Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Bu prosedürün genel amacı, konakçı genomundaki retroviral vektör entegrasyon bölgelerini tanımlamak ve her biri aynı entegrasyon bölgesini paylaşan klonal hücre popülasyonlarının nispi frekanslarını ölçmektir. Bu yöntem, retroviral gen terapisinde, konakçı genom vektörünün hangi bölümünün entegre olduğu, genetik olarak tasarlanmış bir hücrenin nakilden sonra nasıl yeniden çoğalacağı ve işlevsel olarak nasıl farklı oldukları gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, retro-entegrasyon bölgesi dizilerinin, hem yukarı hem de aşağı akış vektör konak DNA bağlantılarını aynı anda dizileyerek daha yüksek doğruluk ve hassasiyetle analiz edilebilmesidir.

Bu yöntem, gen terapisi çalışmalarında vektörlerin ve gen mühendisliği yapılmış hücrelerin güvenliği hakkında fikir verebilse de, bireysel hücre davranışını in vivo olarak araştırmak için diğer temel biyoloji çalışmalarına da uygulanabilir. Bu prosedürdeki ilk adım, analiz edilecek genomik DNA'nın 260 ve 280 nanometresindeki DNA konsantrasyonunu ve absorbans oranını belirlemektir. Bundan sonra, örnek genomik DNA'nın bir ila iki mikrogramını, nükleaz içermeyen su kullanarak 170 mikrolitre genomik DNA çözeltisinin son hacmine seyreltin.

Aşağıdakileri bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırarak 200 mikrolitrelik bir PCR reaksiyonu hazırlayın. HIV-1'e özgü biyotin primerlerinin her biri 2.5 mikrolitre veya dört lentivirüse özgü primer için toplam 10 mikrolitre, 20 mikrolitre 10X termostabil DNA polimeraz tamponu, dört mikrolitre 10 milimolar dNTP, üç mikrolitre termostabil DNA polimeraz ve 163 mikrolitre genomik DNA. Çözeltiyi eşit olarak dört PCR tüpüne bölün ve aşağıdaki koşul altında tek bir uzatma döngüsü gerçekleştirin.

5 dakika 94 santigrat derece, 3 dakika 56 santigrat derece, 5 dakika 72 santigrat derece ve saklama için 4 derece C. Dört PCR reaksiyonunun tümünü iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Üreticinin bir PCR saflaştırma kiti prosedürünü izleyin ve 50 mikrolitre elüsyon tamponu ile elüte edin.

Bir mikrosantrifüj tüpüne aşağıdakileri ekleyerek 100 mikrolitrelik bir sindirime hazırlanın. 50 mikrolitre DNA, 10 mikrolitre 10X tampon A, iki mikrolitre RSAI enzimi ve 38 mikrolitre nükleaz içermeyen su. 37 santigrat derecede bir termal döngüleyicide bir saat inkübe edin.

Daha sonra, reaksiyona bir mikrolitre CviQI enzimi ekleyin ve 25 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. RSAI ve CviQI sindirimi tamamlandığında, hemen künt sonla devam edin. 2.5 mikrolitre DNA polimeraz I, Büyük Parça ve 2 mikrolitre 10 milimolar dNTP içeren 4.5 mikrolitrelik bir karışım hazırlayın.

Karışımın 1 mikrolitresini DNA örneğine aktarın. Toplam hacim 102 mikrolitre olacaktır. Girdap yaparak iyice karıştırın ve 25 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Kuluçka tamamlandığında hemen streptavidin boncuk bağlamaya devam edin. Boncuk çözeltisini kısaca girdaplayarak ve 50 mikrolitreyi iki mililitrelik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak streptavidin boncuklarını hazırlayın. Manyetik bir stand kullanarak süpernatanı çıkarın ve çekirdekleri 200 mikrolitre bağlama solüsyonu ile yıkayın.

Boncukları 100 mikrolitre bağlama solüsyonunda yeniden süspanse edin ve tüpü manyetik standdan uzağa yerleştirin. 100 mikrolitre numune DNA'sını 100 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş boncuk çözeltisine aktarın ve çözeltinin herhangi bir şekilde köpürmesini önlemek için pipetleme ile dikkatlice karıştırın. Tüpü oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde 3 saat inkübe edin.

Boncukları yakalamak ve süpernatanı atmak için manyetik standı kullanın. Boncukları 400 mikrolitre yıkama solüsyonunda iki kez ve 400 mikrolitre 1X T4 DNA ligaz tamponunda iki kez yıkayın. Boncukları 200 mikrolitre 1X T4 DNA ligaz tamponunda yeniden süspanse edin ve manyetik standdan uzağa yerleştirin.

Bağlayıcı ligasyonu, streptavidin boncuk bağlanmasından hemen sonra yapılmalıdır. Aşağıdakileri iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırarak 400 mikrolitrelik bir ligasyon reaksiyonu çözeltisi hazırlayın. 0.5 mikrolitre DNA bağlayıcı, 10 mikrolitre 10X T4 DNA ligaz tamponu, 20 mikrolitre 5X T4 DNA ligaz tamponu, 5 mikrolitre T4 DNA ligaz, 164.5 mikrolitre nükleaz içermeyen su ve 200 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş boncuklar.

Reaksiyon tüpünü 3 saat boyunca oda sıcaklığında dönen bir tekerleğe yerleştirin. Boncukları iki kez yıkama solüsyonu ile ve iki kez 1X termostabil DNA polimeraz tamponu ile yıkayın. Boncukları 50 mikrolitre 1X termostabil DNA polimeraz PCR tamponunda yeniden süspanse edin ve manyetik standdan uzağa yerleştirin.

