Name: Glikoz Alımı Ölçümü ve İnsülin Uyarıcısına Yanıt In vitro Kültürlü İnsan Primer Miyotları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Öğrenin insülin uyarımlı glikoz alımını insan primer miyotlarında ölçme yöntemini. Bu teknik, kas metabolizması ve insülin duyarlılığı araştırmalarında hormonal yanıtları nicel olarak değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Radiobiyoloji servisindeki (Lyon-Sud hastanesi) Anne Charrié&#39;yi ve maddi desteklerinden dolayı Fond National Suisse&#39;yi (FNS) onaylarlar.

1. Hücre Kültürü Ortamlarının ve Çözümlerinin Hazırlanması <ol><li> Kültür ortamının hazırlanması <ol><li> Ham&#39;in F-10 ortamını glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL final),% 2 Fetal Buzağı Serumu (FCS) ve% 2 serum replasmanı ile takviye ederek çoğalma ortamı hazırlayın. </li><li> Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL son) ve% 2 FCS ile takviye ederek farklılaşma ortamı (DM) hazırlayın. </li></ol></li><li> Glikoz alım çözümlerinin hazırlanması Dikkat: Radyoaktif maddenin taşınmasına yalnızca sınırlı ve kontrollü bir alanda yetkili personel tarafından izin verilmektedir. Malzeme ve atıklar, uygun prosedürlere, kılavuzlara ve yerel mevzuata uygun olarak ele alınmalıdır. <ol><li> X-Dulbecco fosfat tamponlu salin (X-DPBS) hazırlamak için,% 0.2 (w / v) (son konsantrasyon) sığır serumu alb içeren bir DPBS solüsyonu hazırlayınUmin (BSA). Çözeltiyi 0.2 um&#39;lik bir filtreden geçirin. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Soğuk 2-deoksi-D-glikoz (2dG) solüsyonu hazırlamak için 16.4 mg 2dG&#39;yi tartın ve 10 mM&#39;lik bir çözelti elde etmek için 10 mL damıtılmış suda çözünürleştirin. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Radyoaktif olarak işaretlenmiş 2dG (2dG *) çözeltiyi elde etmek için 600 μL soğuk 2dG ve 6 μL radyoaktif işaretlenmiş [3H] 2dG&#39;yi 5400 μL X-DPBS&#39;ye ekleyin. NOT: Nihai konsantrasyon 1 mM 2dG&#39;dir ve etiketleme 1 mcC / mL&#39;dir. <ol><li> Radyoaktif olarak işaretlenmiş 2dG * solüsyonundan 20 μL&#39;lik bir alikot (TC20) ayırın. </li></ol></li></ol></li><li> Kuluçka karışımlarının hazırlanması <ol><li> Sitokalasin B karışımı için, 2 mL radiolabeled 2dG * solüsyonuna 2 mcL 20 mM sitokalazin B ilave edin. NOT: Sitokalasin B stok solüsyonu dimetil sülfoksid (DMSO) içinde 10 mg / mL&#39;dir. </li><li> DMSO karışımı için kalan 4 mL radyoaktif işaretlenmiş 2dG * çözeltisine 4 uL DMSO ekleyin. </li></ol&gt; </li></ol> 2. İnsan Primer Kas Hücrelerinin Kültürü <ol><li> İnsan kaslı uydu hücreleriyle 6 oyuklu plakaların tohumlanması NOT: Dondurulmuş bir flakondan (250.000 hücre içeren) ticari olarak temin edilebilen insan kaslı uydu hücrelerini şirket içinde kullanın (bkz. Referans 24 ). Tek bir durumda glikoz alımının ölçümü için gerekli olan bir 6 kuyulu plaka elde etmek için aşağıdaki prosedür 250,000 hücre için verilmiştir. <ol><li> İçinde 24 bulunan donmuş flakonları veya önceden hazırlanmış ılık suda (37 ° C) insan kas uydu hücrelerinin ticari preparatlarını flakona sadece küçük bir buz bloğu kalana kadar hızla çözdürür. </li><li> Doğrudan 10 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) PM içeren 50 mL&#39;lik bir plastik tüp içine dökün. </li><li> 500 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı atın. </li><li> Hücre pelletini, önceden ısıtılmış PM&#39;nin 18 mL&#39;si ile hafifçe tekrar süspanse edin (her biri 42.000 hücre elde etmek için3 mL orta). 6 oyuklu bir plakanın (9.6 cm2) her oyuğuna 3 mL dağıtın. NOT: Bir plakanın altı ayrı oyuğu, pasif nakil inhibisyonu (kuyucuk 1 ve 2), bazal hız (kuyu 3 ve 4) ve insülinle uyarılan hız (kuyular 5 ve 6). Farklı tedavilere ihtiyaç duyulduğundan altı kuyucuklu plakaları tekrarlayın. </li><li> Hücreler% 90 konfluansa erişene kadar standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin. NOT: Bu adım, hücre partisine bağlı olarak 48 - 72 saat arasında sürer. Bu adımda orta maddeyi değiştirmeyin. </li></ol></li><li> Kas hücrelerinin farklılaşması <ol><li> PM&#39;yi alın (48-72 saat sonra) ve önceden ısıtılmış DM (kuyucuk başına 3 mL) ile değiştirin. 37 ° C&#39;de,% 5 C02&#39;de inkübe edin. NOT: Farklılaşma, hücrelerin hizalanması ve polinükleer hale getirildiği istikrarlı bir duruma erişmek için beş gün sürer. Tipik olarak birincilMiyotüpler, 1 g / L glikoz ortamında kültürlenir. Bu nedenle, kültür esnasında şeker tükenmesini önlemek için, yeterli glikoz substratının her zaman hücreler için mevcut olduğundan emin olmak için plakayı 3 mL ortam ile doldurun. </li><li> DM ortamını iki günde bir değiştirin. NOT: Bu noktadan itibaren, miyotüpler önemli bir değişiklik olmaksızın 7 gün boyunca kararlıdır ve glikoz alım ölçümleri her an yapılabilir. </li></ol></li><li> Kas hücresi tedavisi (opsiyonel) NOT: Birincil miyotürler, insülin uyarımı ve glikoz alım ölçümlerinden önce modifikasyon (uyuşturucu testi, sinyal yolunun inhibitörleri / aktivatörleri vs. ) uyandırmak için birkaç gün tedavi edilebilir. Kas hücreleri insülin hassasiyetini etkileyebilecek her tedaviye tabi tutulabilir ve glikoz alım ölçümleri bu etkiyi nicelleştirir. Örneğin, kas hücrelerinin doymuş yağlı asit palmitat ile kuluçkalanması insülin direncini arttırır ve hücreler azaltılmış iNsulin, glikoz alımını uyarmıştır. <ol><li> % 10 BSA (yağ asidi içermeyen) ve 0.5 mL palmitat (PALM) ile desteklenmiş 12 mL DM hazırlayın. Sadece% 10 BSA (yağ asidi içermeyen) ile desteklenmiş 12 mL DM hazırlayın. </li><li> İnsan primer miyotları ile iki 6 oyuklu levha hazırlayın ve bölümler 2.1 ve 2.2&#39;de (5 günlük farklılaşma ile) açıklandığı gibi kültürleyin. </li><li> 5. günde, her oyuğu 2 mL PBS ile yıkayın. Bir tabağa, PALM içeren 2 mL DM ekleyin. Diğer plakaya yalnızca DM içeren 2 mL BSA ilave edin. </li><li> 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 C02&#39;de inkübe edin. </li></ol></li></ol> 3. İnsülin Uyarımı <ol><li> Farklılaşmış kas hücrelerini iki kez 2 mL PBS ile yıkayın. </li><li> PBS&#39;yi dikkatlice çıkarın ve serum tükenmesi için 3 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO 2 ) FCS içermeyen 3 mL DM ile inkübe edin. </li><li> Tüm kuyularda bulunan ortamları FCS içermeyen 3 mL DM ile değiştirin. Kuyu 5 ve 6&#39;ya 100 nM insülin ekleyin. </li><li> Için insan miyotüp kültürü kuluçkalayın1 saat (37 ° C,% 5 C02). </li></ol> 4. Glikoz Alımı <ol><li> 1 saatlik insülin stimülasyonundan sonra, oyukları X-DPBS ile yıkayın (yıkama başına 1 mL). </li><li> 1 mL sitokalazin B karışımı kuyu 1 ve 2&#39;ye ve 1 mL DMSO karışımı çukurlara 3 - 6 ekleyin. 15 dakika inkübe edin (37 ° C,% 5 CO 2 ). Kuluçka işleminin sonunda, plakayı derhal buzda bekletin. </li></ol> 5. Hücre Lizizi <ol><li> Hücreleri 1 mL buz soğukluğundaki PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Hücreleri, 600 uL 50 mM NaOH ile her oyukta Lyse. