Microinjections kemirgen beyin için kişiselleştirilmiş iğneler

Bu metodolojinin genel amacı, tespit edilebilir doku hasarı oluşturmayan ve derin bölgelerde bile güvenilir uygulama sağlayan kişiselleştirilmiş, yeniden kullanılabilir kuvars iğnesi kullanarak beyin mikroenjeksiyonu için bir protokol geliştirmektir. Bu yöntem, nörodejeneratif ve psikiyatrik hastalıkların patofizyolojisi ve viral vektörler ve hücre grefti yoluyla gen ve hücre tedavisinin etkileri gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ana avantajı, bu iğnelerin tespit edilebilir herhangi bir doku hasarı üretmemesidir, bu da derin beyin bölgelerinde güvenilir bir doğum sağlamıştır.

Temizlenebildikleri ve tekrar kullanılabildikleri için uygun maliyetlidirler. Bu işleme başlamak için, kuvars kılcal damarları damıtılmış suda beş dakika bekleterek temizleyin ve sterilize edin. % 99 etanolde beş dakika, ardından dietil eterde beş dakika.

Daha sonra kılcal damarları tamamen kuruması için en az bir saat kaputun altında bırakın. Bu arada uzun ve ince iğneleri lazer çektirme kullanarak hazırlayın. Daha sonra iğneleri daha önce% 70 etanol ile temizlenmiş bir petri kabına yerleştirin.

Çanağı plastik bir parafin filmi ile örtün. Ardından, mikro disektördeki kılcal damarları kesin. İğneyi mikroskop tablasına sıkıca sabitleyin ve ucunu bilgisayar ekranının ortasına yerleştirin.

Menü çubuğunda kalem simgesine tıklayın ve kesilecek iğne için bir işaret çizmek için kullanın. Yan çubuk işlevinde, lazerin daha önce işaretlenmiş noktayı kesmesine izin vermek için Kesmeyi Başlat düğmesini içeren bayrağı seçin. Gerekirse, bir işaret çizerek ve iğneyi yeniden konumlandırmadan kesme prosedürlerini tekrarlayarak yan delikleri kesin.

İğneyi kestikten sonra, plastik bir tüp aracılığıyla bir boşluk pompasına bağlayın. Ardından, pompayı açın ve ileri akış hızını manuel olarak dakikada üç mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra% 99 etanolü ve ardından kesme nedeniyle oluşan safsızlıkları gidermek için damıtılmış suyu aspire edin.

Bundan sonra, kurumayı kolaylaştırmak için% 99 etanolü tekrar aspire edin. Daha sonra, iğneleri ameliyat gününe kadar uygun şekilde kapalı bir petri kabında saklayın. İğneleri tekrar kullanmak için, deneyin sonunda, enjekte edilen solüsyonu ve olası doku kalıntısını gidermek için uygun deterjanlar ve% 70 etanol ile temizleyin.

Gerekirse, bu iğneler damıtılmış suyla doldurulmuş özel cam kavanozlarda bile kaynatılabilir. Bu adımda, pompayı mikroenjeksiyon şırıngasının hacmi başına çapa göre kalibre etmek için ayarlar menüsünü seçin. Ve akış hızını dakikada 0,3 mikrolitre olarak ayarlayın.

Ardından 10 mililitrelik bir şırıngayı steril suyla doldurun. Ve manuel mikronenjeksiyon pompası için mikroenjeksiyon şırıngasını ve enjeksiyon montaj parçaları kitini doldurmak için kullanın. Bundan sonra, iğneyi manuel mikroenjeksiyon pompa kitine bağlayın.

Mikroenjeksiyon şırıngasının üst kısmında su damlası bırakmak için pistonu yavaşça iterken 10 mililitrelik şırıngayı mikroenjeksiyon şırıngasından ayırın. Ardından, pistonu mikroenjeksiyon şırıngasına yerleştirin. Şimdi, mikroenjeksiyon şırıngasını pompaya bağlayın ve akış hızını dakikada 0,3 mikrolitre olarak ayarlayın.

Daha sonra akış hızını dakikada 0,1 mikrolitre olarak değiştirin ve ameliyat işlemine başlayın. Ameliyatı gerçekleştirmek için hayvanın kafasını tıraş edin ve alkollü bir mendille temizleyin. Ardından, fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin.

Sterilize edilmiş bir neşter kullanarak kafatası üzerinde uzunlamasına bir kesim yapın. Aşırı kanamayı önlemek için nazik olun. Bunu takiben, düz bir spatula kullanarak kafa derisini açın ve açık tutmak için cildin kanatlarına cerrahi klipsler uygulayın.