Bu prosedüre başlamak için, yeniden süspanse edilmiş boncuklara aşağıdakileri ekleyerek 200 mikrolitrelik bir PCR reaksiyonu hazırlayın. 10 mikrolitre bir adet 1L-primer, 10 mikrolitre 1R-primer, 20 mikrolitre primer Link1, 10 mikrolitre 10X termostabil DNA polimeraz tamponu, dört mikrolitre 10 milimolar dNTP, sekiz mikrolitre termostabil DNA polimeraz ve 88 mikrolitre nükleaz içermeyen su. Reaksiyon karışımını dört PCR tüpüne ayırın ve aşağıdaki koşulla PCR'yi gerçekleştirin.

2 dakika boyunca 94 santigrat derece, 20 saniye boyunca 94 santigrat derece 25 döngü, 25 saniye boyunca 56 santigrat derece ve iki dakika boyunca 72 santigrat derece ve 72 dakika boyunca 5 santigrat derecede son bir uzatma. Dört PCR reaksiyonunun tümünü 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. PCR saflaştırma kitinin prosedürünü izleyin ve 50 mikrolitre elüsyon tamponu ile elüte.

UV görünür spektrofotometre kullanarak 260 ve 280 nanometrede DNA konsantrasyonunu ve absorbans oranını belirleyin. DNA artık bir sonraki adıma hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. PCR'de kullanılan primerler dışında sol kavşak ve sağ kavşağa özgü amplifikasyonlar için prosedürler aynı olduğundan, sadece sol kavşak amplifikasyonu gösterilecektir.

Aşağıdakileri bir PCR tüpünde karıştırarak 50 mikrolitrelik bir PCR reaksiyonu hazırlayın. Beş mikrolitre DNA, beş mikrolitre 10 mikromolar 2L-primer, beş mikrolitre 10 mikromolar primer Link2, 5 mikrolitre 10X termostabil DNA polimeraz tamponu, bir mikrolitre 10 milimolar dNTP, iki mikrolitre termostabil DNA polimeraz ve 27 mikrolitre nükleaz içermeyen su. PCR'yi aşağıdaki koşulla gerçekleştirin.

3 dakika boyunca 94 santigrat derece, 20 saniye boyunca 94 santigrat derece 8 ila 15 döngü, 25 saniye boyunca 56 santigrat derece ve iki dakika boyunca 72 santigrat derece ve 72 dakika boyunca 5 santigrat derecede son bir uzatma. DNA'yı saflaştırmak ve 50 mikrolitre elüsyon tamponu ile elüte etmek için PCR saflaştırma kitini kullanın. 260 ve 280 nanometrelerde DNA konsantrasyonunu ve absorbans oranını belirleyin.

Sol ve sağ bağlantı dizisi kütüphaneleri oluşturmanın son adımı, kapiler elektroforez gerçekleştirerek PCR Amplikon uzunluk varyasyonlarını analiz etmektir. Bu temsili sonuç, hem yukarı akış hem de aşağı akış vektör konak bağlantıları için lentiviral vektör entegrasyon bölgelerinde değişen uzunluklarda PCR Amplikonları gösterir. DNA boyutu işaretleyicisi M şeridindedir.

PCR Amplikonları dizilendikten sonra, şirket içi bir programlama komut dosyası kullanılarak hesaplamalı entegrasyon site dizisi analizi gerçekleştirilir. Çift yönlü entegrasyon bölgesi testi, kılcal elektroforez ile görselleştirilen hem yukarı hem de aşağı akış vektör konak bağlantıları için farklı boyutlarda PCR Amplikonları üretir. Alu ve L1 genlerindeki yüzde entegrasyonun karşılaştırılması, siliko oluşturulan rastgele entegrasyon olayları içinde insanlaştırılmış fare yeniden çoğalan hücrelerde lentiviral vektörlerin tekrarları, entegrasyon bölgelerinin genler açısından önemli ölçüde zenginleştirildiğini ortaya koydu.

Vektör integromlarının nispi tespit frekansları, yalnızca 500bp'den daha küçük PCR Amplikonları üreten entegrasyon bölgesi bağlantılarının dizi sayıları kullanılarak hesaplandı. Vektörlerin yaklaşık% 77'si çift yönlü yaklaşımla nicel olarak analiz edilebilir. Klonal niceleme stratejisinde, her bir klonun aynı vektör integromunu paylaştığını varsayıyoruz.

Sol ve sağ bağlantıların nispi frekansları, klonal popülasyonların nispi miktarlarını veya QVI'yı temsil etmek için birleştirilir. Bu renk şeması, insanlaştırılmış fare yeniden çoğalan hücrelerdeki 44 QVI klonunun göreceli frekanslarını gösterir. In silico 10.000 rastgele entegrasyon analizine dayanarak, GTAC motif enzimleri kullanılırken klonal frekansların 1.25 kat fazla tahmin edilmesi ve bir TCGA motif enzimi kullanıldığında 2.56 kat fazla tahmin beklenmektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik parçalara ayrılabilir ve uygun şekilde uygulanırsa iki gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, PCR adımlarının son derece hassas olduğunu ve herhangi bir kontaminasyonu önlemek için önlem alınması gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu teknik, terapötik retroviral vektörlerin güvenliğini incelemenin ve rhesus makaklarında nakil sonrası hemotopoietik kök hücre klonlarının uzun vadeli yeniden popülasyon modellerini keşfetmenin yolunu açmıştır.