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve yavaş yavaş yörünge dönüşü ile karıştırın. NOT: Lizat çok yapışkan ise, 1.5 mL NaOH ile seyreltin. </li><li> Bir pipet kullanarak, tekrar askıda bırakın ve hücre lizatını toplamayın. </li></ol> 6. Radyolabellenmiş Glikoz Tayini <ol><li> Bir sıvı sintilasyon sayma flakonda her bir hücre lizatı 400 mcL koyun. 400 ile negatif kontrol flakonu hazırlayın50 mM NaOH&#39;nin 50 uL&#39;si ve 20 uL TC20 ile pozitif bir kontrol şişesi (basamak 1.2.3.1&#39;den). </li><li> Her flakona 4 mL sıvı sintilasyon solüsyonu ilave edin. Kapağı kapatın ve her şişeyi iyice karıştırın (1-2 s). </li><li> Her şişeyi bir sıvı sintilasyon sayacına yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre radyoaktiviteyi ölçün. Her sintilasyon flakonu için 10 dk için dakika başına rekor (BGBM) kaydedin. NOT: CPM = &quot;dakika başına parçalanma&quot; x &quot;sayım verimliliği&quot;. </li></ol> 7. Glikoz Alım Oranı <ol><li> Kalan lizatı (200 uL, adım 5.2&#39;den itibaren) protein konsantrasyonunu ölçmek için kullanın. Her hücre lizatının protein konsantrasyonunu Bradford 25 veya eşdeğer bir yöntem kullanarak belirleyin. Her kuyu için toplam protein miktarını (Q) mg cinsinden hesaplayın. </li><li> TC1 (1 μL radyoaktif işaretli 2dG * değeri) elde etmek için, TC20&#39;nin BGBM değerini 20&#39;ye bölün. </li><li> Her şişe için tGlikoz alımı oranı şu şekildedir: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq1.jpg" /> NOT: R, pmol / mg / dak olarak ölçülür. Kuyular 1 - 2 için R ortalaması, pasif nakliye oranını, R p&#39;yi verir . 3-4 kuyu için R ortalaması, bazal toplam nakliye oranını, Rbt&#39;yi verir . Kuyular 5-6 için R değeri, insülinle uyarılan toplam nakil oranını verir, R it . <ol><li> Bazal aktif nakil oranını (R ba ) aşağıdaki gibi hesaplayın: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq2.jpg" /></li><li> İnsülin ile uyarılan aktif aktarım hızını ( Rıa ) aşağıdaki gibi hesaplayın: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq3.jpg" /> NOT: Miyotüpler gibi insüline duyarlı hücrelerde, glikoz alım hızı genellikle üç değerle temsil edilir: R ba , Rıa ve kat insülin uyarımı Rıa / R ba olarak . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+syndrome%3A+role+of+skeletal+muscle+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism.</a> Ann Med. 38 (6), 389-402 (2006).</li>
<li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+clamp+technique%3A+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).</li>
<li>Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+sensitivity+relates+to+other+cardiovascular+risk+factors+in+young+men%3A+validation+of+some+modifications+of+the+hyperinsulinaemic%2C+isoglycaemic+glucose+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Press+Suppl%22%5BJournal%5D)">Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique.</a> Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).</li>
<li>Heise, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euglycaemic+glucose+clamp%3A+what+it+can+and+cannot+do%2C+and+how+to+do+it%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes+Metab%22%5BJournal%5D)">Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it.</a> Diabetes Obes Metab. 18 (10), 962-972 (2016).</li>
<li>Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+insulin+sensitivity+in+skeletal+muscle+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro.</a> Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).</li>
<li>Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+in+human+skeletal+muscle+cells+in+culture.+Stimulation+by+insulin+and+metformin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin.</a> J Clin Invest. 90 (4), 1386-1395 (1992).</li>
<li>Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+uptake+in+human+and+animal+muscle+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture.</a> Biochem Cell Biol. 68 (2), 536-542 (1990).</li>
<li>Richter, E. A., Hargreaves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise%2C+GLUT4%2C+and+skeletal+muscle+glucose+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake.</a> Physiol Rev. 93 (3), 993-1017 (2013).</li>
<li>Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+model+system+of+differentiated+human+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Apmis%22%5BJournal%5D)">A cellular model system of differentiated human myotubes.</a> Apmis. 109 (11), 735-744 (2001).</li>
<li>Bouzakri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+activation+of+phosphatidylinositol-3+kinase+and+increased+serine+636+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate-1+in+primary+culture+of+skeletal+muscle+cells+from+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (6), 1319-1325 (2003).</li>
<li>Scheele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+derived+from+obese+humans+with+type+2+diabetes+and+differentiated+into+myocytes+in+vitro+exhibit+abnormal+response+to+IL-6%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6.</a> PLoS One. 7 (6), e39657(2012).</li>
<li>Jackson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+insulin+responsiveness+of+glucose+uptake+in+cultured+human+skeletal+muscle+cells+from+insulin-resistant+nondiabetic+relatives+of+type+2+diabetic+families%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families.</a> Diabetes. 49 (7), 1169-1177 (2000).</li>
<li>Aas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+cultured+human+myotubes+far+from+home%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Are cultured human myotubes far from home?</a> Cell Tissue Res. 354 (3), 671-682 (2013).</li>
<li>Bakke, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotubes+from+severely+obese+type+2+diabetic+subjects+accumulate+less+lipids+and+show+higher+lipolytic+rate+than+myotubes+from+severely+obese+non-diabetic+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects.</a> PLoS One. 10 (3), e0119556(2015).</li>
<li>Stuart, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexose+transporter+mRNAs+for+GLUT4%2C+GLUT5%2C+and+GLUT12+predominate+in+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (5), E1067-E1073 (2006).</li>
<li>Al-Khalili, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+action+in+cultured+human+skeletal+muscle+cells+during+differentiation%3A+assessment+of+cell+surface+GLUT4+and+GLUT1+content%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content.</a> Cell Mol Life Sci. 60 (5), 991-998 (2003).</li>
<li>Tsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+insulin-induced+glucose+uptake+in+C2C12+myotubes+by+osteocalcin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin.</a> Biochem Biophys Res Commun. 459 (3), 437-442 (2015).</li>
