Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi ²⁺ Sensör Catcher ⁺

Bu deneyin genel amacı, CatchER plus ile HEK293 ve C2C12 hücrelerinin kültürü ve transfeksiyonu için protokollerimizi ve NC2KD ölçümünde ERSR reseptörü aracılı kalsiyum geçişlerini izlemek için uygulamasını göstermektir. Bu yöntem, bazal kalsiyum konsantrasyonu ve belirli hücrelerin ERSR'sindeki hızlı değişimler ve bu ölçümler için biyosensör CatchER plus'ın nasıl uygulanacağı gibi kalsiyum sinyalizasyonu ve görüntülemedeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücrelerin floresan tepkisinin hızlı kinetik ile gerçek zamanlı olarak kaydedilebilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, ERSR kalsiyumla ilişkili hastalıkların teşhisine doğru uzanır, çünkü CatchER plus, işlevsiz kalsiyum sinyal elemanlarından kaynaklanan bu organellerdeki anormal kalsiyum geçişlerini izleyebilir. Hücre transfeksiyonu ve floresan görüntüleme adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, hücre kültürü ve mikroskopi birden fazla hata alanına sahip olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir doktora sonrası olan Florence Reddish olacak.

Bu deneye başlamak için, HEK293 hücrelerini sterilize edilmiş cam mikroskop üzerine tohumlayın, altı santimetrelik tabaklarda kaydırın ve transfeksiyon gününde yaklaşık% 70 birleşene kadar bir ila iki gün boyunca kültürleyin. Daha sonra, DMEM'i tabaktan boşaltın ve üç mililitre azaltılmış serum ortamı ekleyin. Daha sonra, tabağa DNA transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin ve 37 santigrat derecede dört ila altı saat inkübe edin.

HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu genellikle diğer hücre hatlarından daha kolaydır, ancak hücreler zorlu koşullara karşı daha az dirençlidir. Bu nedenle, apoptozu önlemek için onları yalnızca dört ila altı saat boyunca transfeksiyon reaktiflerine maruz bırakmak çok önemlidir. Dört ila altı saat sonra, hücreleri beş ila altı mililitre HBSS ile yıkayın.

HBSS'yi tabaktan atın ve üç mililitre taze DMEM ile değiştirin. Daha sonra, GECI'nin ekspresyonuna izin vermek için hücreleri 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin. C2C12 miyoblast hücreleri için, tabağın tabanını kaplamak için bir ila iki mililitre tripsin ekleyerek hücreleri tripsinize edin.

Daha sonra, tripsinin hücreleri tabağın dibinden gevşetmesini sağlamak için tabağı iki ila altı dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, tripsini çıkarın ve hücreleri sekiz mililitre DMEM'de aspire edin. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak ve yeniden askıya almak için hücreleri DMEM ile iyice pipetleyin.

Daha sonra, bunları altı santimetrelik kültür kaplarında steril lamellerin üzerine ekin ve ardından %60'lık son bir birleşme elde etmek için üç mililitre DMEM ekleyin. Onları 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri beş ila altı mililitre HBSS ile yıkayın.

HBSS'yi tabaktan atın ve üç mililitre taze DMEM ile değiştirin. Daha sonra, GECI'nin ekspresyonuna izin vermek için 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu prosedürde, mikroskobu ve ışık kaynağını açın, ardından basit PCI programını açın.

Pamuklu çubuk kullanarak, düşük profilli açık elmas banyo görüntüleme odasının altını ince bir dolgu macunu tabakası ile kaplayın. Daha sonra, transfekte edilmiş hücreleri içeren bir slaytı inkübatörden çıkarın ve 37 santigrat dereceye önceden ısıtılmış 10 milimolar glikoz ve 1.8 milimolar kalsiyum içeren yaklaşık bir mililitre Ringer tamponu ile üç kez nazikçe durulayın. Hücrelerin kurumasını önlemek için tabakta yaklaşık bir mililitre Ringer tamponu bırakın ve slaytı tabaktan çıkarmak için forseps kullanın.

Slaytın kenarını bir laboratuvar dokusuna dokundurarak fazla çözeltiyi emdirin. Ardından, hücreler yağa bakacak şekilde haznenin yan tarafına yerleştirin. Ardından, bir tornavida kullanarak hazneyi s'ye sabitleyintage montajı.

Hücrelerin kurumasını önlemek için hazneye yaklaşık bir mililitre Ringer tamponu ekleyin, aynı zamanda sahneye monte edin ve mikroskop kurulumunu tamamlayın. Mikroskop objektifini 40 kez yağa daldırma objektifine geçirin. Hedefe bir damla daldırma yağı ekleyin.

Daha sonra, montajı mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, çözeltiyi düz tutmak ve aşırı dolmasını önlemek için vakum ucunu hazneye yerleştirin. Ardından, hedef üzerindeki yağ kaydırağın altına değene kadar rota ayarını kullanarak hedefi yükseltin.

