HER2 için iletişim kuralı balık bir çapraz bağlama, Formalin ücretsiz doku sabitleştirici Cryo-koruma ve Formalin fiksasyon avantajları birleştirmek için kullanma
25 Aralık 2017
Floresans in-situ hibridizasyon (balık), histopatoloji ve moleküler teşhis tedavi kişiselleştirilmiş tıp yelpazesi için birlikte genellikle gereklidir. Balık görüntülenmeden önce izin veren yüksek kaliteli morfolojik, moleküler ve balık analizleri aynı örnek buna ek olarak bir sonrası fiksasyon adım tarafından bir roman çapraz bağlama, formalin ücretsiz doku sabitleştirici.
Kişiselleştirilmiş tıp, klasik histolojiden moleküler analize kadar farklı analiz türlerini gerektirir ve en iyi tedaviyi seçmek için bir tümör üzerinde çeşitli yerinde teknikler uygulanır. Araştırma teknikleri, tek bir örnekten çeşitli analitik teknolojilere izin verir. Burada, basit formalin sonrası fiksasyon adımında çapraz bağlanmayan bir fiksatif kullanarak, orijinal olarak resmi ve sabit parafin gömülü materyal için geliştirilmiş ve doğrulanmış protokolleri kullanabileceğinizi, hücre örneğinden iyi morfoloji, iyi RNA kalitesi ve daha tam anlamda yerinde hibridizasyon için iyi sonuçlar veren kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Tipik hibridizasyon koşulları, formalin içermeyen sabit dokuların FISH sonuçları üretmesi için uygun değildir. Pektin ile sabitlenmiş dokudan karşılaştırılabilir FISH sonuçları elde etmek için kritik olanın penetrasyon değil, kimyasal düzeltme süresi olduğunu ortaya koyduk. Yalnızca FISH için kullanılan bölüm resmi ve sonrası sabittir.
Kalan formalin içermeyen sabit doku, RTPCR ile gösterildiği gibi FFP dokusuna göre üstün moleküler analiz sağlar. Laboratuvarımdaki teknisyen Daniela Pabst tarafından gösterdiğimiz prosedür. Başlamak için, yeterli doku miktarını sağlamak için meme kanseri doku örneklerini steril bir neşter ile her biri dört milimetre kalınlığında iki yarıya kesin.
Standart tamponlu formalin çözeltisi veya alternatif çapraz bağlanmayan, formalin içermeyen doku fiksasyonu yoluyla fiksasyon için maksimum 4x15x15 milimiter boyutu kullanın. Tümör örneğinin yarısını standart bir doku kasetine yerleştirin ve SBFS'ye batırın. Tümör örneğinin diğer yarısını, dört kısım fiksatif ve bir kısım doku hacim başına hacim oranı ile 24 saat boyunca alternatif fiksasyon solüsyonuna yerleştirin.
Daha sonra, alternatif olarak sabitlenmiş numuneleri, kabı açarak, doku kasetini 180 derece döndürerek ve daldırarak iki ila 72 saat boyunca stabilizatör solüsyonuna aktarın. Daha sonra, SBFS'ye sabitlenmiş numunelerin bulunduğu doku kasetlerini, artık SBFS'yi çıkarmak için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %70 etanol ile doldurulmuş bir kaba yerleştirin. Metin protokolünde açıklandığı gibi doku işleme ve gömmeyi takiben, FFPE ve NCFPE bloklarının üç mikronluk bölümünü kesmek için bir mikrotom kullanın.
Her tür bölümden bazılarını soğuk su banyosuna yerleştirin. Yüzen bölümü ince bir mikroskop lamı üzerinde ince bir boya fırçası ile alın ve ılık su banyosuna aktarın. Gerilmiş bölümleri boya fırçası ile herhangi bir kırışıklık olmadan mikroskop lamı üzerine tekrar alın.
Ayrıca, her bir bölüm tipinin bir kısmını bir reaksiyon şişesine yerleştirerek aynı numune üzerinde ters transkripsiyon PCR gerçekleştirmek için RNA izolasyonu için hazırlanın. Doku kesitlerinin deparafinizasyonu için, kesitleri 250 mililitre farklı reaktiflerle boyama kavanozlarında oda sıcaklığında kademeli olarak nemlendiriyoruz. Önce bölümleri 15 dakika boyunca iki kez %100 ksilen içine yerleştirin, ardından bölümleri 15 dakika boyunca iki kez %96 etanole aktarın.
Daha sonra, bölümleri kademeli olarak daha düşük etanol yüzdelerinden geçirin ve her bir çözeltiyi iki dakika inkübe edin. Son olarak, bölümleri 10 dakika boyunca iki kez damıtılmış hale getirin. NCFPE slaytlarının son fiksasyonunu, oda sıcaklığında 24 saat boyunca SBFS ile doldurulmuş yeni bir boyama kavanozuna koyarak gerçekleştirin.
