Name: Tümörlerin İndüksiyon ve Teşhisi Drosophila Imaginal Disk Epiteli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Keşfedin Drosophila imaginal disklerinde GAL4-UAS sistemiyle tümör indüksiyonu ve fenotip sınıflandırması. Bu yöntem kanser modellemesinde tümör gelişim aşamalarını anlamak için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Makalenin eleştirel okunması için J. Vaughen&#39;e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, JSPS KAKENHI Grant Numaraları 26891025, 15H01500 ve YT&#39;ye Takeda Bilim Vakfı Araştırma Yardımı hibeleri tarafından desteklenmiştir.

1. Fly Haçlar ve Klon İndüksiyonu <ol><li> Bakire flies toplamadan önce flakona 12 saat boyunca tüm sinekler çıkarın. </li><li> Şişe içindeki sinekleri CO 2 gazı enjekte ederek anestezi altına alın ve CO 2 sineklik pedi üzerine sinek yerleştirin. </li><li> 10 - 20 bakire dişiyi ve 10 erkek, CO 2 sineklik pedinden yeni bir tüp içine aktarın ve 1 gün süreyle 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bu sinekleri yeni bir flakona aktarın ve 12 saat 25 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: Bakire dişiler ilk gün yeterli miktarda yumurta bırakmadığı için ilk flakonu atın. </li><li> Geliştirici-GAL4 hatları için, yetişkin sinekleri çıkarın ve diseksiyona kadar 25 ° C&#39;de flakonu inkübe edin. </li><li> Mozaik klonların flip-out-GAL4 ile indüksiyonu için, yetişkin sinekleri çıkarın ve 25 ° C&#39;de 2-4 gün inkübe edin. Isı şoku öncesi inkübasyon süresi deneysel amaca bağlıdır. Yumurta tortulaştırmasından 2 gün sonra bir ısı şoku (AED) olgunlaşmamış ikinci mozaik klonlar üretirInstar imaginal epitel. 3 veya 4 gün sonra bir ısı şoku AED, erken-orta üçüncül instar imaginal epitelyumda ayırt edilen mozaik klonlar üretir. NOT: Değiştirilmiş ısı şoku zamanlamasının tümöre özgü fenotipler üzerindeki etkisini incelemek önemlidir. </li><li> Mozaik klonların flip-out-GAL4 ile indüksiyonu için flakonu, 37 ° C&#39;lik bir su banyosuna 10-45 dakika batırın, ardından 25 ° C&#39;de 2 - 3 gün inkübe edin. NOT: Her bir deneydeki ısı şoku zamanı, zamanlaması ve kuluçka süresi bilgileri şekil şekillerinde gösterilmiştir. </li></ol> 2. Larvaların Diseksiyonu <ol><li> Bir flüoresan stereoskopik mikroskop altında uygun floresan işaretleyiciler ( örn. , EGFP) tarafından genotip onları ahşap bir sopa veya künt forseps ile dolaşıp üçüncü instar larvaları toplayın ve onları PBS (fosfat tamponlu salin) ile bir diseksiyon çanak yerleştirin. </li><li> 2 mL plastik transfer pipet ile pipetleme PBS içinde larvaları yıkayın. </li><li>Bir forsepsle larva merkezini sıkıştırın ve diğer forsepslerle vücudunuzu yarısı kadar yırtın. </li><li> Ön yarımın ağız kancasını bir forsepsle sıkıştırın ve vücudu içeri doğru dışarı çevirmek için ağzı diğer forsepslerle vücuda doğru itin. </li><li> Tükrük bezleri veya yağ cisimleri gibi gereksiz malzemeleri forsepsle çıkarın. </li></ol> 3. Fiksasyon ve Antikor Boyama <ol><li> 1.5 mL&#39;lik bir plastik tübün içine larval gövdenin (yarı kanat diskleri dahil) disseke edilmiş ön yarısını aktarın ve yumuşak rotasyon ile karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca Fix çözeltisinin 1 mL&#39;sinde (PBS&#39;de% 4 formaldehid) sabitleyin. DİKKAT: Formaldehit zehirlidir ve kanserojen potansiyeline sahiptir. Cilt ile temasını önlemek için koruyucu eldiven ve kıyafetler giyin. NOT: Bu bölümde, aksi belirtilmediği sürece, tüm basamaklar karanlıkta oda ısısında bir besleyicide gerçekleşir. </li><li> Fix çözümünü çıkarın ve atın. Dokuları 1 mL PBT (% 0.3 TritPBS&#39;de X-100 üzerinde) üç kez üç kez 15 dakika boyunca uygulandı. </li><li> PBT&#39;yi çıkarın ve 1 saat süreyle oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C&#39;de 1 saat süre ile bloke edip 1 saat süreyle bekletin. PBTG (PBT&#39;de% 0,2 sığır serumu albumin ve% 5 normal keçi serumu) 1 mL ekleyin. </li><li> PBTG&#39;yi çıkarın ve PBTG ile uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve gece boyunca 4 ° C&#39;de hafifçe kavrayın. </li><li> Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile üç kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> PBT&#39;yi çıkarın ve PBTG (1: 400) ile uygun şekilde seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca veya 4 ° C&#39;de gece boyunca nutatlayın. </li><li> İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> F-aktin lekesi için, PBT&#39;yi çıkarın ve PBS (1:40) içinde uygun şekilde seyreltilmiş Phalloidin