Drosophila Immunodetections veya PCR deneyleri için uygun pupa Wings incelemek için hızlı ve etkili bir yöntem

Bu prosedürün genel amacı, immünodetection veya PCR tahlilleri için uygun olan Drosophila'nın pupa kanatlarını incelemek için hızlı ve etkili bir yöntemdir. Burada açıklanan prosedür, PCR testlerini veya immünotespit protokollerini gerçekleştirmeye uygun pupa kanat örneklerini elde etmek için hızlı ve verimli bir yöntem bulma talebi ile geliştirilmiştir. Islak bir boya fırçası kullanarak, sıfır saatlik APF pupa'yı kültür şişelerinden nazikçe çıkarın ve geliştirme süresini tamamlamak için yeni şişelere yerleştirin.

Örneğin, 24 saat APF olan bir pupa kullanılıyorsa, şişede sadece 22 saat kalacaktır. 22. saatte, pupayı üzerine çift taraflı bant yapıştırılmış olarak mikroskop lamına aktarın. Bu aktarım, pupaya zarar vermemek için bir boya fırçası kullanılarak yapılabilir.

Pupa, sırt kenarları yukarı bakacak ve sefalik uçları aynı yöne bakacak şekilde bir sıra oluşturacak şekilde konumlandırılmalıdır. Bundan sonra, mikroskop lamını sabit bir sıcaklığa getirin ve pupanın uygun gelişim süresini tamamlamasına izin verin. Bu durumda, 24 saat olacaktır.

Çift taraflı bantlı mikroskop lamı, pupa kılıfını çıkarmak için geçici bir diseksiyon platformu olacaktır. Mikroskop lamı üzerindeki iki saat boyunca, pupa kılıfı kurur ve forseps ile kolayca kırılabilir hale gelir. Diseksiyonun ilk adımı, pupayı karkastan çıkarmaktır.

Daha sonra pupa, üzerine çift taraflı bant yapıştırılarak farklı bir slayta aktarılacaktır. Karkas geride bırakılacak. Bu pupa, bandın ortasına yerleştirilmiş, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde sıkışacaktır.

Kanat kesimini gerçekleştirmeden önce, pupa immünohistokimya kullanılarak yapılan işleme göre bir çözelti ile kaplanmalıdır. Bu çözelti sabitleyici olacak ve kanat kütikülden kurtulacaktır. Forseps kullanarak, operkulumu pupa kılıfından nazikçe çıkarın.

Kasayı forseps ile kırın, pupa'nın kenarı boyunca kaudal ucuna doğru bir çizgi çizin. Uygun aydınlatma ile, pupa kanadının menteşesinin hemen üzerinde belirgin bir alan yaratarak pupanın iç şeklini görselleştirmek mümkündür. Bu boşluk, pupaya zarar vermeden açılışı gerçekleştirmek için bir kılavuz görevi görür.

Kasa yanal olarak açıldığından, kısımlarını çıkarmak, açık kenarlıktan almak ve çift taraflı bandın tutacağı karşı tarafa taşımak mümkün olacaktır. Diseksiyonun sonunda, pupa neredeyse çıplak olacaktır. Sadece bir kılıf parçası arka ucu kaplayacaktır.

Forsepslerin yardımıyla, kasanın geri kalanını yavaşça aşağı doğru itin. Bu hareket, pupanın iç ucunu yükseltecek ve hem başın hem de toraksın bir sonraki adıma yapışmak için tercihli bir pozisyonda kalmasına izin verecektir. Çift taraflı bantla yeni bir slayt alın ve pupa üzerinde ters çevirin.

Ardından, pupa'nın banda yapışmasını sağlamak için hafifçe bastırın ve pupayı diğer kılıflardan çıkarmak için sürgüyü hafifçe kaydırın. Mikroskop lamını ters çevirin. Pupa sırt tarafında, baş veya göğüs bölgesi seviyesinde sıkışıp kalacaktır.

İmmünohistokimya kullanımı için tüm çıplak pupayı %4 paraformaldehit ile kaplayın. Yapıştırıcıda 10 dakika kaldıktan sonra makas yardımıyla kanadın menteşe bölgesinde veya yakınında küçük bir kesi yapın. Yapıştırıcının kanat epiteline ulaşmasına izin verin.

Daha sonra beş dakika sonra kütikül sınırlarından forseps ile yırtın, deliği genişletin ve kanat epitelinin kütikül kesesinden serbest bırakılmasını sağlayın. Kanat dokusu serbest bırakıldıktan sonra, 30 dakikalık fiksasyonu tamamlayana kadar paraformaldehit solüsyonunda bırakın. Bu videoda açıklanan diseksiyon yöntemi, birçok teknik türü için farklı gelişim aşamalarından yüksek kaliteli Drosophila pupa kanat örnekleri hazırlamak için kullanılabilir.

Protokol, bir pupayı veya birkaç pupayı aynı anda incelemek için gerçekleştirilebilir. Bu, prosedürü hızlandırmaya yardımcı olur ve diseke edilen çok sayıda kanada ulaşmayı kolaylaştırır. Çıplak pupayı açılan kılıftan çıkarmak için arka ucun yeterince küçük olması önemlidir.

Aynı anda dört veya beş çıplak pupa sırasını çıkarmak mümkün olsa da, tek bir çift taraflı bant kullanarak kılıflarına bağlı kalanları ardışık adımlarla çıkarabilmek ilgili bir nokta değildir. Bu, 24 ila 30 saatlik bir APF kanadının konfokal görüntüsüdür. Boyama, yamalı proteinin, kirpinin kanonik reseptörünün, çekirdeklerin ve aktin filamentlerinin ekspresyonunu gösterir.

Benzer bir diseksiyon işlemi, mRNA'yı izole etmek için daha büyük kanat örnekleri elde etmek için kullanılabilir. Bu mRNA, PCR reaksiyonlarında kullanılabilen cDNA'yı sentezlemek için kullanılabilir. Burada yamalı ve aktin ekspresyonunu tespit etmek için elde edilen ürünleri gösteriyoruz.

Protokol, kanadın tanıdık morfolojisini koruyan pupa kanat örnekleri elde etmek için basit bir yöntem sunar. Bu hazırlıklardan, kanadın farklılaşması sırasında proteinlerin dağılımını ve/veya zenginleşmesini araştırmak için 2D veya 3D görüntüler olarak yansıtılabilen görüntü yığınları elde etmek mümkündür. Benzer bir protokol, PCR reaksiyonlarında gerekli olan bir molekül olan cDNA'yı sentezlemek için gerekli olan büyük bir pupa kanadı örneğini toplamak için kullanılabilir.

Bu prosedür, pupa kanat diseksiyonu için daha önce yayınlanmış yöntemlere alternatif ve tamamlayıcı bir yaklaşım sağlar.