Name: Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Murin Kısa Eksenli Ventriküler Kalp Dilimleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Öğrenin murin ventriküler kalp dilimleri hazırlama tekniğini elektrofizyolojik kayıtlar için. Bu yöntem, nakledilen kardiyomiyositlerin elektriksel entegrasyonunu ve kardiyoaktif ilaçların etkilerini incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalıştaylar ve Nörofizyoloji Enstitüsünün hayvan tesisi tarafından sağlanan desteği onaylıyoruz. Bu çalışma Walter und Marga Boll Stiftung, Köln Fortune ve Deutsche Stiftung für Herzforschung tarafından desteklendi.

Hayvanların taşınması, yerel hayvan refahı komitesinin ve Avrupa Parlamentosu&#39;nun 2010/63 / AB sayılı Direktifinin kurallarına uymalıdır. 1. Çözümleri Hazırlama <ol><li> Tyrode&#39;nin solüsyonunu Ca 2+ olmadan (mM&#39;de kompozisyon) hazırlayın: NaCI 136, KCl 5.4, NaH2PO4.33, MgCl2, glikoz 10, HEPES 5, 2,3-butandion monoksim (BDM) 30. pH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın NaOH ile 4 ° C&#39;de. </li><li> Tyrode çözeltisini Ca 2+ (bileşim mM cinsinden) ile hazırlayın: NaCl 136, KCl 5.4, NaH2PO4.33, MgCl2, glikoz 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0.9. 4 ° C&#39;de NaOH ile pH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın. </li><li> % 4 düşük eriyikli agaroz hazırlayın: Ca 2+ içermeyen 0.6 mL düşük eriyikli agaroz 15 mL Tyrode çözeltisine koyun. Karışımı, bir mikrodalga fırında iki kez 750 W&#39;de 10-15 saniye boyunca, agaroz çözünene kadar ısıtın. Çözeltiyi 37 ° C&#39;de sabit bir sıcaklıkta tutun.# 176; C ve sürekli karıştırın. </li><li> Dulbecco&#39;nun Değiştirilmiş Kartal Ortamını (DMEM) 37 ° C&#39;de serum olmadan carbogen (% 5 CO 2 ,% 95 O 2 ) ile kabarcıklarken muhafaza edin. </li></ol> 2. Microtome&#39;u hazırlayın <ol><li> Mikrogramı açın. </li><li> Dış mikrotom hücresini buzla doldurun. </li><li> İç mikrotom bölmesini, Ca 2+ içermeyen soğuk Tyrode çözeltisi ile doldurun ve çözeltiyi% 100 O 2 ile sürekli olarak oksijene koyun. </li><li> Mikro topuzun bıçak tutucusuna bir çelik bıçak takın. </li></ol> 3. Fare Kalp İzolasyonu <ol><li> 2,500 U Heparin&#39;i subkütan enjekte edin. 15 dakika bekleyin. </li><li> Hayvanı servikal dislokasyon ile kurban edin. </li><li> Sternotomi ile göğsünü açın. </li><li> Küçük makas ve bir forseps # 5 kullanarak perikardı dikkatle inceleyin. </li><li> Artan aortaya bir kanül yerleştirin ve koroner arterleri buz gibi soğuk Tyrode&#39;lerle in situ olarak perfüze edinKalan kan alınana kadar Ca 2+ içermeyen bir solüsyon. </li><li> Kalbi bir forseps ve makasla hafifçe kesip kalbi buz soğukluğunda transfer edin Tyrode&#39;nin çözümü Ca 2+ olmadan sürdü. </li><li> Atriyumu ventriküllerden bir neşter veya makasla ayırın. </li></ol> 4. Ventriküllerin% 4 Düşük Erime Agaroza Katılması <ol><li> Ventrikülleri, tepe kısmı yukarı bakacak şekilde agaroz kalıbına yerleştirin ( Şekil 1 ). Pimi sol ventriküler bölmedeki kalıbın ortasına yerleştirin. </li><li> Kalıbı, kalp tamamen kaplanıncaya kadar 37 ° C&#39;de% 4 düşük eriyikli agaroz ile doldurun. </li><li> Agarozun daha hızlı sertleşmesi için kalıbı buz üzerinde bırakın, dokunun yüzmesini önleyin. </li><li> Ventrikül içeren