Vestibüler Schwannoma Araştırması İçin Birleştirilmiş Metodolojik Çerçeve

Bu prosedürün genel amacı, ameliyathaneden gelen bir insan vestibüler schwannoma örneğini primer hücre kültürü ve tümör salgılarının toplanması için işlemektir. Bu yöntem, birden fazla biyomoleküler analizde kullanılması amaçlanan primer insan tümör örneğinin en iyi nasıl alınacağı, saklanacağı ve işleneceği gibi vestibüler schwannoma araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, primer insan vestibüler schwannoma hücrelerini çoğaltmak için minimum manipülasyona dayalı bir kültür yöntemi kullanmasıdır.

Bu tekniğin etkileri, gelecek vaat eden terapötik adayların doğrudan kültürlenmiş hücreler üzerinde test edilebilmesi nedeniyle vestibüler schwannoma tedavisine kadar uzanmaktadır. Ameliyathaneden nakil için kullanılan buzdan, taze toplanmış vestibüler schwannoma veya great auricular nerve örneğini içeren numune kabını laboratuvardaki laminer akışlı kabine taşıyarak başlayın. Steril pens kullanarak numuneyi, 1,4 mililitre dış PBS ile doldurulmuş üç adet 1,5 mililitre tüpün ilkine dikkatlice aktarın.

Her tüp numuneyi aldıktan sonra kapatın ve yıkama için hafifçe çalkalayın. Örneği kuru bir 60 milimetrelik petri kabına yerleştirin ve belirgin kan damarlarının bulunduğu bölgelerdeki tüm ölü dokuları pens yardımıyla temizleyin. Örneği RNA koruma, protein ekstraksiyonu, sekresyon toplama, fiksasyon ve hücre kültürü için ayrı parçalara bölmek üzere pens veya skalpel ucu kullanın.

Hücre kültürü için ayrılan örnek parçasını, beş ila sekiz mililitre soğuk takviyeli DMEM F12 medyumu içeren yeni bir 60 milimetrelik kültür kabına aktarın. Salgıların toplanması için ayrılan vestibüler schwannoma veya great auricular nerve parçasını boş bir 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin. İşleme, iki adet 1,5 mililitrelik tüpe 500 mikrolitre FBS ile takviye edilmemiş DMEM pipetleyerek başlayın.

İlk tüp tümör salgılarının toplanması için kullanılacak, ikinci tüp ise eşleştirilmiş kontrol olarak hizmet edecektir. DMEM içeren tüplerden birini kalibre edilmiş bir dijital teraziye yerleştirin. Teraziyi sıfırlayın, salgıların toplanması için belirlenen örnek parçasını tüpe yerleştirin ve tartın.

Sadece dokunun ağırlığını temsil edecek olan sonucu kaydedin. Laminar akışlı kabin altında, tüpteki DMEM hacmini numunenin her 10 miligramı için 100 mikrolitre olacak şekilde ayarlayın. Doku örneğini ve buna karşılık gelen kontrolünü içeren tüpü inkübatöre yerleştirin.

Tümör veya sinir salgılarını biyolojik olarak yararlı miktarlarda toplamak için en az 72 saat boyunca inkübe edin. 72 saatlik inkübasyonun ardından, salgı içeren ortamı numuneden uzaklaştırmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Tekrarlayan dondurma-çözme döngülerini önlemek için, ortamı planlanan sonraki analizlere göre yeni tüplere alikotlayın.

Orijinal doku parçasını, salgıları ve kontrol DMEM'i, alt uygulamalar başlatılana kadar -80 °C dondurucuda saklayın. Her iki elde birer pens kullanarak vestibüler schwannoma dokusunu yaklaşık 1 mm³ boyutundaki parçalara ayırarak kültür prosedürüne başlayın. Ardından, besiyeri ve tümör parçalarını 10 mm'lik bir serolojik pipetle aspire edin ve tüm içeriği 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.

25 °C'de 1000G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, 60 mm'lik bir kültür kabında 4,7 mL tamamlanmış DMEM F12 ortamını 250 µL kollagenaz ve 50 µL hyaluronidaz ile birleştirerek disintegrasyon ortamını hazırlayın. Santrifüjleme sonrası, tümör parçaları konik tüpün dibinde bir tabaka oluşturacaktır.