çözeltisi ekleyin. Sonra 20 dakika boyunca kestirin. Phalloidin çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Nükleer DNA&#39;yı kontrast haline getirmek için PBT&#39;yi çıkarın ve DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisini ekleyin (PBS içerisinde 0.5 μg / mL DAPI). Sonra 10 dk. DİKKAT: DAPI kanserojen potansiyele sahiptir. Cilt ile temasını önlemek için koruyucu eldiven ve kıyafetler giyin. </li><li> DAPI çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> 1 mL PBS&#39;de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir kez yıkayın. </li><li> PBS&#39;yi çıkarın ve ön montaj ortamı olarak 500 μL% 100 gliserol ekleyin. </li></ol> 4. Mikroskop Slaytlarına Monte Edilmesi <ol><li> 2 mL plastik transfer pipet kullanarak mikroskop lamı üzerine lekelenmiş dokuları yerleştirin. </li><li> Dokuları, forseps ile başka bir mikroskop slayt üzerinde montaj orta damla için aktarın. </li><li> Diseksiyon dokusunun ucunu bir forsepsle basılı tutun ve diğer forsepslerle beyin ve göz antennal disklerini çekin. NOT: Parçalanmış beyinleri kanat görüntü disklerine yakın konumda tutun. Beyin, lamellerin kanat imgesel disklerini ezmesini engelleyen bir platform gibi hareket eder. </li><li> Kanat imaginal disklerini izole etmek için diseksiyon yapılan dokunun ucunu bir forsepsle tutun ve vücut duvarını hafifçe çizin ve diğer forsepslerle diskleri yırtın. NOT: Kanat imaginal diskleri bulmak zorsa, trakeayı posteriordan anteriora doğru soyun. Kanat imaginal diskleri trakeaya yapışır. </li><li> Düşünceli diskleri bir lamel ve nail polisaj ile hafifçe örtün; 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 5. Konfokal Mikroskopi <ol><li> Bir konfokal mikroskop kullanarak konfokal görüntüler elde etmek için emisyon dalga boyu aralığı, lazer yoğunluğu, kazanç, ofset, tarama hızı ve görüntü boyutu dahil olmak üzere görüntü toplama parametreleri ayarlayın 24 . NOT: Görüntü elde etme ayarlarının ayrıntılı prosedürü için, her mikroskop üreticisinin verdiği kullanım kılavuzuna bakın. </li><li> Tek bir ortak yakalamak içinTüm kanat imgesel diskinin nfokal bölümleri, 20X nesnel bir lens kullanın. </li><li> 40X veya 60X mercekleri kullanarak 0,5 - 1,0 μm adım boyutunda z-yığın taraması ile 3 boyutlu görüntüler elde edin. NOT: Yüksek çözünürlükte hücresel fenotipleri analiz etmek için bir görüntü boyutu 512 x 512 pikselden daha büyük olmalıdır. </li></ol> 6. ImageJ kullanarak Görüntü Analizi <ol><li> Konfokal z-yığın görüntülerini elde etmek ve analiz etmek için biyolojik görüntü analizine (https://fiji.sc/) 25 odaklanmış açık kaynaklı ImageJ yazılımı olan Fiji&#39;yi kullanın. </li><li> Dikey bölümler elde etmek için, ImageJ&#39;deki z-yığın görüntülerini açın ve &quot;Image / Stacks / Reslice&quot; menü öğesini seçin. NOT: Reslice menüsünde XZ ekseni veya YZ ekseni seçilebilir. Düşey kesit, z-yığın resmine düz bir çizgi veya dikdörtgen çizerek keyfi bir yönde de elde edilebilir. </li></ol> 7. Neoplastik Fenotiplerin Teşhisi <ol><li> Dikey açmaBir dizi z-yığın görüntüsünden elde edilen kesitler (XZ veya YZ ekseni) ve morfolojik fenotipleri ve antikor boyamasını analiz eder. </li><li> Tümör fenotiplerinin teşhisi için, esas olarak aşağıdaki üç noktaya odaklanmak: (1) knockdown klonları da dahil olmak üzere bir hücre kitlesi ana epitel tabakasından saparsa, (2) junctional proteinlerin subselüler lokalizasyonu bu hücre kütlesi içinde değişirse Ve (3) eğer bu hücre kütlesinin çapı 4 hücreden büyükse. </li><li> Şekil 1&#39;de açıklanan akış şemasına göre tümör fenotiplerini kategorize edin. </li></ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10647931">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li>
<li>Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+cancer+research.+An+expanding+role%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila in cancer research. An expanding role.</a> Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).</li>
<li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).</li>
<li>Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity+and+proliferation+control%3A+links+from+the+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors.</a> Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).</li>
<li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble%2FDlg%2FLgl+polarity+module%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).</li>