<li>Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subetta+Enhances+Sensitivity+of+Human+Muscle+Cells+to+Insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin.</a> Bull Exp Biol Med. 159 (4), 463-465 (2015).</li>
<li>Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+muscle+cell+glucose+uptake+by+resveratrol+through+sirtuins+and+AMPK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 374 (1), 117-122 (2008).</li>
<li>Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stearoyl+CoA+desaturase+1+is+elevated+in+obesity+but+protects+against+fatty+acid-induced+skeletal+muscle+insulin+resistance+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro.</a> Diabetologia. 49 (12), 3027-3037 (2006).</li>
<li>Gastebois, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+physical+activity+to+inactivity+increases+skeletal+muscle+miR-148b+content+and+triggers+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance.</a> Physiol Rep. 4 (17), (2016).</li>
<li>Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+skeletal+muscle+glucose+uptake+by+rosemary+extract+through+AMPK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 40 (4), 407-413 (2015).</li>
<li>Feng, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARdelta+activation+in+human+myotubes+increases+mitochondrial+fatty+acid+oxidative+capacity+and+reduces+glucose+utilization+by+a+switch+in+substrate+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference.</a> Arch Physiol Biochem. 120 (1), 12-21 (2014).</li>
<li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+myotubes+display+a+cell-autonomous+circadian+clock+implicated+in+basal+myokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion.</a> Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Bouzakri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malonyl+CoenzymeA+decarboxylase+regulates+lipid+and+glucose+metabolism+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle.</a> Diabetes. 57 (6), 1508-1516 (2008).</li>
<li>Shemyakin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+reduces+glucose+uptake+in+human+skeletal+muscle+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro.</a> Diabetes. 60 (8), 2061-2067 (2011).</li>
<li>Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+phases+of+palmitate-induced+insulin+resistance+in+skeletal+muscle%3A+impaired+GLUT4+translocation+is+followed+by+a+reduced+GLUT4+intrinsic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (3), E783-E793 (2007).</li>
<li>Coll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleate+reverses+palmitate-induced+insulin+resistance+and+inflammation+in+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells.</a> J Biol Chem. 283 (17), 11107-11116 (2008).</li>
<li>Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+utilization+of+saturated+palmitate+and+unsaturated+oleate%3A+evidence+from+cultured+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes.</a> Diabetes. 54 (3), 648-656 (2005).</li>
<li>Hage Hassan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+does+not+mediate+palmitate-induced+insulin+resistance+in+mouse+and+human+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells.</a> Diabetologia. 55 (1), 204-214 (2012).</li>
<li>Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+knockdown+alleviates+palmitate-induced+insulin+resistance+in+C2C12+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 460 (4), 977-982 (2015).</li>
<li>Hommelberg, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate-induced+skeletal+muscle+insulin+resistance+does+not+require+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (7), 1215-1225 (2011).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+fatty+acid+palmitate-induced+insulin+resistance+is+accompanied+with+myotube+loss+and+the+impaired+expression+of+health+benefit+myokine+genes+in+C2C12+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes.</a> Lipids Health Dis. 12, 104(2013).</li>
<li>Peng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleate+blocks+palmitate-induced+abnormal+lipid+distribution%2C+endoplasmic+reticulum+expansion+and+stress%2C+and+insulin+resistance+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle.</a> Endocrinology. 152 (6), 2206-2218 (2011).</li>
<li>Lambernd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+activity+of+human+skeletal+muscle+cells+prevents+insulin+resistance+by+inhibiting+pro-inflammatory+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways.</a> Diabetologia. 55 (4), 1128-1139 (2012).</li>
<li>Nikolic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+pulse+stimulation+of+cultured+human+skeletal+muscle+cells+as+an+in+vitro+model+of+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise.</a> PLoS One. 7 (3), e33203(2012).</li>
<li>Hsu, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antidiabetic+effects+of+pterosin+A%2C+a+small-molecular-weight+natural+product%2C+on+diabetic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models.</a> Diabetes. 62 (2), 628-638 (2013).</li>
<li>Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-NBDG+as+a+fluorescent+indicator+for+direct+glucose+uptake+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement.</a> J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).</li>
<li>Catalano, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+induced+by+hyperinsulinemia+coincides+with+a+persistent+alteration+at+the+insulin+receptor+tyrosine+kinase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain.</a> PLoS One. 9 (9), e108693(2014).</li>
<li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+is+a+stronger+inducer+of+insulin+resistance+than+hyperglycemia+in+mice+with+type+1+diabetes+mellitus+%28T1DM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM).</a> J Biol Chem. 284 (40), 27090-27100 (2009).</li>
<li>Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+induced+by+high+glucose+and+high+insulin+precedes+insulin+receptor+substrate+1+protein+depletion+in+human+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes.</a> Metabolism. 56 (2), 190-198 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Glukoz alımı, hücre kültürü üzerindeki aktivatörleri veya inhibitörleri test etmek için önemli biyolojik bir ölçümdür ve glikoz kullanımını nasıl etkilediği ve hücrenin insüline cevap verme yeteneği. Burada açıklanan yöntemin hızlı ve güvenilir olduğu gösterilmiştir ve sağlıklı kişilerden ve / veya metabolik olarak etkilenen hastalardan alınan primer miyotları kullanan birçok çalışmada yaygın olarak kullanılmaktadır 6,7,10,12,21,26,27,36,37. Sadece bir 6 kuyucuklu plaka ile, toplam bazal nakil, bazal aktif nakliye ve in...