agaroz bloğu bir bistül ile kalıptan çıkarın. </li><li> Bloğu ters çevirin ve ventriküler odaları ve agaroz bloğun arkasındaki boşluğu doldurun;20 G&#39;lik bir iğneli bir şırınga kullanarak% 4 düşük eriyikli agaroz ile moltun iğnesi bıraktı. </li><li> Blok düz bir alt ve kalp apeksinin dik pozisyonunu elde etmek için agaroz bloğu bir neşter ile kesin. </li></ol> 5. Ventriküler Doku Dilimleme <ol><li> Bir damla cyanoacrylate tutkalı ile mikrotomun numune tutucusundaki bloğu sabitleyin. Kardiyak üstü yukarı bakacak şekilde tasarlayın. </li><li> Örnek tutucuyu, Ca 2+ içermeyen buz gibi soğuk Tyrode ile dolu mikrotomun iç numune bölmesine yerleştirin. Tyrode&#39;nin çözeltisiyle agaroz bloğu tamamen örtün. </li><li> Diğer uygulamalara (keskin elektrot kayıtları 150-200 μm için) bağlı olarak 150-400 μm kalınlığında kısa eksen dilimleri hazırlayın, bıçağın titreşim frekansı 60-70 Hz&#39;de tutun ve bıçağı mümkün olduğunca yavaş ileri hareket ettirin . </li><li> Kalan agarozu dilimlerden dikkatlice çıkarmak için ince bir fırça kullanın. </li><li> Nazikçe gönderR dilimleri,% 0.9 O 2 ile havalandırılan 0.9 mM Ca 2 + ile Tyrode solüsyonuna bir Pasteur pipet ile dilimleme prosedüründen kurtulmak için buz üzerinde en az 30 dakika saklayın. </li><li> Ardından, daha fazla kullanılmadan önce BDM&#39;yi yıkamak için 30 dakika süreyle DMEM&#39;de 37 ° C&#39;de dilimler bırakın, karbogenle havalandırın. </li></ol> 6. Keskin Elektrot Kurulumunun Hazırlanması <ol><li> Ön ısıtma için, kayıtların başlamasından 30 dakika önce tüm elektrikli cihazları açın. </li><li> Ters çevrilmiş mikroskopta yer alan ısıtma plakasına 3 cm&#39;lik hücre kültürü kabı koyun. </li><li> Özel yapım halka elektrotunu ( Şekil 2 ) çanağa yerleştirin ve ön amplifikatörün ve stimülasyon elektrodunun topraklama kablolarını bağlayın. </li><li> Perfüzyon sisteminin esnek borularını çanağa bağlayın. </li><li> Perfüzyon sisteminin rezervuarını karbogen ile havalandırılmış DMEM ile doldurun. </li><li> Perfüzyon pompasını açın ve perfüzyon rafini ayarlayın2-3 mL / dk&#39;ya kadar ısıtıldı. </li><li> Akış ısıtıcısını ve ısıtma plakasını düzenleyerek çanak içindeki DMEM sıcaklığını 37 ° C&#39;ye ayarlayın. </li></ol> 7. İşlem Potansiyel Kayıtları <ol><li> DMEM dolu tabağa bir ventriküler dilim yerleştirin. </li><li> Ters çevrilmiş mikroskop ile yapının yapısal bütünlüğünü ve yaşayabilirliğini kontrol edin (kontraktil fonksiyona dayanmaktadır). </li><li> Bir kayıt cam elektrodu 3 M KCL ile doldurun. </li><li> Bir uyarılma elektrotunu DMEM ile doldurun. </li><li> Kayıt elektrodunu ve stimülasyon elektrodunu elektrot tutucularının üzerine yerleştirin. </li><li> Uyarı elektrodunu dilim üzerine dikkatle yerleştirin ve elektrik stimülatörünü açın. 1-2 Hz&#39;lik bir stimülasyon frekansı ile başlayın. </li><li> Kayıt elektrodunu mikromanipülatör ile istenen kayıt pozisyonunun üzerine getirin. </li><li> İpucu dokuya dokunana kadar kayıt elektrodunu yavaşça indirin. </li><li> Şebekeden kısa dikdörtgen elektrik darbesi uygulayın.Kayıt elektrotu hücre zarı içine nüfuz eder. </li><li> Kayıt elektrodunu kararlı bir sinyal gelene kadar dikkatlice yeniden konumlandırın. </li><li> Aksiyon potansiyellerinin kaydını başlatın. </li></ol>

