Kimlik ve metastatik faktörler gen transferi ile karakterizasyonu roman RIP-etiketinin içine; RIP-tva fare modeli

Bu prosedürün genel amacı, Novel RIP-Tag'e gen transferi yoluyla metastatik faktörleri tanımlamak ve karakterize etmektir; RIP-tva fare modeli. Bu yöntem, kanser metastazı alanındaki itici güçlerin ve Yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu fare kanser modelinin temel avantajı, pankreas beta hücre öncüsü lejyonlarına somatik gen transferi yoluyla metastatik faktörleri tanımlamaktır.

Enfekte olacak fare başına 15 santimetrelik bir virüs üreten DF1 hücresi tabağı hasat ederek başlayın. İlk olarak, ortamı birleşen 15 santimetrelik tabaklardan toplayın. Daha sonra, önceden soğutulmuş bir santrifüjde 1650 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca düşük hızlı santrifüjleme ile hücre kalıntılarını çıkarın.

Daha sonra, viral süpernatanı poliallomer ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Bir ultrasantrifüjde 1.5 saat boyunca 9540 kez G ve dört santigrat derecede döndürün. Ultrasantrifüj tüplerinden mümkün olduğunca fazla süpernatan çıkarın.

Ardından, 15 santimetrelik tabak başına son 100 mikrolitre viral süspansiyonu yapmak için ultrasantrifüj tüpüne PBS ekleyin. Tüpleri laboratuvar filmi ile örtün ve görünmez viral peleti orta hızda iki dakika boyunca girdaplayarak yeniden süspanse edin. Ardından ultrasantrifüj tüplerini bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede sallayın.

İnkübasyondan sonra, viral süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve virüsü titre etmeye devam edin. 12 oyuklu doku kültürü plakasına oturtulan DF1 hücrelerinin %30 birleşmeye ulaştığından emin olarak titre etme prosedürüne başlayın. Her viral titre tayini için bir on iki oyuklu plaka gereklidir.

Viral süpernatantların on kat seri seyreltilmesine başlayın, önce beş mikrolitre viral süpernatanı bir mikrosantrifüj tüpünde 495 mikrolitre büyüme ortamı ile karıştırarak on ila ikinci seyreltme yapın. Birkaç saniye kısa bir süre girdap. Daha sonra, on ila üçüncü seyreltme için bir mikrosantrifüj tüpünde on ila ikinci seyreltmenin 40 mikrolitresini 360 mikrolitre büyüme ortamına aktarın.

Birkaç saniye kısa bir süre girdap. Dördüncüye on ve beşinciye on ile seyreltmek için bu işleme devam edin. Daha sonra, beş altı mililitrelik polistiren tüpün her birine 2.25 mililitre büyüme ortamı ekleyin.

Ve onları sırasıyla onuncu ila altıncı, on ila yedinci, on ila sekizinci, on ila dokuzuncu ve on ila onuncu olarak etiketleyin. On ila altıncı seyreltme için altı mililitre polistiren tüpte on ila beşinci seyreltmenin 0.25 mililitresini 2.25 mililitre büyüme ortamı ile karıştırın. Birkaç saniye kısa bir süre girdap.

Prosedürü on ila yedinci, on ila sekizinci, on ila dokuzuncu ve on ila onuncu seyreltme için tekrarlayın. Daha sonra, orijinal kültür ortamını 12 oyuklu plaka üzerindeki DF1 hücrelerinden çıkarın. Ve her bir kuyucuğa iki kez bir mililitre seyreltilmiş virüs ekleyin.

Hücrelerin en az yedi gün boyunca 37 santigrat derece ve 5 CO2'de büyümesine izin verin. Enfeksiyon prosedürüne önce yedi haftalık bir RIP-Tag RIP-tva fareyi uyuşturarak başlayın. Kornea kurumasını önlemek için her iki göze de göz kayganlaştırıcı uygulayın.