Parlak alan modunu kullanarak, hücreleri odaklamak için kazancı 175'e ve pozlama süresini 0,03 saniyeye ayarlayın. Hücreler odaklandıktan sonra, 488 nanometre uyarım kullanarak floresan moduna geçin ve maruz kalma süresini 0,07 saniye olarak değiştirin. Görüntüleme için yeterli floresan ile sağlıklı olan yeterli hücreye sahip bir görüş alanı bulun.

Ardından, floresan ve parlak alan modunda fotoğraf çekin. Seçilen alandaki yoğunluğu kaydetmek için hücrelerde ilgilenilen bir bölgeyi daire içine alın veya tüm hücreyi daire içine alın. Şimdi, kare hızı her beş saniyede bir olarak ayarlanmış yoğunluk ölçümünü başlatın.

Temel yoğunluğun 20 ila 30 kare için sabitlenmesine izin verin. Daha sonra, 200 mikromolarlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için 450 mikrolitrelik nihai hazne hacmine dayalı olarak 20 milimolar bir stoktan gereken 4-CMC miktarını hesaplayın. Ardından, 60 mikrolitre Ringer tamponunu hazneden bir mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice aktarın.

Hesaplanan 4-CMC miktarını bu çözelti ile seyreltin ve görüntülenen hücrelerden istenen yanıtı uyandırmak için odaya geri ekleyin. İlacın reseptöre bağlanması ve ardından sinyalin azalması için zaman tanıyın. Ardından, hücreleri üç ila altı mililitre Ringer tamponu ile yıkayın ve aynı anda olay işaretçisini ekleyin.

Her test için transfekte edilmiş hücrelerin yeni bir slaytını kullanarak 100 mikromolar ATP ve 15 mikromolar CPA için prosedürleri tekrarlayın. Ölçüm tamamlandıktan sonra, basit PCI programındaki yoğunluk ölçümü penceresinde veri toplamayı sonlandırın. Ardından, hücrelerin floresan ve parlak alan resimlerini çekin.

Ardından, denemenin veri dosyasını açın. Gerekirse yoğunluk değerlerini yeniden hesaplamak için ilgili hücreleri veya bölgeleri yeniden daire içine alın. NC2KD ve C2C12 miyoblast hücrelerini belirlemek için, transfeksiyon prosedürünü tekrarlayın ve hazneye bir mililitre kalsiyum içermeyen Ringer tamponu ekleyin.

Sitozolde olabilecek herhangi bir CatchER plus'ın hücrelerini boşaltmak için hücreleri 15 ila 30 saniye boyunca% 0.002 ila 0.005 saponin ve hücre içi tampon ile geçirgen hale getirin. Daha sonra, hücreleri EGTA ve 10 mikromolar iyonomisin içeren üç ila altı mililitre KCL tamponu ile yıkayın. Bir platoya ulaşılana kadar yoğunluğun azalmasına izin verin.

Bunu takiben, hücreleri 10 mikromolar iyonomisin içeren üç ila altı mililitre KCL tamponu ile durulayın ve yoğunluğun stabilize olmasına izin verin. Daha sonra, yoğunluğun her ekleme arasında bir platoya ulaşmasını sağlamak için farklı kalsiyum çözeltileri ekleyin. Sensörü bazal kalsiyum konsantrasyonu miktar tayini için kalibre etmek üzere, minimum ve maksimum floresan yoğunluğunu elde etmek için EGTA ve 100 milimolar kalsiyum tamponu kullanın.

Burada, CatchER plus ile transfekte edilen geçirgen C2C12 miyoblast hücrelerinden toplanan normalleştirilmiş yoğunluğun temsili özellikleri gösterilmektedir. Hücreler, hücre içi tamponda 15 ila 30 saniye boyunca% 0.005 saponin ile geçirgenleştirildi. EGTA ve kalsiyum çözeltileri KCL tamponunda hazırlandı ve N, görüntülenen hücre sayısını ifade eder.

Bu dahili floresan görüntüleri, tedaviden önce ve sonra hücrelerin temsilcileridir. 0.2, 0.6, iki, beş, 10, 20, 50 ve 100 milimolar kalsiyum, 3.1 artı veya eksi 1.4 milimolar KD elde etmek için 10 mikromolar iyonomisin varlığında geçirgen C2C12 miyoblast hücrelerine ilave edildi. Bu şekil, sırasıyla her biri 10 mikromolar iyonomisin ile bir milimolar EGTA ve 100 milimolar kalsiyum eklendikten sonra minimum ve maksimum değerlerde CatchER artı transfekte edilmiş hücrelerin temsili bir yoğunluk ölçümünü göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik görüntüleme için 30 ila 60 dakika içinde veya transfeksiyon dahil ise üç gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, hücreleri her zaman steril bir ortamda tutmayı, deneyden önce reaktifleri hazırlamayı, hazneye eşit bir yağ tabakası uygulamayı ve başlamadan önce vakumunuzu takmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, CatchER plus'ın ekspresyon seviyesi gibi ek soruları yanıtlamak için western blot gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kalsiyum sinyalizasyonu ve görüntüleme alanındaki araştırmacıların memeli hücrelerinde ERSR kalsiyum dinamiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, hücreleri nasıl transfekte edeceğinizi ve CatchER plus kullanarak nasıl görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.