<ol><li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li>
<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).</li>
<li>Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+tissue+slices+as+a+tool+to+predict+metabolism+of+novel+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).</li>
<li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiopulmonary+toxicity+of+peat+wildfire+particulate+matter+and+the+predictive+utility+of+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices.</a> Part Fibre Toxicol. 11, 29(2014).</li>
<li>Nembo, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+chronotropic+effects+of+Erythrina+senegalensis+DC+%28Fabaceae%29+aqueous+extract+on+mouse+heart+slice+and+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).</li>
<li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+slices+from+adult+mammalian+hearts+as+a+model+for+pharmacological+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).</li>
<li>Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recordings+on+rat+cardiac+muscle+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices.</a> Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+heart+slices.+A+robust+model+to+study+ventricular+isometric+contractions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions.</a> Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts--a+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+maturation+and+integration+of+murine+fetal+cardiomyocytes+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation.</a> Circ. Res. 101, 484-492 (2007).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+electrophysiological+maturation+and+integration+of+transplanted+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+persistence+and+electrical+integration+of+transplanted+fetal+cardiomyocytes+from+different+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages.</a> Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+integration+and+action+potential+properties+of+transplanted+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).</li>
<li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2%2C3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li>
<li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li>
<li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage%3A+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek hiçbir şeyi yok.

Ventriküler dilimler, korunmuş bir in vivo doku yapısı ve ölçme teknolojisinin kalbin tüm bölgelerine doğrudan erişimi ile elektrofizyolojik, farmakolojik ve mekanik çalışmalara olanak tanır. Fizyolojik aksiyon potansiyel özellikleri embriyonik, neonatal ve erişkin dilimlerde gösterilmiştir 9,10,11. Dilimleme işlemi ile doğrudan hasar gören yüzey tabakaları haricindeki dilimlerin canlılığı, canlılık boyaması ile teyit edilmiştir 9 . Burada açıklandığı gibi transplanted kardiyomiyositleri...