RIP-Tag RIP-tva farenin göğüs boşluğundaki tüyleri tıraş edin, fareyi göğsü yukarı bakacak şekilde emici bir laboratuvar tezgahı kağıdının üzerine sıkıca sarılan güvenli bir ısıtıcının üzerine sırt üstü yatırın. Hayvanın tepkisizliğini kontrol etmek ve tam anestezi etkisini doğrulamak için bir ayak parmağını sıkıştırın. Ön uzuvları uzatın ve bantla sabitleyin.

Enjeksiyon için farenin göğsünü işaretleyin. Sternal çentik ile ksifoid sürecin üst kısmı arasındaki konumu ve sternumun anatomik olarak hafifçe solunu işaretleyin. Daha sonra göğüs ön duvarını povidon iyot ovma veya klorheksidin ovma ile ovalayın, ardından %70 izopropil alkol veya %70 etanol ile ıslatılmış gazlı bez sünger ile ovalayın.

500 mikrolitrelik bir şırınganın piston ile menisküsü arasında boşluk oluşturmak için steril 28,5 gauge insülin şırıngasına 50 mikrolitre hava çekin. 100 mikrolitre virüs çizin. Duvarda herhangi bir sıvı bulunmayan hava sahası, kalp nabzını görmek için çok önemlidir.

İğneyi dik tutun, farenin derisini bir elinizle gergin tutun ve iğneyi işaretli yere yerleştirin. Şırıngada parlak kırmızı bir kan nabzı göründüğünde, iğneyi ilerletmeyi bırakın ve iğnenin derinliğini bir elinizle fareye sabitleyin. Viral süspansiyonu yaklaşık 60 saniyelik bir süre boyunca iletmek için pistonu dikkatlice ve yavaşça itmek için diğer elinizi kullanın.

Şırıngada parlak kırmızı bir kan nabzı göründüğünde 10-20 mikrolitre verin. Kırmızı oksijenli kanın şeffaf iğne göbeğine sürekli girişi, iğnenin sol ventriküle doğru konumlandırıldığını gösterir. Viral süspansiyon sağlamak için yağmanın son itişinden sonra ve bir sonraki kırmızı kan nabzını görmeden önce, iğneyi göğüs boşluğundan hızla geri çekin.

Kanamayı azaltmak için enjeksiyon bölgesine en az bir dakika boyunca hafif bir baskı uygulayın. Ardından, tamamen bilinçli olana kadar fareyi dikkatlice bir ısıtma yastığının üzerine veya bir ısı lambasının altına hareket ettirin. RIP-Tag RIP-tva fareleri, yedi haftalıkken belirtilen RCASBP-Bcl-xL retro virüsü ile enfekte edildi ve 16 haftalıkken ötenazi yapıldı.

Bu fotoğraf, pankreas lenf nodlarındaki metastatik pankreas nöroendokrin tümörlerinin temsili sinaptofizin boyamasını göstermektedir. Burada RIP-Tag RIP-tva fareleri belirtilen RCASBP-RHAM B ile enfekte edildi.Bu fotoğraf, pankreas lenf nodlarındaki metastatik pankreas nöroendokrin tümörlerinin temsili sinaptofizin boyamasını göstermektedir. Burada RCASBP-RHAMM B virüsünün enjeksiyonundan sonra karaciğerde sinaptofizin lekelenmesi görülür.

RIP-Tag RIP-tva faresinde çoğalan TVA hücrelerinin in vivo enfeksiyonu için mililitre başına on ila sekiz enfeksiyöz birimin daha büyük olduğunu hatırlamak önemlidir ve RCASBP retro viral rektörü 2,5 kilobaza kadar CDNA sağlayabilir. Bu fare modelinin geliştirilmesinden sonra, BCL-xL'nin aslında antiapoptotik işlevinden bağımsız olarak kanser metastazını teşvik ettiğini bulan bir paradigma değişimine yol açtı.