büyümektedir; Kırmızı tümör hücreleri çevreleyen beyin dokusunda ve böbreklerde de (yıldız işaretleri) bulunur. 28 dpf&#39;de tümör hücreleri ev sahibi beyninde işgal ettiler ve büyüdüler. (B) Üst panel. MCherry etiketli zebrafish beyin tümör hücreleri ile nakledilen yedi 3 dpf embriyo. Tümör hücreleri, yüksek kırılma oranlarına sahip ( yani, tipik olarak 85/100 embriyo) yüzlerce embriyoya sürekli olarak nakledilebilir. Orta veAlt paneller. Döllenmeden 4-8 hafta sonra nakledilen tümörlü üç temsilci yetişkin balığı (wpf). Tümörler flüoresan mikroskopisi ile görselleştirilebilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55712/55712fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig3.jpg" /> Şekil 3: Tümör Invazyonunu ve İlaç Yanıtını Karşılaştırma. ( A ) optik tectum veya serebellumdan CNS-PNETs 17 sırasıyla mCherry veya GFP ile etiketlenir, tek hücreli bir süspansiyona işlenir, 1: 1 oranında birlikte karıştırılır ve 2-dpf embriyolara birlikte nakledilir. ( B ) 6-dpf embriyo, GFP etiketli serebellar tümör hücrelerinin ve optik tectumdan mCherry etiketli tümör hücrelerinin karışık bir süspansiyonu ile birlikte nakledildi. T tümörlerin invaziv özelliklerinde farklılıklarAynı alıcı floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Bu örnekte, mCherry etiketli tümör hücreleri, GFP ile etiketlenmişlerden daha kapsamlı göç eder (oklar). ( C ) Tümör hücreleri ile nakledilen embriyolar üzerine ilaç tedavisi için zaman çizelgesi. ( D ) Tedavi rejiminin sonunda (8 dpf) ve tedaviden 8 hafta sonra (8 wpf) temsil eden hayvanların DMSO kontrolü veya 50 uM MEK inhibitörü ile görüntüleri. Tümör yükü, tarif edildiği gibi floresan miktarının ölçülmesi ile ölçülebilir 17 . Bu deneyde, mCherry etiketli tümör hücrelerinin büyümesi, MEK inhibitörü ile muamele edilen embriyoda azaltılır ve yetişkinlikte dayanıklı bir yanıt haline dönüşür. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55712/55712fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Kanser hücrelerinin transplantasyonu, kanser mekanizmalarının ve terapötik tepkilerin tanımlanması için önemli bir araçtır. Mevcut teknikler, bağışıklık yetersiz hayvanlara bağımlıdır. Burada, tümör hücresi davranışının ve in vivo ilaç yanıtlarının uzun vadeli analizi için immün yetkin embriyolara zebra balığı tümör hücrelerini nakletmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Bu prosedürün genel amacı, invazyon ve yayılım gibi tümör hücresi davranışlarının uzun süreli değerlendirmesine olanak sağlamak ve immünokompetan bir hayvan konakçısında potansiyel terapötikleri test etmektir. Bu yöntem, bir ilaç yanıtının kalıcılığı ve invazyon ile yayılımı yönlendiren mekanizmalar da dahil olmak üzere, pediatrik beyin kanseri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, konakçıya yönelik toksisiteyi minimize etmesidir; bu da tümör hücrelerinin kalıcı olarak nakledilmesine ve dolayısıyla beyin kanseri biyolojisinin uzun süreli çalışmalarına imkan tanır.Bu tekniğin etkileri, tümör yükünün ilaç tedavisinden sonra in vivo olarak doğrudan değerlendirilebilmesi nedeniyle beyin kanseri tedavisine kadar uzanmaktadır. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez uygulayan kişiler, tümör hücresi süspansiyonu çok konsantre veya çok seyreltik olduğunda, dördüncü ventriküle tutarlı miktarlarda enjeksiyon yapmakta zorlanacaklardır. Başlamak için, egg water içinde çözünmüş %1.2 agarose içeren 50 mililitrelik bir çözelti hazırlayın.Agaroz çözünene kadar çözeltiyi kaynatın ve ardından litre başına 05 miligram metilen mavisi ekleyerek tamamlayın. Nihai çözeltinin 25 mililitresini 10 santimetrelik bir petri kabına dökün ve katılaşmasını bekleyin. Kalan 25 mililitre agaroz çözeltisini 42 degrees Celsius sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin.Ardından, katılaşmış yüzeyin merkezine iki inç çapında bir beher yerleştirin ve kalan 25 mililitre %1,2 agarose'u önceki katmanın üzerine dökün. Enjeksiyon plakasını, enjeksiyondan önce en az 30 dakika boyunca 28 derece Celsius'ta veya uzun süreli saklama için dört derece Celsius'ta tutun. Dış boyutu 1,2 milimetre ve iç boyutu 0,9 milimetre olan 10 santimetrelik kapillerleri çekmek için bir iğne çekici kullanarak iğneleri hazırlayın.İğneyi, plastik parafin filmle sarılmış bir mikroskop lamı üzerine dikkatlice yerleştirin. Ardından, ucunda bir açıklık oluşturmak için iğnenin ucunu bir jiletle 45 derecelik açıyla kesin. Beyin tümörlü bir balığı ötanize edip tümörü metin protokolüne göre çıkardıktan sonra, homojen, bulanık bir çözelti oluşana kadar tümör kitlesini dağıtmak için manuel olarak bir P1000 kullanın.Büyük partikülleri uzaklaştırmak için bir pipet veya 40 mikronluk hücre süzgeci kullanın. Ardından süspansiyonu oda sıcaklığında 290 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Tümör hücresi peletini 100 µL steril PBS içinde yeniden süspande edin ve 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Hücre süspansiyonunun beş mikrolitresini seyreltmek için 250 µL PBS kullanın. Ardından, hücre sayısını belirlemek için bir hemositometre kullanın. Süspansiyonu 290 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra, istenen hücre konsantrasyonunu elde etmek için peleti resüspande etmek üzere steril PBS kullanın. Transplantasyon prosedürü sırasında tümör süspansiyonunu 28 °C'lik bir ısıtıcı blokta muhafaza edin. Bir transfer pipeti kullanarak, 10 ila 20 adet anestezi altındaki embriyoyu enjeksiyon plakasının çevresine transfer edin.Embriyolar, ventriküller net bir şekilde görünür ve erişilebilir olacak şekilde yanlara doğru düşmelidir. Embriyoları gerektiğinde ayarlamak ve onları enjeksiyon plakasının dış kenarından uzaklaştırmak için açılı bir prob kullanın. Ardından, bir jel yükleme ucu kullanarak enjeksiyon iğnesine bir ila iki mikrolitre tümör hücresi süspansiyonu yükleyin ve iğneyi manipülatöre yerleştirin.Ardından, iğneyi 45 derecelik bir açıyla tutarak manipülatörü manuel olarak aşağı indirin. İğne, embriyo başının hemen üzerinde ve yaklaşık beş milimetre sağında olana kadar mikromanipülatörün x, y ve z yönündeki düğmelerini ayarlayın. Bir stereomikroskop kullanarak, iğne embriyonun dördüncü ventrikülünü delene kadar mikromanipülatörü x yönünde yavaşça ayarlayın.