Çok nazikçe, bregmayı ve iğnenin yerleştirileceği kafatası alanını ortaya çıkarmak için periosteuumu ayırın. Daha sonra, kolu stereotaksik çerçeveye monte edin ve iğnenin ucunu, ucunu kırmamaya dikkat ederek bregmanın hemen üzerine hareket ettirin. Bregmanın anteroposterior ve medial lateral koordinatlarını açıklayın ve iğneyi istenen koordinatlara hareket ettirin.

Ardından, iğneyi ucu neredeyse kafatasına değene kadar indirin ve stereotaksik kolu biraz kaldırdıktan sonra delme noktasını işaretleyin. Meninkslere ve beyne zarar vermemeye dikkat ederek kafatasını işaretli noktada delin. Ardından, küçük bir plastik parafin filmi parçası kesin ve kafatasının üzerine yerleştirin.

10 mikrolitrelik pipeti kullanarak, plastik parafin film üzerine uygulamak için solüsyondan bir damla damlatın. Pompayı durdurun, pompanın iticisini hafifçe geri çekin ve mikroenjeksiyon şırıngasının pistonunu hafifçe çekerek kılcal damarda küçük bir hava kabarcığı oluşturun. İğnenin ucunu damlaya ulaşana kadar indirin.

Mikroenjeksiyon şırıngasının pistonunu çok yavaş çekerek ve herhangi bir kabarcık oluşumundan kaçınarak numuneyi çizin. Pistonla temas eden pompa iticisini değiştirin ve pompayı dakikada 0,3 mikrolitre akış hızında açın. Ardından, bir sonraki adıma geçmeden önce bir düşüş oluşana kadar bekleyin.

Daha sonra, akışı dakikada 0,1 mikrolitreye düşürün. Durayı paslanmaz çelik konik uçlu bir iğne ile çentikleyin ve beyin dokusuna girmek için iğneyi yavaşça indirin. İstenilen konuma ulaşıldığında, 0,1 milimetre daha aşağı inin, ardından pompayı durdurun.

Stereostatik kolu 0,1 milimetre kaldırın ve pompayı dakikada 0,3 mikrolitre hızla tekrar çalıştırın. Bundan sonra, zamanlayıcıyı ve enjeksiyonu başlatın. Enjeksiyon sırasında kabarcık hareketini izleyin.

Sonunda, pompayı durdurun ve iğneyi yavaşça almadan önce beş dakika bekleyin. Kuvars iğnesi tamamen çekildiğinde, pompayı tekrar çalıştırın ve iğnenin ucunda bir damla oluşup oluşmadığını kontrol edin. Ardından, kafatası yüzeyindeki açıklığı kemik mumu ile kapatın.

Homeostatik klipsleri çıkarın ve kafa derisini dikin. Yaranın etrafındaki alanı antibiyotikli bir kremle kaplayın ve hayvanı ev kafesine geri koyun. Bunlar, sıçan beyinlerinin striatum seviyesindeki sekiz mikrometre koronal bölümleridir.

Bu görüntü, 26 gauge künt uçlu paslanmaz çelik iğne kullanılarak iki mikrolitre ACSF enjeksiyonunun ürettiği hasarları göstermektedir. Tersine, bir kuvars iğnesi ile enjekte edilen striatum, tespit edilebilir herhangi bir hasar göstermedi. Bu diğer görüntüler, iki iğnenin dorsal hipokampus seviyesinde neden olduğu hasarları göstermektedir.

Ancak kuvars iğnesi tespit edilebilir herhangi bir hasar üretmedi. Her iki iğne ile yapılan başarılı enjeksiyonlar, Tripan mavisinin dağılımı ile gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürleri takiben, ilaca bağlı etki gibi farklı soruları yanıtlamak için ek ameliyatlar gibi önemli olan her şey yapılabilir. Bu gelişmeden sonra bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların toksin ve ilaçların ve daha yakın zamanda gen ve hücre tedavisi ürünlerinin hayvan modellerindeki etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, kişiselleştirilmiş kuvars iğneleri kullanılarak herhangi bir saptanabilir lezyon olmadan daha derin beyin bölgelerinde mikroenjeksiyonların nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.

Lazerle disseke edilmiş reaktiflerin ve/veya patojenlerin kullanılmasının son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Ve bu prosedür gerçekleştirilirken lazer güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipman gibi önlemler her zaman alınmalıdır.