<li>Huang, L., Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+protein+alterations+in+carcinoma%3A+a+focus+on+emerging+roles+for+polarity+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li>
<li>Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+tumor+suppression+and+epithelial+maintenance+by+endocytic+activation+of+Eiger%2FTNF+signaling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).</li>
<li>Tamori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Lgl+and+Mahjong%2FVprBP+in+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition.</a> PLoS Biol. 8 (7), e1000422(2010).</li>
<li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+diverts+a+host+TNF+tumor+suppressor+activity+into+tumor+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li>
<li>Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ligand+Sas+and+its+receptor+PTP10D+drive+tumour-suppressive+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition.</a> Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).</li>
<li>Vaughen, J., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit-Robo+Repulsive+Signaling+Extrudes+Tumorigenic+Cells+from+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia.</a> Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).</li>
<li>Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Tumors+Originate+in+Tumor+Hotspots%2C+a+Tissue-Intrinsic+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment.</a> PLoS Biol. 14 (9), e1002537(2016).</li>
<li>Ohsawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+oncogenic+neighbors+by+JNK-mediated+engulfment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila.</a> Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).</li>
<li>Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tumor-suppressing+mechanism+in+Drosophila+involving+cell+competition+and+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).</li>
<li>Hogan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+interface+between+normal+and+transformed+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells.</a> Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).</li>
<li>Kajita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+surrounding+normal+epithelial+cells+influences+signalling+pathways+and+behaviour+of+Src-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Scribble+causes+cell+competition+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells.</a> J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).</li>
<li>Wagstaff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+cell+competition+kills+cells+via+induction+of+lethal+p53+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels.</a> Nat Commun. 7, 1-14 (2016).</li>
<li>Kajita, M., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC%3A+Epithelial+defence+against+cancer-cell+competition+between+normal+and+transformed+epithelial+cells+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals.</a> J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Jory, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+6%2C300+genomic+fragments+for+cis-regulatory+activity+in+the+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).</li>
<li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).</li>
<li>Rodrigues, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+STAT+regulates+growth+and+induces+competitive+interactions+independently+of+Myc%2C+Yorkie%2C+Wingless+and+ribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis.</a> Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).</li>
<li>Khan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+neoplasia+in+Drosophila+entails+switch+to+primitive+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).</li>
<li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li>
<li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li>
<li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+design%3A+how+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li>
<li>Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+junctions+maintain+tissue+architecture+by+directing+planar+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation.</a> Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).</li>
<li>Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+peptide+Dilp8+coordinates+Drosophila+tissue+growth+with+developmental+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing.</a> Science. 336 (6081), 582-585 (2012).</li>
<li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