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Bu insülin yanıt veren doku, insülin stimülasyonu 1 tarafından tetiklenen glikoz alımının birincil bölgesidir. Tip 2 diyabette, iskelet kası da dahil olmak üzere çeşitli dokularda insülin direnci gözlenir ve normal kan şekeri konsantrasyonunun üstünde seyreder. Bu nedenle, bir öznedeki bir kusurun karakterize edilmesine mi yoksa iyileştirmek isteyen bir tedavinin verimliliğini değerlendirmeye mi götürmesi gerektiği gibi, bu dokunun ve hücrelerinin insülin duyarlılığının seviyesinin belirlenmesi büyük önem taşır. Insan ya da hayvan konularda, insülin duyarlılığını değerlendirmek için altın standart tekniği, hiperinsülinemik-öglisemik klipstir. DeFronzo tarafından 1979 2&#39;de tanıtıldı ve 3 , 4&#39;den sonra değiştirildi, yöntem tüm vücudu a veDokular insülin tepkisi, normal kan şekeri konsantrasyonunu korumak için insülin uyarımı altında perfüze edilecek glikoz oranı olarak ölçülmüştür. İnsülin duyarlılığı araştırması, in vitro kas modelleri kullanılarak hücre seviyesinde de yapılabilir ve glikoz alım oranlarının ölçümü, hücrenin insülin stimülasyonuna biyolojik tepkisini ölçmek için etkin ve güvenilir bir araç olarak kalır 5 , 6 , 7 . Aslında, glikoz alım ölçümleri, insülin reseptörüne bağlanmasından, GLUT4 zenginleştirilmiş vezikülleri translokasyonuna kadar ve hücre içi sinyalizasyon ve fosforilasyon kaskadları dahil olmak üzere, insülin stimülasyonuna verilen hücre biyolojik tepkisini niceleştirir. Farklılaşmış miyotlar, verici fenotipin metabolik özellikleri de dahil olmak üzere pek çok özelliğini muhafaza ettiği için insan numuneleri ile büyük ilgi görüyor.Hastalarda görülen bozukluklar ve bozukluklar 9 , 10 , 11 , 12 . Miyotüpler, glikoz taşıyıcıları 15 ve hücresel insülin sinyalleme makineleri 16&#39;nın ekspresyonu dahil olmak üzere iskelet kasına 13 , 14 yapısal, metabolik ve fenotipik benzerlikler gösterir. Bu nedenle, primer miyotlarda glikoz alımı ölçümü, bir donörün kas fenotipinin karakterize edilmesi veya bir müdahalenin (ilaç, beslenme veya fiziksel aktivite) kas hücresindeki insülin duyarlılığı üzerindeki etkisinin araştırılması ile ilgilidir. Kültürlenmiş miyotlarda glikoz alımı ölçümü, insülin duyarlılığını değiştiren deneyler yaparken güvenilir bir araçtır17,18. In vitro </Em&gt; modeli, insülin yanıt vermeyi iyileştirebilen veya edinilen veya indüklenen insülin direncini 19 , 20 , 21 , 22 , 23 engelleyebilen veya tersine döndürebilen herhangi bir bileşiğin testi için uygundur. Burada insan miyotlarını kültürlemek ve ayırmak ve hücre glikoz alım hızlarını ölçmek için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, laboratuvar ortamındaki preparatlardan, işbirliğinden ya da piyasada bulunan tedarikçilerden gelmiş olmasına rağmen, insan kas öncül hücrelerinin herhangi bir kaynağına uygulanabilir. Fare ve sıçan kökenli sırasıyla C2C12 ve L6 gibi ölümsüzleştirilmiş kas hücre çizgileri, bu protokolle glikoz alım ölçümleri için de kullanılabilir 7 . Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2dG&#39;yi kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. TEtiketli bir glikoz analoğunun kullanılması, birincil hücrelerle çalışıldığında ortak bir koşul olan indirgenmiş başlangıç ​​materyali ile glikoz girişinin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Modifiye glikoz molekülü, metabolik yollara giremiyor ve böylece hücre içinde birikiyor ve toplam hücre radyoaktivitesi aracılığıyla güvenilir bir şekilde ölçülebiliyor. Deneysel koşullar arasında bir glikoz transport inhibitörü (sitokalasin B) kullanımı yer alır ve ölçümler insülin ile veya insülinsiz yapılır. Bu kombinasyon, glukoz aktif giriş hızlarının belirlenmesine ve insülin tepki indeksi için kat değişikliğinin hesaplanmasına izin verir. Yöntem tek bir kuluçka süresi boyunca bir doz insülin ile sunulur, ancak protokol doz yanıtı ya da zaman dersi deneyleri için kolayca modifiye edilebilir 12 .