İğnenin kalbe veya vitellusa (yumurta sarısına) batmamasına dikkat edin. Tutarlı enjeksiyonlar için embriyolar anestezi altına alınmalı, tümör uygun şekilde hücre süspansiyonuna ayrıştırılmalı ve iğne dördüncü ventrikülü delmeli ancak kalbe kadar uzanmamalıdır. Tümör hücresi süspansiyonunu enjekte etmek için mikroenjektör ayak pedalına basın.Enjeksiyon işlemi tamamlandığında, taze yumurta suyunu kullanarak enjekte edilen embriyoları enjeksiyon plakasından nazikçe durulayıp bir petri kabına aktarın. Ardından, enjekte edilen embriyoları karanlık bir odada floresan stereomikroskop altında inceleyin. Enjeksiyon basıncının, açısının, iğne boyutunun ve hücre süspansiyon viskozitesinin, ventrikül boşluğunun %25 ila %50'sini dolduracak şekilde tümör hücreleri ile sonuçlandığını doğrulayın.Embriyoları gece boyunca 28 degrees Celsius'lik inkübatöre geri yerleştirin. Ertesi gün, daha önce açıklandığı gibi, normal kalp ve beyin gelişimi gibi morfolojik ve fizyolojik özellikleri inceleyerek embriyo sağkalımını değerlendirin. Bir transfer pipeti kullanarak bir petri kabının ortasına %4 methylcellulose ekleyin ve anestezi uygulanmış embriyoları methylcellulose damlasına yerleştirin.Embriyoları yönlendirmek için açılı bir prob kullanın ve floresan mikroskobu altında, tutarlı bir greftleme boyutu için tarama yapın. Tümörlerin sürdürülmesi için, embriyolar döllemeden sonraki sekizinci güne ulaştığında, nakledilen embriyoları büyümeleri için tanklara yerleştirin. Metin protokolüne göre görüntüleme yapın ve ek çalışmalar yürütün.Bu deneyde, merkezi sinir sistemi primitif nöral ektodermal tümör hücreleri, melanoforları olmayan mitfa zebrafish mutantına nakledilmiştir. Nakilden sonraki 24. saatte, tümör hücrelerinin çevreleyen beyin dokusuna invaze olduğu görülebilir. Tümör greftleri sonraki bir hafta boyunca ventrikülde ve çevreleyen beyin dokusunda büyümeye devam eder ve böbrek bölgesinde de floresan gözlemlenebilir.Tümör hücreleri çoğalmaya ve istilaya devam eder, bu nedenle döllenmeden sonraki 28. güne gelindiğinde, zebrafish beyni genelinde bir tümör kütlesi görülebilir. mCherry ile işaretlenmiş beyin tümörü hücreleri nakledilmiş temsilci bir zebrafish grubu bu şekilde gösterilmiştir. Tümör hücresi tutulumu tipik olarak zebrafishlerin %80 ila %90'ında gerçekleşir ve tümör nakilleri yetişkinliğe kadar devam eder.Bu deneyde, optik tectumdan alınan NRAS kaynaklı, mCherry ile işaretlenmiş zebrafish CNS-PNET ve serebellumdan alınan GFP ile işaretlenmiş bir CNS-PNET, tümörün tamamının disosiyasyonu ile toplandı, tek hücreli süspansiyona dönüştürüldü ve ardından transplantasyon öncesinde birer oranında karıştırıldı. Transplantasyondan dört gün sonra görüntülenen bu temsilci embriyo, kırmızı renkteki optik tectum tümör hücrelerinin, konak beyne serebellar tümörden daha yaygın şekilde göç ettiğini göstermektedir. Yöntem uzmanlaşıldığında, yaklaşık 300 embriyo üç ila dört saat içinde enjekte edilebilir.Bu prosedürün ardından, tümör hücre biyolojisi, ilaç yanıtı ve kemorezistans ile ilgili ek soruları yanıtlamak için canlı hayvan görüntüleme ve ilaç uygulaması gibi ek yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu teknik geliştirildikten sonra, zebrafish kanser modelleme alanındaki araştırmacıların pediatrik beyin kanserlerinin tedavisi için yeni inhibitörler keşfetmelerinin önünü açmıştır.