GAL4-UAS sistemi, Drosophila 26&#39;da hedef gen ekspresyonu için en güçlü genetik araçlardan biridir ve in vivo tümör hücresi indüksiyonu ve analizini büyük ölçüde kolaylaştırır 4 . Bu sistem, transforme edilmiş pro-tümör hücrelerinin normal epitel hücreleri tarafından çevrelendiği insan kanserinin başlangıç ​​aşamalarına oldukça benzer bir durum olan, vahşi tipli epitel dokusunda tümör baskılayıcı genlerin dökülmesini veya kanserojenlerin aşırı ekspresy...

Epitel dokuları, gelişim ve hücre döngüsü yoluyla organizasyonlarını sürdürmek için olağanüstü homeostatik kabiliyet gösteren oldukça organize sistemlerdir. Bununla birlikte, bu sağlam kendi kendini düzenleyen sistem, tümör gelişiminde aşamalı olarak bozulmaktadır. Tümör gelişiminin başlangıcında, bir onkojen aktivasyonundan ya da tümör süpresör geni inaktivasyonundan kaynaklanan mütasyona uğramış hücreler epitel tabakasında ortaya çıkar. Bu &quot;tümör öncesi hücre&quot;, baskılanmış bir ortamdan kaçınır, epitelin düzenlenmesini bozar ve kontrolsüz çoğalmaya başlar, tümörojenez oluşur 1 . Son birkaç on yıl içinde, genetik ve moleküler biyolojideki olağanüstü teknolojik gelişmeler kanser araştırmaları konusunda kayda değer ilerlemeler kaydetti. Özellikle, Drosophila melanogasterinde genetik olarak mozaik analiz araçlarını kullanan, FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase hedefi) mitoz rekombinası gibi son çalışmalarAtion 2 ve flip-out-GAL4-UAS (upstream aktivasyon dizisi) sistemleri 3 , tümörler 4 , 5 , 6&#39;nın oluşumu ve metastazında rol oynayan genetik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına büyük katkı sağladı. Korunmuş Drosophila tümör süpresör genleri, ölümcül dev larvalar ( lgl ), büyük diskler ( dlg ) ve karalamalı ( scribble ) bir grup üzerinde yapılan çalışmalar, bu genlerin önemli rol oynadığı için epitel organizasyonu kaybı ile tümör gelişimi arasındaki kritik ilişkiyi vurguladı Epitelyal dokularda apikal-bazal hücre polaritesi ve hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde 7 . Drosophila imaginal diskleri normal olarak tek tabaka epiteliyken, bu üç genin herhangi birindeki homozigot mutasyonlar, hücrelerin yapısını ve polaritesini kaybetmesine neden olur, farklılık oluşturmazlarKirletir, aşırı yayar ve nihayetinde komşu dokularla kaynaşan çok tabakalı amorf kütleler oluşturur 7 . Benzer bir şekilde, memelilerde, bu genlerin bozulması, kötü huylu tümörlerin 8, 9 gelişiminde ilgilenmektedir. Mutant dokular tarafından sergilenen neoplastik fenotipler, bu üç genin korunmuş, neoplastik tümör baskılayıcı genler (nTSG&#39;ler) 7 , 8 olarak sınıflandırılmasına yol açtı. Homozigot nTSG mutant hücrelerinin düzensiz FLP FRT aracılı mitotik rekombinasyon kullanılarak vahşi tip hayali diskler geliştirilmesinde oluşturulur Bununla birlikte, mutant hücreler, c-Jun N-terminal kinazın (JNK) bağlı apoptoz 10, 11 aracılığıyla dokunun elenir , 12 , 13 , 14 , ekstrüzyon 15 </suP&gt; , 16 veya komşular tarafından yutkunma ve fagositoz 17 . Bu genetik olarak mozaik epitelyumda, apoptoz çoğunlukla klon sınırında yer alan nTSG mutant hücrelerinde saptanır ve bitişik normal hücrelerin nTSG mutant hücrelerinin apoptozunu tetiklediğini düşündürür. Bu , 10 , 11 , 12 , 18 . Memeli hücrelerinde yapılan son çalışmalar bu tümör öncesi hücrelerin hücre rekabetine bağlı eliminasyonunun kansere karşı evrimsel olarak korunmuş epitelyal bir kendini savunma mekanizması olduğunu doğruladı 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Bununla birlikte, Drosophila imaginal disklerinde yapılan yeni bir çalışmada, mozaik nTSG knockdown klonlarının spesifik olarak neoplastik tümörleri indüklediği gösterilmiştirKanat imgesel disklerin buz bölgeleri 16 . Başlangıçtaki tümör oluşumu periferik &quot;menteşe&quot; bölgesinde daima bulundu ve kanat disk epitelinin merkezi &quot;kese&quot; bölgesinde asla gözlenmedi, bu, nTSG knockdown hücrelerinin tümörojenik potansiyelinin yerel ortama bağlı olduğunu düşündürdü. Merkezi kese bölgesi, pro-tümör hücrelerinin displastik aşırı büyüme göstermediği bir &quot;tümör soğuk noktası&quot; olarak işlev görürken, çevresel menteşe bölgesi &quot;tümör sıcak noktası&quot; olarak davranır 16 . &quot;Soğuk nokta&quot; kese bölgelerinde, nTSG knockdown hücreleri bazal taraftan laminatlaşır ve apoptozise girer. Aksine, &quot;sıcak nokta&quot; menteşe hücreleri, bazal yanlarında sağlam bir sitokkelet yapıları ağı bulunduğundan, nTSG knockdown hücreleri epitelin apikal yanından kat katlanır ve tümöre özgü aşırı büyümeyi başlatır 16 . Bu nedenle, imgesel disklerdeki tümör fenotiplerinin analizi dikkatli bir şekilde yapılmasını gerektirirTümöre özgü uyarılara bölgeye spesifik yatkınlığın azalması. Burada, normal kanat disk epitelinde nTSG knockdown hücrelerinin üretildiği GAL4-UAS- RNAi sistemini kullanan Drosophila kanat imaginal disklerinde neoplastik tümör oluşumunu indükleyen bir protokolü açıkladık. Bu deneysel sistemler kanserin erken safhalarını incelemek için yararlı olsa da, imaginal disk epitelyumundaki tümör progresyon evrelerini değerlendirmek için açık bir sınıflandırma yöntemi daha önce açıklanamamıştır. Bu nedenle, kanat diski epitelyumunda indüklenen tümör öncesi klonal fenotipleri üç kategoriye ayırmak için bir teşhis metodu öneriyoruz: Hiperplazi (artmış proliferasyonu olan aşırı miktarda normal görünen hücrelerin birikimi), displazi (anormal olarak görülen premalign doku Hücreler) ve neoplazi (benign veya malign tümör, anormal görünüm ve anormal proliferasyon paternine sahip hücrelerden oluşur).