<table><tbody><tr><td>İnsan birincil kas hücresi</td><td>İnsan iskelet kası biyopsilerinden ev hazırlığı</td><td>İnsan iskelet kası biyopsilerinden ev hazırlığı</td><td>Mevcut değilse, ticari kaynak kullanın</td></tr><tr><td>İnsan birincil kas hücresi</td><td>Promocell</td><td>C-12530</td><td>İlişkili ortam C23060 ve C23061 ile kültürlenmelidir</td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>356400</td><td>BioCoat Kollajen I Multiwell Plakaları</td></tr><tr><td>Jambon F10</td><td>Dutscher</td><td>L0145-500</td><td>1 g/L glikoz</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Dutscher</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin 100x</td><td>Thermo fisher bilimsel</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Serum ikamesi UltroserG</td><td>Pall France</td><td>15950.017</td><td>metinde serum ikamesi</td></tr><tr><td>DMEM düşük glikoz</td><td>Dutscher</td><td>L0064-500</td><td>1 g / L glikoz</td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Dutscher</td><td>L0625-500</td><td>> Mg 2 + 2 + (0.9 mM)</td></tr> <tr><td>İnsülin çözeltisi insan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>2-deoksi-D-glikoz ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>Albümin sığır</td><td>euromedex</td><td>04-100-812-E</td><td></td></tr><tr><td>yağ asidi içermeyen BSA</td><td>Roche</td><td>10,775,835,001</td><td></td></tr><tr><td>palmitat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Deoksi-D-glikoz, 2- [1,2-3H (N)]</td> <td>PerkinElmer</td><td>NET328A001MC</td><td>Spesifik Aktivite: 5 - 10 Ci (185-370GBq) / mmol, 1 mCi (37MBq</td></tr><tr><td>Sitokalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>c2743</td><td></td></tr><tr><td>PICO PRIAS FLAKON 6 mL</td><td>PerkinElmer</td><td>6000192</td><td></td></tr><tr><td>ultima altın MW CA&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>6013159</td><td>sintilasyon sıvısı</td></tr><tr><td>b&ecirc; ta sayacı&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2900TR</td><td></td></tr></tbody></table>

