Doku Mühendisliği vaskülarizasyon Birimleri olarak Kemirgen Yağ Dokusu kaynaklı Mikrovasküler Parçalarının İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, doku mühendisliği için vaskülarizasyon ünitelerinin oluşturulması için murin yağ dokusundan mikrovasküler fragmanları izole etmektir. Bu yöntem, doku mühendisliği alanında doku ikamelerinin in vivo vaskülarizasyonu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin bir avantajı, karmaşık in vitro işleme olmadan, iskelelere yerleştirilebilen ve doku defektlerine implante edilebilen tamamen işlevsel mikrovasküler segmentler vermesidir.

Bu yöntem, mikrovasküler ağ oluşumunun ve yeniden şekillenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları çözmek için in vitro anjiyogenez testleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Anestezi uygulanmış bir erkek vahşi tip C57 siyah altı fareyi cerrahi stereomikroskop altında sırtüstü pozisyona yerleştirerek başlayın ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt verilmediğini onaylayın. Pençeleri bantla hareketsiz hale getirin ve karnı dezenfekte edin.

Daha sonra, karın tabakasını alttaki kas dokusundan ayırmak ve orta hat laparotomisi yapmak için diseksiyon makası kullanın. Karın duvarının fleplerini yanal olarak açın ve testisleri, epididimus ve epididimal yağ yastıkçıklarını bilateral olarak tanımlayın. Daha sonra yağ yastıkçıklarını toplamak için küçük hazırlık makasları ve ince forseps kullanın, herhangi bir epididimal doku toplamamaya dikkat edin ve yağ yastıkçıklarını 15 ml 37 santigrat derece DMEM içeren bir petri kabına yerleştirin.

Laminer akış başlığında, yağ pedlerini 15 ml PBS içeren üç ayrı petri kabında yıkayın ve yıkanmış yağı 14 ml'lik boş bir polipropilen tüpe yerleştirin. Hasat edilen yağın hacmini belirlemek için bir tüp ölçeği kullanın. Daha sonra yağ dokusunu mekanik olarak kıymak için ince makas kullanın.

Homojen bir doku süspansiyonu elde edildiğinde, iki hacim kollajinaz NB 4G ile kıyılmış dokuyu 25 milimetrelik bir karıştırma çubuğu içeren 50 mL'lik bir erlenmeyer şişesine aktarmak için 10 mL'lik bir ölçüm pipeti kullanın. Şişeyi, kuvvetli bir şekilde karıştırarak 10 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ardından, sindirilmiş dokunun 10 mcL'sini mikroskop altında gözlemleyin.

Bu izolasyon prosedüründeki en zor adım, sindirimi durdurmak için uygun zamanı belirlemektir. Yağ yastıkçıklarının çok uzun süre sindirilmesi, herhangi bir mikrovasküler parça olmadan tek hücreli bir süspansiyona neden olacaktır. Digestat, tek hücrelerin yanında serbest yağ dokusundan türetilmiş mikrovasküler fragmanlar içeriyorsa, enzimi %20 FCS ile takviye edilmiş iki hacim PBS ile nötralize edin ve hücre damarı süspansiyonunu yeni polipropilen tüplere aktarın.

Mikrovasküler parçaları kalan yağdan yerçekimi ile ayırmak için çözeltiyi 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Ardından, ana yağ süpernatentinin bir mL'sini dikkatlice çıkarmak için bir mL hassas pipet kullanın ve ardından süspansiyon yağsız görünene kadar süpernatentin geri kalanını çıkarmak için 100 mcL'lik bir hassas pipet kullanın. Yağın tamamı çıkarıldığında, hücre damarı süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüp üzerinde 50 mikronluk bir süzgeçten filtrelemek için 10 mL'lik bir ölçüm pipeti kullanın ve filtrelenmiş süspansiyonu her bir mikrovasküler fragman izolatı için yeni bir 14 mL polipropilen tüpe aktarın.

Mikrovasküler fragman peletlerini santrifüjleme ile toplayın ve her tüpten son bir mL süpernatan hariç tümünü çıkarın. Kalan süpernatanlardaki peletleri yeniden askıya alın. Daha sonra, her bir süspansiyonu ayrı ayrı 1.5 mL konik mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve planlanan aşağı akış analizi için uygun nihai PBS ve %20 FCS hacminde yeniden süspansiyon için mikrovasküler fragmanları tekrar peletleyin.

Burada, altı, yedi ila on iki aylık yabani tip C57 siyah altı fareden yeni izole edilmiş mikrovasküler fragmanların uzunluk dağılımı gösterilmiştir ve ortalama ortalama uzunluk yaklaşık 42 mikrometredir. Bu temsili hücre damar süspansiyonu yaymasının gösterdiği gibi, yağ dokusu yeterince sindirildiğinde büyük, orta ve küçük mikrovasküler fragmanların yanı sıra tek hücreler gözlenir. Daha yüksek büyütme, mikrovasküler fragmanların hiyerarşik mikrodamar segmentleri ile olgun bir mikrodamar morfolojisi sergilediğini ortaya koymaktadır.

Mikrovasküler fragmanların akım sitometri ile karakterizasyonu, CD31 pozitif endotel hücreleri, alfa düz kas akton pozitif paravasküler hücreler ve CD117 pozitif mezenkimal kök hücreler, marker eksprese eden hücreler içerdiğini gösterir. Dermal bir cilt ikamesi üzerine tohumlandıktan sonra, daha büyük mikrovasküler fragmanlar esas olarak implantın yüzeyinde lokalize olur ve implant çekirdekleri içinde bazı kılcal damar segmentleri tespit edilir. Tohumlanan mikrovasküler fragmanların immünohistokimyasal boyanması, arteriolar, venüler ve kapiller benzeri fragmanlarla fizyolojik mikrodamar konfigürasyonlarını daha da ortaya çıkarır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa iki saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, doku mühendisliği için vaskülarizasyon üniteleri olarak murin yağ dokusundan mikrovasküler fragmanların nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.