Yamamot ve Mcllwain 1966&#39;da beyin dilimlerinin elektriksel aktivitesinin in vitro muhafaza edildiğini gösterdiklerinden beri temel bilimde ince doku dilimleri sıklıkla kullanılmıştır. O zamandan beri, beyin 2 , karaciğer 3 , akciğer 4 ve miyokard dokusu 5 , 6 , 7 dilimleri üzerinde elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar yürütülmüştür. Yenidoğan sıçan kalplerindeki ventriküler dilimlerde ilk yama-kelepçe kayıtları 1990&#39;da 8&#39;de tanımlanmıştır, ancak bu teknik bir süre unutulmaya uğradı. Birkaç yıl sonra grubumuz, fare embriyonik 9 , neonatal 10 ve erişkin 11 kalp dilimlerini hazırlamak için yeni bir yöntem geliştirdi. Bu canlı doku dilimleri akut deneyler için kullanılabilir (erişkin dilimS birkaç saat ekilebilir) veya kısa vadeli kültür deneyleri (embriyonik ve yenidoğan dilimleri birkaç gün boyunca yetiştirilebilir). Kesitler elektrofizyolojik özelliklere benzer şekilde in vivo olarak gösterirler ve keskin elektrot aksiyon potansiyeli ve mikro elektrot dizisi kayıtları ile değerlendirildiğinde homojen bir uyarılma yayılır 11 . &quot;İki boyutlu&quot; morfolojilerinden dolayı kayıt elektrotlarının ventrikülün tüm bölgelerine doğrudan erişmelerine izin veriyorlar, bu da elektrofizyolojik araştırmalar için ilginç bir araç haline getiriyor ve Langendorff tarafından perfüze edilmiş kalpler ile karşılaştırıldığında yeni deneysel seçenekler getiriyor. Dilimlerin verapamil (L-tipi Ca2 + -kanal bloke edicisi), lidokain (Na + -kanal bloke edicisi), 4-aminopiridin (seçici olmayan voltaja bağımlı K + -kanal bloke edici) ve linopirdin (KCNQ K) gibi ilaçların iyon tutucu etkisi + -kanal bloke edici) 9 , 11 </suP&gt; ayrışmış kardiyomiyositlerde bilinen etkilere karşılık gelmektedir. İzometrik kuvvet ölçümleri pozitif bir kuvvet frekansı ilişkisi ortaya koydu ve güçlü kasılma fonksiyonu önerdi10. Bu bulgular, sıçanın ventriküler dilimlerinin fizyolojik ve farmakolojik çalışmalar için in vitro bir doku modeli olarak uygun olduğunu göstermiştir. Ayrıca, kesici elektrot kayıtları ile birlikte alıcı kalplerin ventriküler dilimleri, transplanted fetal 12 , 13 , 14 ve kök hücre kaynaklı 15 kardiyomiyositlerin olgunlaşması yanı sıra elektriksel ve mekanik entegrasyonu karakterize etmek için çok yararlı bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Özetle, ventriküler dilimler değerli ve iyi kurulmuş bir çok hücreli doku modeli olup ayrışmış kardiyomiyositleri ve Langendorff perfüze edilen kalpler için tamamlayıcı olarak düşünülmelidir(Dissociated hücrelere karşıt olarak) bir in vivo benzeri doku yapısı sağlamanın yanı sıra keskin elektrot kayıtları gibi (kalp preparatlarının aksine) kalbin tüm bölgelerine doğrudan erişim sağlayan en büyük avantajı olan kardiyovasküler araştırmalardır.

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya</td><td></td><td>Titreşimli bıçaklı mikrotom.</td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Bıçaklar</td><td>Campden Instruments, Loughborough, İngiltere</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>İnce fırça, e. boyut 6 (4/32")</td><td>VWR, Uluslararası, Radnor, ABD</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>Hazırlık masası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ventrikülleri gömmek için kendi kendine yapılan Molt agaroz</td><td></td><td></td><td>kendi kendine yapılan</td></tr><tr><td>1 mL Şırınga</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, ABD</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4'' İğneler</td><td>Braun, Melsungen, Almanya</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2'' İğneler</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küçük makas</td><td>WPI, Sarasota, ABD</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız #5, 0,1 x 0,06 mm uç</td><td>WPI, Sarasota, ABD</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen gazı (tıbbi sınıf O2)</td><td>Linde, Münih, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbojen gazı (%95 O2, %5 CO2)</td><td>Linde, Münih, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</sub</td><td>>Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D (+)- Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Siyanoakrilat yapıştırıcı</td><td>Henkel, D&uuml; Sseldorf, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük eriyik Agarozu</td><td>Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-sodyum-25000 IE/5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), yüksek glikoz, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, ABD</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Amplifikatör</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Almanya</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük büyütmeli Mikromanipülatör</td><td>Narashige, Tokyo, Japonya</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek büyütmeli, üç eksenli mikromanipülatör</td><td>Narashige, Tokyo, Japonya</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik perfüzyon pompası</td><td>Çok Kanallı Sistemler, Reutlingen, Almanya</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2 kanallı sıcaklık kontrol cihazı</td><td>Çok Kanallı Sistemler, Reutlingen, Almanya</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>Kare nabız stimülatörü</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Almanya</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal damarlar</td><td>WPI, Sarasota, ABD</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrofizyolojik Çalışmalar İçin murin kısa eksenli ventriküler kalp dilimleri