Sabitlemeden sonraki 24 saatlik adım sırasında kavanozu çeker ocakta bırakın. Şaşırtıcı bir şekilde, 18 saatten daha uzun olan tüm sabitleme sonrası süreler, resmi ve sabit parafin materyali ile elde edilene benzer sonuçlar verdi. Slaytlardaki fazla SPFS'yi fosfat tamponlu tuzlu suda 10 dakika boyunca üç kez yıkayarak çıkarın.
İkinci yıkamayı damıtılmış suda 10 dakika boyunca iki kez takip edin. Daha sonra, 250 mililitre ısıl işlem solüsyonu sitrik içeren boyama kavanozunu 98 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Hidratlı FFPE'yi kavanozun içine sonradan sabitlenmiş NCFPE slaytlarına yerleştirin ve 15 dakika inkübe edin.
Ardından, slaytları yeni bir boyama kavanozunda oda sıcaklığında üç dakika boyunca damıtılmış suda yıkayın. Proteoliz için, slaytları 37 santigrat derecede sıcaklık kontrollü bir hibridizasyona yerleştirin. Kullanıma hazır pepsin solüsyonunu, tamamen kaplanana kadar doku bölümlerine damla damla uygulayın.
Daha sonra, hibridizasyon sisteminde 37 santigrat derecede dokuz dakika inkübe edin. Ardından, slaytları SSC yıkama tamponu içeren bir kavanoza koyun ve beş dakika inkübe edin. Slaytları oda sıcaklığında bir dakika boyunca damıtılmış suya koyun.
Bölümlerin, her biri bir dakika boyunca bir dizi dereceli alkolde dehidrasyonunu gerçekleştirin. Dehidrasyon serisinden sonra, bölümleri havayla kurutun. Hibridizasyon için, kombine HER2 ve güneş 17 probundan 10 mikrolitreyi kurutulmuş doku bölümlerine pipetleyin, her numuneyi bir kapak fişi ile örtün ve kauçuk çimento ile kapatın.
Kod, hibridizasyon sistemindeki prob ve numune DNA'sını 10 dakika boyunca 75 santigrat derecede denatüre eder. Hibridizasyon sistemi otomatik olarak 37 santigrat dereceye düşer ve hibridizasyon gece boyunca devam eder. Ertesi gün, post-hibridizasyon ve koruma için kauçuk çimentoyu ve kapak kızaklarını forseps ile dikkatlice çıkarın.
Boyutları, 37 santigrat derece önceden ısıtılmış 1X tampon A içeren bir boyama kavanozunda beş dakika inkübe edin. Ardından, önceden ısıtılmış 1X yıkama tamponu kullanarak slaytları 27 santigrat derecede beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Daha sonra slaytları her konsantrasyon için bir dakika içinde %70, %90 ve %100 etanol içinde kurutun.
Numuneleri havada kurutun ve ışıktan koruyun. Boyama için, kabarcıklardan kaçınarak hibritleştirilmiş alana 30 mikrolitre DAPI çözeltisi uygulayın. Bölümleri ışıktan koruyarak 15 dakika inkübe etmeden önce bölümleri bir örtü ile örtün.
Filtre kağıtları arasındaki sürgüye hafifçe bastırarak fazla DAPI çözeltisini dikkatlice çıkarın. Slaytları, konfokal mikroskopi ile değerlendirilene kadar iki haftaya kadar karanlıkta iki ila sekiz santigrat derecede saklayın. Yeşil ve turuncu kanallar için filtrelerle görüntüleri elde edin.
Metin protokolünde açıklandığı gibi RNA kalitesinin veri yorumlamasına ve değerlendirmesine devam edin. Burada gösterilen, resmi ve sabit numuneden elde edilen sonucun ve sonradan sabitlenmiş çapraz bağlanmayan sabit numunenin doğrudan karşılaştırılmasıdır. Sinyaller benzer yoğunluktadır ve arka plan da benzerdir.
Normal interfaz hücrelerinde, HER2 lokusuna ve sen 17 referans lokusuna karşılık gelen eşit sayıda kırmızı ve yeşil sinyal vardır, bu da HER2 geninde amplifikasyon olmadığını gösterir. Burada gösterilen, HER2 geninin amplifiye edildiği başka bir durumun sonucudur ve HER2 lokusu için referans genden çok daha güçlü ve daha geniş bir sinyal vardır. Bu fenomen resmi ve sabit ve çapraz bağlanmayan sabit dokuda belirgindir.