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>normal keçi serumu</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>montaj ortamı, Vectashield</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>fare-anti-Dlg 4F3</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>4F3 anti-diskler büyük, RRID: AB_528203</td><td>PBTG'de seyreltik, 1:40</td></tr><tr><td>fare-anti-MMP1</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 karışık 1:1:1 ve PBTG'de seyreltik, 1:40</td></tr><tr><td>fare-anti-MMP1</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 karışık 1:1:1 ve PBTG'de seyreltik, 1:40</td></tr><tr><td>fare-anti-MMP1</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 karışık 1:1:1 ve PBTG'de seyreltik, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-atubulin</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>AA4.3, RRID:</td><td>PBTG'de seyreltik AB_579793, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Moleküler problar</td><td>A22283</td><td>PBS'de seyreltik, 1:40</td></tr><tr><td>keçi anti-fare IgG antikoru, Alexa Fluor 546</td><td>Moleküler problar</td><td>A11030</td><td>PBTG'de seyreltik, 1: 400</td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı <</td><td>strong>Company </td> <td> Katalog Numarası< / güçlü></td><td>Comments<</td></tr><tr><td>strong>Fly suşları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>#8609</td>, <td>UAS-EGFP</td></tr><tr><td>upd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>#26796</td><td>UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-lgl-RNAi</td><td>Viyana Drosophila RNAi merkezi</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>UAS-scrib-RNAi</td><td>Viyana Drosophila RNAi merkezi</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>UAS-RasV12</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>UAS-Yki3SA</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>hsFLP</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>Act>CD2>GAL4 (dışa çevrilebilir GAL4)</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>#4780</td>, <td>UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>#5428</td><td>X kromozomu</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>#6658</td><td>üçüncü kromozom</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington ile yeniden birleştirildi Drosophila Stok Merkezi</td><td>#24650</td><td>ikinci kromozom</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>#24651</td><td>üçüncü kromozom</td></tr><tr><td>vkg-GFP</td><td>Morin ve ark. 2001</td><td></td><td>GFP protein tuzağı</td></tr></tbody></table>