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Fare kardiyomiyositleri , in vitro kardiyak fizyoloji çalışmaları ve yeni tedavi stratejileri için yoğun şekilde kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ayrışmış kardiyomiyositlerin çok hücreli preparatları, kalbin hem mekanik hem de elektrofizyolojik özelliklerini etkileyen kardiyomiyositlerin, miyositlerin ve hücre dışı matrisin in vivo yapısının kompleksini temsil etmez. Burada, korunmuş in vivo doku yapısı ile yetişkin fare kalplerindeki canlı ventriküler dilimleri hazırlamak için bir teknik ve elektrofizyolojik kayıtlara uygunluğunu göstermek için bir teknik açıklanmaktadır. Kalbin eksizyonundan sonra, ventriküller atriyumdan ayrılır, 2,3-butandion monoksim içeren Ca2 + içermeyen çözelti ile perfüzyonlanır ve% 4&#39;lük düşük eriyikli agaroz blok içine gömülür. Blok titreşen bir bıçakla mikrotom üzerine yerleştirilir ve 150-400 μm kalınlığa sahip doku dilimleri titreşimi serbest bırakarak hazırlanır60 Hz&#39;de bıçak sıklığı ve bıçağı mümkün olduğunca yavaş ileri hareket ettirerek. Dilimlerin kalınlığı diğer uygulamalara bağlıdır. Dilimler buz soğukluğundaki Tyrode çözeltisinde 0.9 mM Ca 2+ ve 2,3-butandion monoksim (BDM) ile 30 dakika süreyle saklanır. Ardından, BDM&#39;yi yıkamak için dilimler 37 ° C DMEM&#39;ye 30 dakika boyunca aktarılır. Dilimler, kesici elektrodlar veya mikro elektrot dizileri ile elektrofizyolojik çalışmalar için, kontraktil fonksiyonu analiz etmek için güç ölçümleri için veya nakledilen kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin ve konakçı doku arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılabilir. Keskin elektrot kayıtları için, bir dilim, ters çevrilmiş mikroskopun ısıtma plakasındaki 3 cm&#39;lik hücre kültürü çanağına yerleştirilir. Dilim bir tek kutuplu elektrot ile uyarılır ve dilim içindeki kardiyomiyositlerin hücre içi eylem potansiyelleri keskin bir cam elektrot ile kaydedilir.

Miyokard enfarktüsü kardiyomiyositlerin neredeyse geri döndürülemez bir kaybına yol açar. Eksojen kardiyak rejenerasyon için kök hücre kaynaklı kardiyomiyositleri kullanarak hücre replasman tedavisi umut verici bir tedavi yaklaşımıdır. Transplante hücrelerin elektriksel entegrasyonu ve olgunlaşması, hücre replasman tedavisinin güvenilirliği ve etkinliği için çok önemlidir. Entegrasyon ve olgunlaşmayı değerlendirmek için yetişk...

Burada, yetişkin farelerden canlı ventriküler dilimlerin hazırlanmasını ve keskin elektrodun hareket potansiyel kayıtları için kullanımlarını açıklıyoruz. Bu çok hücreli müstahzarlar , in vitro olarak elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar için değerli bir model oluşturan, korunmuş bir in vivo doku yapısı sağlar.

Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Murin Kısa Eksenli Ventriküler Kalp Dilimleri

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

Bu tekniğin genel amacı, elektrofizyolojik kayıtlar için uygun olan canlı ventriküler kalp dilimleri elde etmektir. Bu yöntem, nakledilen kardiyomyositlerin elektriksel entegrasyonu veya kardiyoaktif ilaçların etkileri gibi, doku düzeyindeki kardiyak elektrofizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı ventriküler doku dilimlerinin in vivo benzeri korunmuş bir doku yapısına sahip olması ve kalbin tüm bölgelerinde doğrudan ölçümlere olanak sağlamasıdır.Bu yöntem fare kalp elektrofizyolojisi hakkında bilgi sağlayabilse de tavşan veya cırcıv gibi diğer hayvanlara da uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için öncelikle hayvanın cildini %70 etanol ile silin. Toraksı açtıktan sonra, küçük makas ve pensler kullanarak kalbin perikardiyumunu dikkatlice diske edin.Sol ventriküle bir kanül yerleştirin ve geri kalan kan tamamen uzaklaşana kadar kalbi in situ olarak buz gibi soğuk, kalsiyumsuz Tyrode çözeltisi ile perfüze edin. Ardından kalbi nazikçe rezekte edin ve buz gibi soğuk, kalsiyumsuz Tyrode çözeltisine transfer edin. Atriyumları bir skalpel veya makas yardımıyla ventriküllerden ayırın.Ardından, ventrikülleri apeks kısmı yukarı bakacak şekilde agaroz kalıbına yerleştirin. Sonrasında, pini kalıbın ortasına ve sol ventrikül boşluğuna yerleştirin. Kalıbı, kalp tamamen örtülene kadar 37 °C'deki %4'lük düşük erime noktalı agaroz ile doldurun.Ardından, dokunun yüzmesini önlemek için agarozun daha hızlı sertleşmesi amacıyla kalıbı buza yerleştirin. Bir dakika sonra, ventrikülleri içeren agaroz bloğunu bir bisturi yardımıyla kalıptan çıkarın. Bundan sonra, bloğu ters çevirin ve ventrikül boşlukları ile agaroz bloğunun arka tarafındaki boşluğu bir şırınga kullanarak %4'lük düşük erime noktalı agaroz ile doldurun.Ardından, düz bir taban elde etmek ve kardiyak apeksin dik konumda olmasını sağlamak için agaroz bloğu bir bistüri ile düzeltin. Bu işlemde, bloğu, kardiyak apeks yukarı bakacak şekilde bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı ile mikrotomun numune tutucusuna sabitleyin. Daha sonra, numune tutucuyu mikrotomun kalsiyum içermeyen buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi ile dolu olan iç numune haznesine yerleştirin.Agaroz bloğunun Tyrode solüsyonu ile tamamen kaplandığından emin olun. Sonraki uygulamaya bağlı olarak, dilimleri 150 ila 400 µm kalınlığında hazırlayın. Bıçağın titreşim frekansını 60 ila 70 Hz seviyesinde tutun ve bıçağı mümkün olduğunca yavaş bir şekilde ileri hareket ettirin.Ardından, dilimler üzerindeki kalan agarozu dikkatlice temizlemek için ince bir fırça kullanın. Sonrasında, dilimleri bir Pasteur pipeti ile 0,9 milimolar kalsiyum içeren ve %100 oksijen ile havalandırılmış Tyrode solüsyonuna nazikçe aktarın. Dilimleme işleminden sonra toparlanmaları için onları buz üzerinde en az 30 dakika bekletin.Kesitlerin bir ağ üzerine yerleştirilmesi, düz kalmalarına yardımcı olur. Ardından, daha sonraki kullanımlar öncesinde BDM'yi yıkamak için kesitleri, 37 °C'de, karbogen ile havalandırılmış DMEM içerisine aktarmak için bir filtre kağıdı ve ikinci bir ağ kullanın. Ön ısıtma için, tüm elektrikli cihazları kayıtların başlamasından 30 dakika önce açın.Isıtma plakalı üç santimetrelik bir hücre kültürü kabını ters mikroskobun üzerine yerleştirin. Ardından, özel yapım halka elektrodu kabın içine yerleştirin; preamplifikatörün ve stimülasyon elektrodunun topraklama kablolarını bağlayın. Bundan sonra, perfüzyon sisteminin esnek tüplerini kaba bağlayın.Perfüzyon sisteminin rezervuarını DMEM ile doldurun ve karbogen ile havalandırın. Ardından perfüzyon pompasını çalıştırın ve perfüzyon hızını dakikada iki ila üç mililitreye ayarlayın. Akış ısıtıcısını ve ısıtma plakasını düzenleyerek, kap içindeki DMEM sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.