glikoz alımı Ölçümü ve İnsülin uyarıcısına yanıt<em&gt; in vitro</em&gt; kültürlü İnsan primer miyotları

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Kas glikoz metabolizmasını araştırmaya ve metabolik değişiklikleri karakterize etme amaçlı tüm çalışmalar için kas hücrelerinin insülin duyarlılığının değerlendirilmesi büyük önem taşımaktadır. Kas hücrelerinde, glukoz taşıyıcı tip 4 (GLUT4) proteinleri, insüline tepki olarak plazma membranına translokasyon yapar, böylece hücrenin içine glükoz girmesini sağlar. Kas hücrelerinin glikoz alım oranını arttırarak insüline cevap verme yeteneği, insüline karşı kas hücrelerinin duyarlılığını ölçmek için standart okumalardan biridir. İnsan primer miyotları, in vitro model olarak uygundur, çünkü hücreler insülin duyarlılığı da dahil olmak üzere verici fenotipin birçok özelliğini korurlar. Bu in vitro model de insülin yanıt vermeyi etkileyebilecek herhangi bir bileşiğin testi için uygundur. Farklı miyotlarda glikoz alım hızı ölçümleriInsülin duyarlılığı. Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklılaşmış miyotlar elde edilir ve insülin stimülasyonu olan ve olmayan glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [3H] 2-deoksi-D-Glukoz ([3H] 2dG) kullanılarak pasif ve aktif glikoz taşınım oranlarını belirlemek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hesaplama yöntemleri, aktif bazal ve insülin tarafından uyarılan hızların yanı sıra stimülasyon katının miktarını belirlemek için sağlanır.

3. günde miyoblastlar konfluansa ulaşır ( Şekil 1A ). Bu aşamadaki miyoblastlar tipik olarak mononükleotiddir. Ortam değiştirildi ve 8. günde farklılaşma tamamlandı ( Şekil 1B ) (protokol bölümü 2). 5 gün farklılaştıktan sonra, miyotlar hizalanır ve tipik olarak polinükleere edilir. İnsan primer miyotları, glikoz alım hızı ölçümünden önce bir palmitat veya bir BSA&#39;ya uygulanmıştır. Hücreler, BSA (PALM) veya BSA tek başına (B...

Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklı miyotüpler elde edilir ve glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2-deoksi-D-Glikoz kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Glikoz Alımı Ölçümü ve İnsülin Uyarıcısına Yanıt<em&gt; In vitro</em&gt; Kültürlü İnsan Primer Miyotları

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Bu prosedürün genel amacı, insan primer kas hücrelerinde insülinle stimüle edilen glukoz alımını ölçmektir. Bu yöntem, kas hücresi insülin duyarlılığı gibi kas metabolizması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hormonal stimülasyona yanıt olarak kas hücresindeki etkili biyolojik etkiyi nicelleştirmesidir.Deneye başlamak için, Ham's F-10 ortamını %2 fetal calf serum (FCS), %2 serum substitüsü, 2 millimol glutamin ve mililitre başına 5 mikrogram penisilin streptomisin ile takviye ederek proliferasyon ortamı (PM) hazırlayın. Dulbecco's Modified Eagle Medium'u (DMEM), %2 FCS, 2 millimol glutamin ve mililitre başına 5 mikrogram penisilin streptomisin ile takviye ederek bir diferansiyasyon ortamı (DM) hazırlayın. X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (XDPBS) hazırlamak için, ağırlıkça hacimce %0,2 bovine serum albumen içeren bir DBPS çözeltisi oluşturun.Çözeltiyi 0.2 mikrometrelik bir filtreden süzün. Ardından, XDPBS'yi 4 °C'de saklayın. Soğuk 2DG çözeltisi hazırlamak için, 16.4 mg 2DG tartın ve 10 mM çözelti elde etmek için 10 mL distile su içerisinde çözün.Çözeltiyi 4 °C'de saklayın. Ardından, radyolabel'li 2DG çözeltisini elde etmek için 5'e, 600 µL soğuk 2DG ve 6 µL radyolabel'li 2DG ile 400 µL XDPBS ekleyin. Radyolabel'li 2DG çözeltisinden 20 µL'lik bir alikot ayırın.Sitoşalazin B karışımı için, 2 mililitre radyomarkörlü 2DG çözeltisine 2 mikrolitre 20 milimolar sitoşalazin B ekleyin. DMSO karışımı için, geri kalan 4 mililitre radyomarkörlü 2DG çözeltisine 4 mikrolitre DMSO ekleyin. İnsan kas satelit hücresi içeren donmuş vialleri, vialde sadece küçük bir buz kütlesi kalana kadar önceden ısıtılmış suda hızla çözdürün.Ardından, hücreleri doğrudan 10 mL önceden ısıtılmış PM içeren 50 mL'lik plastik bir tüpe aktarın. Tüpü 500 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Sonra, süpernatantı uzaklaştırın. Hücre peletine 18 mL önceden ısıtılmış PM ekleyin ve hücreleri nazikçe yeniden süspande edin. Altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa 3 mL şeklinde dağıtın.Hücreleri, %90 konfluensa ulaşana kadar 37 °C ve %5 CO2 ortamında 48 ila 72 saat boyunca inkübe edin. 48 ila 72 saat sonra, PM'yi uzaklaştırın ve yerine kuyuk başına 3 mL önceden ısıtılmış DM ekleyin. Hücreleri standart koşullarda inkübe edin.DM besiyerini iki günde bir değiştirin. Optimal insülin yanıtı için kültürlenen kas hücrelerinin tam diferansiye hale gelmesi önemlidir; diferansiye olmamış hücrelerde glikoz alımının insülin stimülasyonuna karşı zayıf veya hiç yanıt vermediği görülür. Diferansiye olmuş kas hücrelerini 2 mililitre PBS ile iki kez yıkayın.Ardından, PBS'yi dikkatlice uzaklaştırın ve serum eksiltme işlemi için hücreleri 3 mililitre FCS içermeyen DM içinde inkübe edin. Sonrasında, tüm kuyucuklardaki besiyerini 3 mililitre FCS içermeyen DM ile değiştirin. Beş ve altı numaralı kuyucuklara 100 nanomol insülin ekleyin.Ardından, insan miyotüp kültürünü inkübe edin. Bir saatlik insülin stimülasyonunun ardından, kuyucukları 1 mililitre XDPBS ile iki kez yıkayın. Bir ve iki numaralı kuyucuklara 1 mililitre sitokalasin B karışımı, üç ile altı arasındaki kuyucuklara ise 1 mililitre DMSO karışımı ekleyin.37 °C'de ve %5 CO2 ortamında 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda plakayı hemen buz üzerine yerleştirin. Hücreleri 1 mL buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.Her kuyucuktaki hücreleri 600 µL 50 mM sodyum hidroksit ile lizleyin. Hücreleri buz üzerinde beş dakika inkübe edin ve yavaş orbital rotasyonla nazikçe karıştırın. Bir pipet kullanarak hücre lizatını yeniden süspande edin ve toplayın.Her bir hücre lizatından 400 µL'yi bir sıvı sintilasyon sayım şişesine ekleyin. 400 µL 50 mM sodyum hidroksit ile bir negatif kontrol şişesi ve 20 µL TC20 ile bir pozitif kontrol şişesi hazırlayın. Ardından, her bir şişeye 4 mL sıvı sintilasyon çözeltisi ekleyin.Kapağı kapatın ve her flakonu bir ila iki saniye boyunca iyice karıştırın. Her flakonu bir sıvı sintilasyon sayıcısına yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre radyoaktiviteyi ölçün. Her sintilasyon flakonu için 10 dakika boyunca dakika başına sayımları kaydedin.Üçüncü günde çekilen optik mikroskop görüntüleri, miyoblastların konfluensa ulaştığını ve tipik olarak mononükleat olduğunu göstermektedir. Besiyeri değiştirildikten sonra sekizinci günde farklılaşma tamamlanır ve miyotüpler hizalanmış olup tipik olarak polinükleattır. Glikoz alım hızı, kontrol koşulunda ve uygulama koşulunda hesaplanmıştır.İnsülin, BSA durumunda glukoz transportunu önemli ölçüde artırır. İnsan miyotüp hücresinin insüline verdiği yanıt kat değişimi olarak ifade edildiğinde, palmitat ile işlem görmüş miyotüplerde insüline verilen yanıtın azaldığı açıkça görülmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, glukoz alım hızlarının belirlenmesi yoluyla kas hücrelerinde insülin duyarlılığının nasıl araştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

