Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku'ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu

Bu izolasyon ve farklılaşma protokollerinin genel amacı, perivasküler yağ dokularından adiposit progenitör hücreleri elde etmek ve bunların olgun adipositlere farklılaşmasını sağlamaktır. Bu yöntem, perivasküler yağ dokusundan spesifik ve tanımlanmış adiposit progenitör hücre popülasyonlarının, morfolojileri, canlılıkları ve çoğalma ve farklılaşma potansiyelleri üzerinde minimum etki ile analizine izin verir. Bu tekniğin ana avantajı, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasına kıyasla, yağ dokusunun gramı başına antijen sunan hücrelerin daha fazla izolasyonuna izin vermesidir.

Ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmediğini onayladıktan sonra, karın boşluğuna erişmek için sternum boyunca farenin perineal bölgesine dikey bir orta hat insizyonu yapın. Üst mezenterik arteri, küçük mezenterik direnç damarlarını ve torasik aortu açığa çıkarın ve mezenter ve aort ile olan tüm bağlantıları kesin. Gonadal yağ dokusunu toplayın ve izole edilmiş yağ yastıkçıklarını 10 milimolar yığınlarla desteklenmiş yeni bir Krebs-Ringer bikarbonat tamponu veya KRBB çözeltisi kabına aktarın.

Kapları KRBB çözeltisi içeren bir petri kabına aktarın ve çanağı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Perivasküler yağ dokusunu küçük mezenterik direnç damarlarından ve aorttan çıkarın. Bir biyogüvenlik başlığında, yaklaşık 50 miligram dokuyu 1 mililitre kollajenaz tip I çözeltisi içeren 1.7 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dokuyu 1 ila 3 milimetrelik parçalar halinde kıyın.

Kollajenazın bağ dokusuna iyice sızmasına izin vermek için yağ dokusunu yeterince kıymak önemlidir. Parçaları 37 santigrat derecede 1 saat çalkalayarak inkübe edin. Daha sonra, sindirilmiş materyali ayrı ayrı 100 ve 40 mikronluk hücre süzgeçlerinden 50 mililitrelik bir tüpe sırayla süzün.

Elde edilen süzüntüyü santrifüjleme ile toplayın ve peleti 1 mililitre eritrosit lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, ışıktan korunarak oda sıcaklığında 5 dakikalık bir inkübasyon için yeni bir 1.7 mililitrelik Mikrofüj tüpüne aktarın. Daha sonra stromal vasküler fraksiyon hücrelerini başka bir santrifüjleme ile toplayın ve peleti saymak için stromal vasküler fraksiyon bazal ortamında yeniden süspanse edin.

Adiposit progenitör hücrelerini manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması ile izole etmek için, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti, 4 santigrat derecede 20 dakikalık bir inkübasyon için mililitre başına 1 kez 10 ila 6. hücrelerde manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama engelleme tamponunda yeniden süspanse edin. İzolasyonun tüm adımlarının buz üzerinde değil, 4 santigrat derecede yapılması esastır. Daha sonra, hücreleri 30 dakika boyunca 5 mikrolitre FITC konjuge fare anti-CD34 ile inkübe edin.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Daha sonra hücreleri 4 mikrolitre anti-FITC MicroBeads ile karanlıkta 5 dakika boyunca 96 mikrolitre manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama tamponunda inkübe edin. Hücreler inkübe edilirken, kolonun altında 5 mililitrelik bir atık tüp bulunan manyetik ayırıcıya çok sıralı bir kolon yerleştirin.

Kolonu 500 mikrolitre manyetik ile aktive edilmiş hücre ayırma tamponu ile durulayın ve atık suyu ve atık tüpünü atın. Daha sonra sütunun altına yeni bir tüp yerleştirin ve hücreleri sütunun üstüne yükleyin, etiketlenmemiş CD34 negatif hücreleri yeni toplama tüpünde toplayın. Tüm hücreler kolonun üstünden geçtiğinde, kolonu 3 kez 500 mikrolitre gazı alınmış manyetik ile aktive edilmiş hücre ayırma tamponu ile yıkayın ve elüatı toplama tüpünde biriktirmeye devam edin.

Son yıkamadan sonra, kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve CD34 pozitif hücreleri toplamak için 1 mililitre manyetik ile aktive edilmiş hücre ayırma tamponunu kolondan tüpe akıtmak için kolon pistonunu kullanın. Santrifüjleme ile adiposit progenitör hücrelerini toplayın. Daha sonra CD34 pozitif fraksiyonunu 10 mikrolitre tavşan anti-trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü alfa içinde 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti, trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa pozitif hücrelerinin manyetik boncuk izolasyonu için 96 mikrolitre manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama tamponunda 4 mikrolitre anti-tavşan IgG Mikroboncuk içinde inkübe edin. CD34 pozitif trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü alfa pozitif adiposit progenitör hücrelerini kültürlemek için, hücreleri bazal ortamda ayrı ayrı 6 oyuklu doku kültürü plakalarına tohumlayın ve plakaları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. 3 seri geçişten sonra, hücreleri 1 çarpı 10 ila 2 hücre arasında siyah 96 oyuklu doku kültürü plakalarına tohumlayın ve proliferasyonlarını 8, 24, 48 ve 96 saatlerde 5 çarpı 10 ila 4. hücrelerde değerlendirin, standart proliferasyon test protokollerine göre 24 oyuklu tahlil plakalarında.

Adipogenezi indüklemek için, adiposit progenitör hücre kültürü birleşime ulaştığında, hücreleri 48 saat boyunca adiposit progenitör bazal ortamı ile besleyin, daha sonra kültürleri 48 saat daha kemik morfojenik proteini 4 ile tedavi edin. Üçüncü gün, ortamı 14 gün boyunca IBMX ve examemetazon içermeyen adiposit progenitör hücre indüksiyon ortamı ile değiştirin. Kültürlerdeki adipogenez derecesi daha sonra standart adipogenez test protokollerine göre 48 oyuklu doku kültürü plakalarında kuyu başına 1 kez 10 ila 4. hücrelerde değerlendirilebilir.

Her iki yöntem de benzer bir hücre popülasyonu dağılımı ve canlılığı gösterse de, manyetik ile aktive edilen hücre sıralama izolasyonu, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasına kıyasla kültür için daha fazla sayıda hücre üretir. Bu temsili deneyde, torasik aorttan, küçük mezenterik direnç damarlarından ve erkek sıçanların gonadal yağ dokusundan izole edilen manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralanmış stromal vasküler fraksiyon ve adiposit progenitör hücrelerinin in vitro proliferasyonu, kantitatif bir DNA testi kullanılarak kaplamadan 8, 24, 48 ve 96 saat sonra değerlendirildi. Aynı bölgedeki stromal vasküler hücrelere kıyasla 96 saat daha az proliferasyon gösteren torasik aorttan adiposit progenitör hücreleri dışında, hiçbir zaman noktasında stromal vasküler fraksiyon genişleme oranlarında yer farkı gözlenmedi.

Birleşen adiposit progenitör hücrelerinin kemik morfojenik protein 4 ile 48 saat boyunca uyarılması, hem floresan lipid alım testi hem de Yağ Kırmızısı O boyama ile değerlendirildiği gibi, damlacıklarda daha büyük bir lipit birikimi ile kanıtlanan adiposit farklılaşmasını indükler. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik doğru yapılırsa 8 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, izolasyon adımları sırasında 4 santigrat derece sıcaklıkları korumayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, adiposit progenitör hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve ayırt edileceğini iyi anlamış olmalısınız.