tümörlerin İndüksiyon ve teşhisi<em&gt; drosophila</em&gt; imaginal disk epiteli

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Kanserin erken evrelerinde, dönüştürülmüş mutant hücreler sitolojik anormallik gösterir, kontrolsüz aşırı büyümeye başlar ve doku organizasyonunu giderek bozmaktadır. Drosophila melanogaster , tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için kanser biyolojisinde popüler bir deneysel model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, Drosophila imaginal diskler için genetik araçlar (larvalarda gelişen epitel), insan kanserinin başlangıç ​​evrelerine benzer bir durum olan normal bir epitel dokusunda dönüştürülmüş pro-tümör hücrelerinin oluşturulmasını sağlar. Bununla birlikte, Drosophila kanat imaginal disklerinde yapılan tümörigenez üzerine yakın tarihli bir çalışmada, tümör başlangıcının doku intrensek sitolojik mimarisine ve yerel mikro çevreye bağlı olduğunu göstermiştir; bu, imaginal olarak tümör fenotiplerini değerlendirmede tümöre özgü uyarılara bölgeye spesifik duyarlılığın göz önüne alınmasının önemli olduğunu düşündürmektedir diskler. Tümör gelişiminin fenotipik analizini kolaylaştırmakİmaj disklerinde, burada, kanat imgesel disklerinde neoplastik tümörleri indüklemek için GAL4-UAS sistemini kullanan genetik deneyler için bir protokolü açıklıyoruz. Daha önce tarif edilmemiş olan, tümör progresyonunun çeşitli aşamalarını (hiperplazi, displazi veya neoplazi gibi) ayırt etmek için net bir sınıflandırma yöntemi olduğu için, imaginal epitelde indüklenen klonal lezyonların fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi daha sunuyoruz. Bu yöntemler, Drosophila&#39;daki çeşitli organlarda tümör fenotiplerinin klonal analizi için geniş çapta uygulanabilir.

Drosophila kanat imaginal disklerinde RNAi aracılı nTSG-knockdown ile deneysel olarak indüklenen neoplastik tümör oluşumunu göstermek için lgl veya scrib için UAS-RNAi ifade etmek için üç farklı GAL4 sürücüsü kullanılmıştır: (1) sd-GAL4, güçlü UAS ekspresyonunu Kanat çantası ve menteşe bölgelerinde hafif ifade ( Şekil 2 ve Şekil 3A ); (2) dorsal medial katmanın iki alanındaki...

Drosophila imaginal disk epitelyumunda mozaik klon analizi, tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir model sistemidir. Burada, GAL4-UAS sistemini kullanarak Drosophila kanat imaginal disklerinde tümörleri indüklemek için bir protokolü tarif eder ve tümör fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi sunmaktayız.

Tümörlerin İndüksiyon ve Teşhisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disk Epiteli