glucose-uptake-measurement-response-to-insulin-stimulation-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, flow sitometri ile hücre plazma membranı, sitoplazma GLUT4 translokasyon ölçmek hızlı bir teknik anlatılmaktadır.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Bu video, hücre içi glikoz alımını dolaylı olarak ölçmek için bir in vitro testi göstermektedir. Test, hücre dışı glikoz tükenmesi ile hücre içi glikoz alımı arasında bir korelasyon kurmak için floresan etiketli bir glikoz analoğu kullanır.

İn Vitro Glikoz Tükenme Testi: Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi Ölçümü Yoluyla Hücresel Glikoz Alımını Ölçmek İçin Floresan Tabanlı Bir Yöntem

Bu videoda, hasat edilmiş fare organlarında hücre dışı glikoz analog tükenmesini ölçmek için ex vivo bir teknik gösteriyoruz. Fare dokusunun, hücreler tarafından alınan floresan etiketli deoksiglukoz içeren bir çözelti içinde inkübe edilmesini içerir. Glikoz analog alımı, inkübe edilmiş ortamın floresansının ölçülmesiyle dolaylı olarak belirlenebilir.

Hücre Dışı Floresan Glikoz Analog Tükenmesinin Ölçümü: Ex vivo Fare Organlarında Glikoz Alımını Değerlendirmek İçin Vekil Bir Ölçüm Tekniği

Video, floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı bir hücre içi glikoz sensörü kullanarak Drosophila  larva motor nöronlarında glikoz alımını ölçmek için bir tekniği göstermektedir. Ventral sinir kordonunu ortaya çıkarmak için larvaları diseksiyona tabi tuttuktan sonra, motor nöronlar, sensörün donör floroforu tarafından yayılan floresan yoluyla görselleştirilir. Glikoz ile uyarıldığında, sensörün donörü ve alıcısı floroforları arasındaki FRET, alıcıdan floresan emisyonunu tetikleyerek,...

Yukarı Düzenlenmiş Glikoz Metabolizması ile Drosophila Larvalarının Motor Nöronlarında Glikoz Alımının Değerlendirilmesi

Bu iletişim kuralı bozulmadan 832/13 beta yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanarak hücreleri glikoz-aracılı değişiklikler doğal bileşikler huzurunda mitokondrial solunum etkisini ölçmek için hedeftir.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

Burada, homojen mevcut zaman hücrelerden salgılanan insülin hızlı algılama için etkili bir yöntem olarak FRET (HTRF) çözüldü.

Homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için

Bu protokol, bir insülin bağlantılı gaussia Lusiferaz ile Beta hücrelerinden insülin salgılanması için bir vekil olarak orta verim ile hızlı düşük maliyetli Lusiferaz nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Tahlil en lüminesans plaka okuyucular ve çok kanallı pipetler ile gerçekleştirilebilir.

Bir Co-salgılanmış luciferase Surrogate kullanarak bağıl Insülin salgılanmasını ölçme

Kas glukoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesi, tüm vücut glikoz homeostazını korumak için önemlidir. Bu protokol, çeşitli fizyolojik müdahalelerin tüm vücut glikoz metabolizması üzerindeki etkisini tanımlarken, izole ve inkübe edilmiş olgun iskelet kasında insülin ve kontraksiyonla uyarılmış glikoz alımının değerlendirilmesini sunar.

Farelerden İzole ve İnkübe Olgun İskelet Kasında İnsülin ve Kasılma ile Uyarılmış Glikoz Alımının Ölçülmesi

TAR DNA bağlayıcı protein (TDP-43) proteinopatisi tarafından etkilenen Drosophila motor nöronlarında, FRET tabanlı, genetik olarak kodlanmış bir glikoz sensörü tarafından belirtildiği gibi glikoz alımı artar.

TDP-43 Proteinopatisinin Drosophila Modellerinde Glikoz Alımının Ölçülmesi

Floresan olarak etiketlenmiş glikozun hücre dışı tükenmesi, glikoz alımı ile ilişkilidir ve eksize edilmiş organlarda ve hücre kültürlerinde glikoz alımının yüksek verimli taranması için kullanılabilir.

Ex Vivo'da Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi

Öğrenin insülin uyarımlı glikoz alımını insan primer miyotlarında ölçme yöntemini. Bu teknik, kas metabolizması ve insülin duyarlılığı araştırmalarında hormonal yanıtları nicel olarak değerlendirmeyi sağlar.

Glikoz Alımı Ölçümü ve İnsülin Uyarıcısına Yanıt

Daha fazla video keşfet