Bu grafik, GAPDH mRNA'nın farklı amplikon uzunlukları için amplifikasyon etkinliğini göstermektedir. Formalin için yaklaşık 23 döngü gereklidir ve çapraz bağlanmayan sabit malzeme için bu 20 döngüye düşürülür. Fark, daha uzun amplikonlarda daha belirgin hale gelir, bu da hem parçalanmanın hem de kimyasal modifikasyonun, çapraz bağlanmayan fiksatifler kullanılarak belirgin şekilde azaldığını gösterir.
Bu videoyu izledikten sonra, pre-analitik prosedüre basit bir sabitleme sonrası adım ekleyerek, çapraz bağlanmayan sabit materyal üzerinde FFPN materyali için FDA onaylı bir anahtarın nasıl kullanılabileceğini iyi anlamalısınız. Bu tekniğin ana avantajı, sadece tam anlamda yerinde hibridizasyon için kullanılan bölümün formalin ile sonradan sabitlenmesi için olması, kalan bloğun ise çapraz bağlı olmayan fiksatifte sabitlenmesi ve bu nedenle geniş bir moleküler analiz spektrumu için kullanılabilmesidir. Bu protokol, nispeten küçük tümörlerden çoklu analizlerin yapılması gerektiğinde ve farklı protokoller için doku örneklerinin işlenmesinin mümkün olmadığı modern kişiselleştirilmiş tıp bağlamında özellikle yararlıdır.
Ayrıca, çapraz bağlanmayan bir fiksatif kullanmak, kriyoprezervasyon gibi doku özelliklerini koruma avantajına sahiptir. Bu, sıvı nitrojenin dondurulması ve kimyasal bağlamda bir soğutma zincirinin sürdürülmesi ihtiyacını ortadan kaldırır. RNA kalitesindeki bu farklılıklar belirgin değildir, bu nedenle RNA bütünlük numaraları gibi klasik RNA kalite kontrol testleri kullanılırken, bu testler sabit ve parafine gömülü malzemeden izole edilen RNA kalitesinde tam olarak biçimlendirici değildir.
Genel Bakış
Bu çalışma, aynı örnekten yüksek kaliteli morfolojik, moleküler ve FISH analizlerine olanak tanıyan, çapraz bağlanma yapmayan ve formalin içermeyen yeni bir doku sabitleyicisi sunmaktadır. Bu yöntem, tek bir tümör örneğinden çeşitli analitik teknikleri entegre ederek kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımlarına imkan sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Moleküler Tanı
Arka Plan
- Kişiselleştirilmiş tıp, optimal tedavi seçimi için çeşitli analizler gerektirir.
- Floresan yerinde hibridizasyon (FISH), moleküler tanılar için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel fiksasyon yöntemleri, çeşitli analizler için doku kalitesini bozabilir.
- Sonuçların kalitesini artırmak için yeni bir fiksasyon yöntemi önerilmiştir.
Çalışmanın Amacı
- FISH için çapraz bağlamayan bir fiksatifin etkinliğini göstermek.
- Formalinle fikse edilmiş ve formalin içermeyen fiksatiflerle fikse edilmiş dokulardan elde edilen sonuçları karşılaştırmak.
- Tek bir örnekten birden fazla analizi entegre eden bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Meme kanseri doku örnekleri bölünmüş ve farklı yöntemler kullanılarak tespit edilmiştir.
- FISH sonuçlarını iyileştirmek için tespit sonrası adımlar uygulanmıştır.
- RNA izolasyonu ve hibridizasyon için standart protokoller uyarlanmıştır.
- Sonuçların görüntülenmesi ve analizi için konfokal mikroskopi kullanılmıştır.
Ana Sonuçlar
- Çapraz bağ oluşturmayan fiksatif, iyi morfoloji ve RNA kalitesi sağlamıştır.
- FISH sonuçları, formalinle fikse edilmiş dokulardan elde edilenlerle karşılaştırılabilir düzeydeydi.
- Yeni fiksasyon yöntemiyle üstün moleküler analiz gerçekleştirildiği gösterilmiştir.
- 18 saatten daha uzun olan fiksasyon sonrası süreler optimal sonuçlar vermiştir.
Sonuçlar
- Yeni fiksasyon yöntemi, aynı doku örneğinden yüksek kaliteli analizler yapılmasına olanak tanır.
- Bu yaklaşım, birden fazla tanı tekniğini entegre ederek kişiselleştirilmiş tıbbı destekler.