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan Drosophila imaginal disklerinde tümörojenik mozaik klonlar oluşturmak ve ardından klonal lezyonları tümör gelişiminin çeşitli aşamalarına göre sınıflandırmaktır. Bu yöntem, kanser modellemesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin tümörlerin nasıl tutarlı bir şekilde indükleneceği ve ilerleme aşamalarının nasıl sınıflandırılacağı gibi.Bu tekniğin temel avantajları, Drosophila kanat imaginal disklerine tümör enjeksiyonunun basit sinek genetiği kullanılarak gerçekleştirilmesi ve tümör gelişim aşamalarının sınıflandırılmasının basit bir tanı olmasıdır. Prosedürü gösteren Kenta Morimoto'ya, laboratuvarımdan teknisyen Kimiko Morimoto eşlik edecek. Genetik çaprazlamanın kurulmasıyla başlayın.Çaprazlama için bakireler toplanmadan 12 saat önce, olgun pupalar içeren şişelerdeki tüm yetişkin sinekleri temizleyin. Ertesi gün, genetik olarak mozaik döl üretmek için bir çaprazlama kurun. 12 ila 20 bakire ile 10 erkeği taze bir şişeye aktarın ve 25 °C'de bir gün boyunca inkübe edin.24 saat sonra, sinekleri yeni bir şişeye aktarın ve yerleştikleri ilk şişeyi atın. 12 saat sonra yumurtalar elde edilebilir hale gelecektir. Erişkinleri 12 saatlik aralıklarla yeni şişelere aktarın ve deney için dölü kullanın.Yumurta tüpleri 25 °C'de iki ila dört gün boyunca inkübe edildikten sonra, flip-out GAL4 ile mozaik klonların indüksiyonu için larvaları 37 °C'lik bir su banyosu kullanarak on ila 45 dakika boyunca ısı şokuna tabi tutun. Gelişimin ikinci gününde ısı şoku uygulamak, olgunlaşmamış disklerde klonlar oluşturacaktır. Gelişimin üçüncü veya dördüncü gününde ısı şoku uygulamak ise daha geç evredeki disklerde klonlar oluşturacaktır.Isı şokundan sonra, üçüncü instar larvalar hazır olana kadar tüpleri 25-derece Celsius inkübatöre geri yerleştirin. Başlamak için, gezgin üçüncü instar larvaları PBS içeren bir Petri kabına aktarmak amacıyla tahta bir çubuk veya küt uçlu pens kullanın. Ardından, mozaik larvalar için uygun floresan belirteçleri tanımlamak amacıyla larvaları floresan ışık altında genotipleyin.Devam etmeden önce larvaları PBS ile yıkayın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında, iki çift pens kullanarak larvanın merkezini sıkıştırın ve gövdeyi ortadan ikiye ayırın. Sonrasında, gövdeyi tersyüz etmek için ağız kancalarını sıkıştırırken ağzı gövdeye doğru itin.Ardından, tükürük bezleri ve yağ cisimcikleri gibi gereksiz materyalleri uzaklaştırın. Larvalar artık, metin protokolünde detaylandırılan fiksasyon ve antikor boyama işlemleri için hazırdır. Boyanmış doku preparatlarını, iki mililitrelik plastik transfer pipeti kullanarak bir mikroskop lamı üzerine aktarın.Ardından, pens yardımıyla her bir larvayı bir mikroskop lam üzerindeki montaj ortamı damlalarına taşıyın. Şimdi, pens kullanarak imaginal diskleri izole edin. Diseke edilen dokunun ucunu sabit tutarak başlayın ve diğer pensle beyni ve göz-anten disklerini çekerek ayırın.Beyinleri kullanıma hazır halde tutun. Şimdi kanat imajinal disklerini bulun. Kanat imajinal diskleri, diseke edilen dokunun lateral tarafına yapışıktır.Ardından, dokuyu bir pensle sabitleyin ve kanat disklerini nazikçe kazıyarak ayırın. Daha sonra, beyinleri lameli yerleştirirken ezilmelerini önlemek için kanat disklerinin yanına konumlandırın. Şimdi, yapıların üzerini nazikçe bir lamel ile kapatın ve lameli oje ile mühürleyin.Slaytı dört derece Celsius'ta saklayın. Konfokal Z-yığın görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskop kullandıktan sonra, görüntüleri ImageJ'de açın ve sanal kesitler oluşturmak için Reslice komutunu kullanın. Bu kesitler X-Z ekseninde, Y-Z ekseninde veya özelleştirilmiş bir düzlemde oluşturulabilir.