Şimdi, bir ventriküler kesiti DMEM ile doldurulmuş petri kabına yerleştirin. Ters mikroskop ile dokunun yapısal bütünlüğünü ve canlılığını kontrol edin. Ardından, bir kayıt cam elektrodunu üç molar potasyum klorür ile ve bir stimülasyon elektrodunu DMEM ile doldurun.Ardından, kayıt elektrodunu ve stimülasyon elektrodunu elektrot tutuculara yerleştirin. Sonrasında, stimülasyon elektrodunu dikkatlice kesitin üzerine yerleştirin. Elektrik stimülatörünü açın ve bir ila iki Hertz stimülasyon frekansı ile başlayın.Ardından, kayıt elektrodunu bir mikromanipülatör yardımıyla hedeflenen kayıt konumuna getirin. Kayıt elektrodunun ucu dokuya değene kadar elektrodu yavaşça aşağı indirin. Kayıtla temas algılandığında, hücre membranını penetre etmek için kayıt elektrodu aracılığıyla kısa bir dikdörtgen elektrik darbesi uygulayın.Ardından, kararlı bir sinyal elde edilene kadar kayıt elektrodunu dikkatlice yeniden konumlandırın. Bunu takiben, aksiyon potansiyellerinin kaydına başlayın. Entegrasyonu ve maturasyonu değerlendirmek için, eGFP eksprese eden iPSCM'lerden türetilen kardiyomiyositler, yetişkin farelerin sağlıklı kalplerine nakledildi.Burada, konak dokuya yerleştirilmiş tek kutuplu bir elektrot ile bölgesel olarak uyarılmış, nakledilmiş iPSCM içeren bir ventriküler kalp kesiti gösterilmektedir. Hücre içi aksiyon potansiyelleri, üç molar potasyum klorür ile doldurulmuş keskin cam mikroelektrotlar kullanılarak eGFP-pozitif nakledilmiş iPSCM'lerden ve kesitler içindeki komşu konak dokudan kaydedilmiştir. Sağlıklı konak dokudaki ve nakledilmiş iPSCM'deki aksiyon potansiyeli kayıtları burada sunulmuştur.Kesit, konak dokusuna yerleştirilen bir stimülasyon elektrodu ile yaklaşık iki Hertz ve beş Hertz değerlerinde fokal olarak stimüle edildi. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde bir ila iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, mikrotom bıçağının ilerleme hızının mümkün olduğunca düşük tutulmasının önemli olduğu unutulmamalıdır.Bu prosedürün ardından, ek soruları yanıtlamak amacıyla ilk ölçümler gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, hücre tedavisi alanındaki araştırmacıların, alıcı kalplerdeki transplant edilen kardiyomiyositlerin elektriksel entegrasyonunu ve olgunlaşmasını keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, titreşimli bıçaklı bir mikrotom kullanarak canlı ventriküler kısa eksen dilimlerinin nasıl hazırlanacağı konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu kesitler, özellikle keskin cam elektrotlar kullanılarak yapılan elektrofizyolojik kayıtlar için uygundur.

murine-short-axis-ventricular-heart-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Yüksek frekans Doppler ultrason bölgesel miyokard fonksiyonunu değerlendirmek için yeni bir teknoloji. Bu çalışma, miyokard gerilme, iskemi-Reperfüze (IR) fare kalp dp / dt ve mitral yetersizliği tekrarlanan ölçümler için bu çok yönlü bir görüntüleme platformu uygulanabilirliği gösteren ilk kanıt sunmaktadır.