Süpernatantı dikkatlice pipetle çekip atın. Ardından, tümör paletine taze hazırlanmış enzim içeren parçalama ortamından iki mililitre ekleyin. Dokuyu hareketlendirmek için pipetle birkaç kez yukarı aşağı çekme işlemi yapın ve ardından dokuyu 60 milimetrelik kültür kabına aktarın.

Kültür kabını 18 saat boyunca inkübatörde bekletin; ertesi gün, %10 FBS ve %1 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş DMEM F12 ortamını 37 °C su banyosunda ısıtın. Vestibüler schwannoma kültürünü içeren kabı inkübatörden çıkarın ve steril hava akışlı kabine transfer edin. Altı mililitrelik bir şırıngaya takılmış 22 gauge iğne kullanarak, kültürü içeren ortamı aspire edin ve yeni bir 15 mm konik tüpe aktarın.

37 °C'de 1000G hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Bu sırada, gerekli sayıda polidelysin ve laminin kaplı cam lamelleri steril pens yardımıyla 24 kuyucuklu bir kültür plağına yerleştirin. Bir santimetreküplük bir tümörden 24 ila 32 kuyucuk kültürlenebilir, bu nedenle çoğu küçük tümör için sekiz ila 16 kuyucukluk hücre kültürü planlanması uygundur.

Santrifüjlemeden sonra supernatantı uzaklaştırın ve planlanan her kuyucuk için bir mililitre hücre süspansiyonu sağlayacak şekilde, kalıntı hücre peletini önceden ısıtılmış besiyerinde yeniden süspanse edin. İki mililitre hücre süspansiyonu aspire etmek için beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın ve bunun bir mililitresini 24 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Tüm hazırlanmış kuyucuklar arasında tümör hücresi süspansiyonu eşit şekilde bölünene kadar, ikişer mililitrelik artışlarla aspirasyon yapıp her bir planlanan kuyucuğa birer mililitre tümör hücresi içeren besiyeri aktarma işlemine devam edin.

24 kuyucuklu plakayı gece boyunca 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin. Plakayı ertesi gün kontrol edin; kuyucukların tabanında belirgin düzeyde döküntü görülürse, yapışık hücreleri yerinden oynatmamaya dikkat ederek her kuyucuktaki besiyerini dikkatlice yeni takviyeli DMEM F12 kültür besiyeri ile değiştirin. Eğer döküntü yoksa, plakayı inkübatöre geri koyun ve besiyerini ilk kez beşinci günde, ardından her üç günde bir değiştirin.

Bu parlak alan görüntüsü, kültürdeki vestibüler schwannoma hücrelerinin tipik organizasyonel modelini göstermektedir. Birincil insan vestibüler schwannoma kültürüne ait bu immünofloresan görüntüler, yeşil renkte gösterilen GFP eksprese eden ink 80'e 48 saatlik maruziyetten sonra alınmıştır. Kırmızı floresans, hücre iskeletini boyayan falloidin F aktin immün boyamasından, mavi floresans ise çekirdeği boyayan dapi'den kaynaklanmaktadır.

İçteki küçük resim, düşük büyütmeli görüntünün bir bölgesinin daha yüksek büyütmeli görüntüsüdür. Bu prosedürü uygularken, sonraki adımların doğru inkübasyon sürelerinden sonra takip edildiğinden emin olmak için salgı örneğini ve kültür örneğini inkübatöre yerleştirdiğiniz saatleri not etmeyi hatırlamanız önemlidir. Bu prosedürün ardından, farklı virüslerin hücrelerde nasıl eksprese edildiği veya ilaç tedavisinden sonra gen ekspresyonunun nasıl değiştiği gibi ek soruları yanıtlamak için viral transduksiyon, fiksasyon, immünofloresan, ilaç tedavisi ve RNA ekstraksiyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu teknik geliştirildikten sonra, vestibüler schwannoma araştırmaları alanındaki araştırmacıların, cerrahi operasyon geçirmiş canlı hastalarda primer insan hücrelerinin farklı ilaçlara verdiği yanıtları incelemelerinin önünü açmıştır.