transplantation-zebrafish-pediatric-brain-tumors-into-immune

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video, zebra balığı beyin tümörü hücrelerinin, immünokompetan bir zebra balığı embriyosunun dördüncü ventrikülüne ortotopik transplantasyonunu göstermektedir. Bu prosedür, tümör hücresi istilası ve davranışının uzun süreli çalışmasına izin verir.

Tümör Hücrelerinin Zebra Balığı Embriyolarına Uzun Süreli Ortotopik Nakli: Tümör Hücresi Davranışının Uzun Süreli Analizi için Tümör Hücrelerini Zebra Balığı Embriyolarının Dördüncü Ventrikülüne Vermek İçin Etkili Bir Yöntem

Burada, zebra balığı iskelet kası ve embriyonal rabdomiyosarkomun (ERMS) erişkin bağışıklık sistemi baskılanmış rag2E450fs homozigot mutant zebra balığına hücre nakli için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, kas hücrelerinin rejenerasyonu ve malign dönüşümünün verimli bir şekilde analiz edilmesini sağlar.

Bağışıklık Aşılmasına Yetişkin Zebra balığı içine normal ve malign Kas Hücre Nakli

Bu yöntemin amacı, memeli tümör hücrelerini floresan etiketli kan damarlarıolan zebra balığı embriyosuna xenografting ederek tümör anjiyogenezinin in vivo modelini oluşturmaktır. Ksenogreft ve ilişkili damarların görüntülenmesiyle anjiyojenik yanıtın kantitatif ölçümü elde edilebilir.

Zebrabalığı Tümör Ksenogreftlerinde Konak Anjiyojenik Yanıtın Vivo Görüntüleme ve Kantitasyonunda

Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Burada, ksnograftlar ve tümör davranış analizi, tam montajlı immünofluoresans ve konfokal görüntüleme nicelemesi için yönergeler oluşturmak için ipuçları içeren adım adım bir protokol sunuyoruz.

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Bu makale, nöroblastom zebra balığı modelinde, özellikle kendiliğinden metastaz geliştiren MYCN ve LMO1'in aşırı ifade edilmesiyle transgenik zebra balığı hattında tümör metastazını gerçek zamanlı olarak geliştirme, karakterize etme ve izleme yöntemini tanıtır.

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Şeffaf zebra balığı embriyolarının yumurta sarısına ksenotransplantasyon için basit, hızlı bir evreleme yöntemi ile optimize edilmiş bir protokol tarif ediyoruz. Enjeksiyon sonrası analizler, akış sitometrisi ile ksenotransplante edilen hücrelerin sağkalımını ve hastalık yükünün değerlendirilmesini içerir.

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Zebra balığı T-akut lenfoblastik lösemi modelindeki hareketsiz hücreleri tanımlamak için hücre proliferasyon boyaması kullandık. Leke, bölünmeyen hücrelerde tutulur ve hücre proliferasyonu sırasında azaltılır, bu da daha fazla sorgulama için hareketsiz hücrelerin seçilmesini sağlar. Bu protokol, hücresel sessizlik bağlamında kendini yenilemeyi incelemek için işlevsel bir araç sağlar.

Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması 

Burada, zebra balığı embriyolarında ve larvalarında döllenmeden en az 1 ila 7 gün sonra herhangi bir aşamada yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücrelerin nakli için bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik ve Larva Zebra Balıklarında Yüksek Çözünürlüklü Hücre Nakli

Bu protokol, geçici olarak bağışıklığı baskılanmış zebra balığı embriyolarında hücre hatlarından ve taze hasta materyalinden insan akut lenfoblastik lösemi (ALL) ksenogreftlerinin oluşturulması ve sorun giderilmesi için adım adım talimatların yanı sıra akış sitometrisi kullanılarak ilaç yanıtı değerlendirmesi için kılavuzlar sağlar. Deneysel boru hattı katı tümörler için de uyarlanabilir.

Zebra Balığı Embriyolarında Lösemi Hücre Greftleri Kullanılarak Hızlı İn Vivo İlaç Yanıtı Tahmini

Burada, yetişkin zebra balıklarına hücrelerin veya farmakolojik ajanların intravenöz enjeksiyonu için optimize edilmiş ve etkili bir protokol sunuyoruz, bu da hücre aşılamasının artmasına ve tedavi edilen zebra balığının hayatta kalma oranlarının artmasına neden oluyor.

Yetişkin Zebra Balıklarında Optimize Edilmiş İntravenöz Enjeksiyon

Keşfedin, bağışıklık yetenekli Danio rerio embriyolarına tümör hücresi transplantasyonu yöntemiyle pediatrik beyin kanserinde uzun vadeli davranış ve ilaç yanıtı analizi. Bu teknik, toksisiteyi minimize ederek canlıda tümör yükü değerlendirmesi sağlar.

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu (Video) | JoVE Journal

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Daha fazla video keşfet