Yüksek frekanslı Yüksek çözünürlüklü Ekokardiyografi: İskemi-Reperfüze murin Kalp Miyokard Strain, kontraktilite ve Mitral Yetmezliğinde Non-invaziv Tekrarlanan Ölçüm İlk Kanıt

Cerrahi travma inflamatuvar yanıt indükler. Sitokinler ve endojen ligand iskemi ve reperfüzyon sonrası miyokard infarkt modüle bilinmektedir. Biz torakotomi etkilerini en aza indirmek için asılı ağırlıklar kullanılarak murin iskemi ve reperfüzyon değiştirilmiş bir kapalı göğüs modeli sunuyoruz.

Miyokard İskemi ve Reperfüzyon bir Mürin Kapalı göğüs Modeli

Bu videoda, domuz kalbinin canlı, ultra ince kesitlerini oluşturmak için vibratom tabanlı bir prosedür gösterilmektedir. Hazırlanan doku dilimleri kültürlenebilir ve farmakolojik testler için model sistemler olarak kullanılabilir.

Domuz Ventriküler Dilimlerinin Oluşturulması: Ultra İnce Domuz Kalp Dokusu Dilimleri Hazırlamak İçin Vibratom Bazlı Bir Teknik

Biz genç farelerde omurilik eğik dilim nasıl hazırlanacağını göstermektedir. Bu preparat, ventral köklerin uyarılması için izin verir.

Ventral Kök Stimulation için eğik Omurilik Dilimleri hazırlanması

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Bu protokol, 6 gün boyunca fizyolojik koşullar altında kalp dokusunun nasıl dilimlenir ve kültürlenir. Bu kültür sistemi yeni kalp yetmezliği terapötik etkinliğini test etmek için bir platform olarak yanı sıra bir 3D kalp modelinde akut kardiyotoksisite güvenilir test olarak kullanılabilir.

Fizyolojik Koşullar altında Domuz Kalpleri Dilimleme ve Culturing

Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg'a kadar) az miktarda dokudan (&lt;50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Karmaşık anatomi nedeniyle, kardiyak örnekler için sürekli tekrarlanabilir bir diseksiyon ve hasat protokolünün uygulanması zor olabilir. Bu yazıda bazı standart kardiyak diseksiyon protokollerinin temel unsurları sunulmakta ve hem brüt inceleme yaklaşımları hem de histopatolojik inceleme için yaygın olarak kullanılan örnekleme alanları vurgulanmaktadır.

Diseksiyon Teknikleri ve Kardiyovasküler Hastalıklar için Büyük Hayvan Modellerinde Kalbin Histolojik Örneklemesi

İnsan ventriküler miyokard dokusunun ex vivo ekimi için bir protokol sunuyoruz. Kasılma kuvveti ve kinetiğin ayrıntılı analizinin yanı sıra, in vivo fizyolojik ortamı daha yakından taklit etmek için ön ve son yükün uygulanmasına izin verir.

Uzun Süreli Yetiştirme için İnsan Miyokard Dokusunun Hazırlanması

Öğrenin murin ventriküler kalp dilimleri hazırlama tekniğini elektrofizyolojik kayıtlar için. Bu yöntem, nakledilen kardiyomiyositlerin elektriksel entegrasyonunu ve kardiyoaktif ilaçların etkilerini incelemeye olanak tanır.

Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Murin Kısa Eksenli Ventriküler Kalp Dilimleri

Daha fazla video keşfet