- Yöntemin daha fazla valide edilmesi, klinik ortamlardaki uygulamasını geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektör Uygunluğu
Bu protokol, sınırlı tümör dokusu için birden fazla tanısal analizin yarıştığı kişiselleştirilmiş tıp iş akışlarındaki temel bir darboğazı gidererek, tek bir örnekten doku morfolojisinin ve moleküler bütünlüğün eş zamanlı olarak korunmasını sağlar. Bloğun geri kalan kısmını RNA tabanlı analizler için saklarken formalinle sonradan fikse edilmiş kesitlerde FISH analizine olanak tanıyan bu yöntem, numune bölünmesine gerek kalmadan paralel histopatolojik ve moleküler tanıları destekler. Bu yaklaşım, pre-analitik değişkenliği azaltarak ve aynı tümörden elde edilen transkriptomik verilerle HER2 durumunun doğrudan karşılaştırılmasını sağlayarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Komşu doku kesitlerinden HER2 gen amplifikasyonu ve RNA kalitesinin eş zamanlı değerlendirilmesine olanak tanıyarak terapötik hipotezlerin mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler.
- Operasyonel Değer: Histopatolojik ve moleküler analizler için ayrı FFPE ve dondurulmuş blok ihtiyacını ortadan kaldırarak doku tüketimini azaltır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Sinyal yoğunluğunu ve arka plan eşdeğerliğini FFPE kontrolleriyle aynı düzeyde tutan, böylece analiz tekrarlanabilirliğini sağlayan, standartlaştırılmış ve FISH ile uyumlu bir iş akışı sunar.
- Operasyonel Değer: Mevcut FISH protokollerinin basit bir fiksasyon sonrası adımla uyarlanmasına olanak tanıyarak, tanı laboratuvarları için yeniden doğrulama çalışmalarını en aza indirger.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: FFPE'den daha üstün RNA kalitesini koruyarak, FISH sonuçlarının yanı sıra biyobelirteç onayı için RT-PCR gibi aşağı akış uygulamalarına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Amplifikasyon verimliliğini engelleyen nükleik asit çapraz bağlanmasını önleyerek, arşivlenmiş dokulardan boylamsal moleküler profillemeyi destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, pipeline'ın erken aşamalarında FISH tabanlı hedef doğrulamasına olanak tanırken aynı zamanda aşağı akışlı -omik uygulamaları için materyal koruyarak, hipotez testinden aday belirlemeye kesintisiz bir geçiş sağlayarak keşif sürekliliğine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: HER2 FISH sinyallerinin aynı örneğe ait gen ekspresyon verileriyle doğrudan korelasyonuna olanak tanıyarak hipotez sorgulamasını destekler.
- Tarama: FFPE ile karşılaştırılabilir nicel FISH çıktıları sunarak, preklinik modellerde hedef amplifikasyon durumunun güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
- Analizler: Hedef önceliklendirmedeki devam/durdur kararlarına temel oluşturan HER2/kromozom 17 sinyal oranlarını ve RNA bütünlük metriklerini sağlar.
- Translasyonel Araştırma: FISH sonrası dokunun moleküler analiz edilebilirliğini koruyarak keşif ve preklinik çalışmalar arasında köprü kurar ve biyobelirteç odaklı stratifikasyonu kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kombine FISH ve moleküler profilleme gerektiren onkoloji endikasyonları genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir doku hazırlama platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: RNA degradasyonundan kaynaklanan yanlış negatifleri azaltarak ve multimodal veri entegrasyonuna olanak tanıyarak hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Erken aşama keşiflerde nadir veya küçük tümör örnekleri için kritik olan doku kullanım verimliliğini iyileştirir.
- Stratejik Değer: Histopatoloji, FISH ve moleküler verileri tek bir biyolojik bağlamda hizalayarak hedef seçimindeki riskleri azaltır.
- Portföy Etkisi: Biyolojik belirsizliği azaltan tutarlı tanısal okumalar aracılığıyla riskle uyumlu ilerleme kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- Çift fiksasyon iş akışlarını yönetmek için histoloji, FISH ve moleküler biyoloji konularında uzmanlık gerektirir.
- Formaline, çapraz bağ oluşturmayan fiksatiflere ve standart hibridizasyon ekipmanlarına erişime bağımlıdır.
- Karşılaştırılabilir FISH sonuçları sağlamak için ekipler arasında post-fiksasyon süresinin (>18 saat) standardize edilmesi gerekir.
- Adaptasyon hususları arasında, formalin post-fiksasyonu öncesinde çapraz bağ oluşturmayan fiksatiflerle sabitlenmiş dokuda prob penetrasyonunun ve sinyal stabilitesinin doğrulanması yer alır.
- Pratik kısıtlama: Sadece FISH için kullanılan kesit formalin post-fiksasyonuna tabi tutulur; blokun geri kalanı, kapsamlı çapraz bağlama gerektiren FFPE optimize edilmiş analizler için uygunsuz kalmaya devam eder.