Özelleştirilmiş düzlemi oluşturmak için Z-stack görüntüsü üzerine düz bir çizgi veya dikdörtgen çizin ve bilgisayarın ilgili kesiti oluşturması için komutları takip edin. Tümör fenotipleri için dokuyu teşhis etmek amacıyla bu tür kesitleri kullanın. Öncelikle, ana epitel tabakasından sapan veya dışa doğru büyüme gösteren hücre kütlelerini belirleyin.Ardından, her bir kitle için, junctional proteinlerin hücre altı lokalizasyonunun normal görünüp görünmediğini belirleyin. Diğer değerlendirmeler arasında kitlenin boyutu ve kitle içindeki artmış hücre proliferasyonuna dair herhangi bir belirti yer alır. Böylece, tümör tipi tanımlanmış olur.Bu örnekte, görüntüleme yazılımı tarafından oluşturulan dikey kesitler kullanılarak dört klon sınıflandırılmıştır. İşaretli DLG proteininin yanlış lokalize olması nedeniyle ikisi displazi olarak sınıflandırılmıştır. Klon B, dört hücreden daha küçüktür ve Klon C, epitelyumdan sapma göstermez.Bu nedenle, ne B ne de C neoplazm olarak sınıflandırıldı. Diğer iki klon da DLG'nin yanlış lokalizasyonunu gösterdi ve epitelyumun dışında tümöral hücre kütleleri oluşturdu. Bu yer değiştirmiş tümöral klonların boyutu çap boyunca dört hücreden fazla olduğu için, bu klonlar neoplastik olarak sınıflandırıldı.Tanımlanan yöntemler kullanılarak, sd-GAL4 tarafından yönlendirilen RNAi aracılığıyla wing-pouch ve menteşe bölgelerinde LGL geni susturulmuştur. RNAi transgenini taşımayan kontrollerde, üçüncü instar kanat disklerinde herhangi bir morfolojik değişiklik gözlenmemiştir. Gen susturmalarında ise, menteşenin belirli bölgelerinde epitelyal deformasyonlar ve tümörjenik aşırı büyümeler açıkça gözlemlenmiştir.Buna karşın, kanat kesesi bölgesinde displastik aşırı büyüme gözlenmedi. Bu durum, söz konusu bölgelerde, metastatik yetenek sağlayan bir protein olan MMP1 ekspresyonu ile ters korelasyon gösterdi. LGL nakavtının tetiklediği tümör büyümesinin ilerlemesini izlemek amacıyla, tarif edildiği üzere kanat disklerinde LGL-RNAi eksprese eden sporadik klonlar oluşturuldu.İkinci instar larvalarda ısı şokundan iki gün sonra, menteşe bölgesindeki bazı knock-down klonları epitel tabakanın apikal tarafından sapma gösterdi. Isı şoku indüksiyonundan dört gün sonra, menteşe bölgesindeki displastik lezyonlar belirginleşti; bu durum, apikal taraftan yer değiştiren LGL knock-down klonlarının lümende çoğaldığını düşündürmektedir. Isı şoku indüksiyonundan yedi gün sonra, menteşe bölgelerinde tümörojenik aşırı büyümeler baskın hale geldi.Flip-out GAL4 sistemleri kullanılırken, ısı şoku zamanlamasındaki değişikliklerin klonal fenotipler üzerindeki etkisini incelemenin önemli olduğu unutulmamalıdır; çünkü imaginal disk hücrelerinin tümör oluşturma potansiyeli, gelişimsel aşama endojen sinyal olaylarına veya hücresel farklılaşmaya bağlı olabilir.

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu protokol, 3. instar aşamada Drosophila larvaları hayali diskler izole etmek için kullanılan diseksiyon tekniği göstermektedir. Söyleyerek sonra doku sabitleme ve kanat, bacak ve göz diskleri çıkarmadan Yöntemleri sonraki görünüm için doğrudan bir mikroskop lamı üzerine göstermiştir.

3. Instar Drosophila Larva hayali Disklerin Diseksiyon

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Drosophila hayali diskleri boyanırken, genellikle disklerin açıkta kaldığı ancak vücuda bağlı kaldığı kaba bir diseksiyon yapılır. Lekelendikten sonra, ilgilenilen diskler izole edilir ve monte edilir. Örnek protokol, kanat hayali disk diseksiyonu ve montajı için bir prosedürü göstermektedir.

Drosophila Larva Hayali Disk Diseksiyonu: Gelişmekte Olan Epiteli Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

RAS V12 ve karalanmış, tümör hücreleri de invaziv davranışlar sergileyen Drosophila tümör büyüme neden gibi hücre polarite genlerindeki mutasyonlar gibi bir aktive onkogen arasındaki işbirliği. Burada iyi huylu ve invaziv tümörlerin indüksiyon ve gözlem için basit bir protokol verilmektedir.

Arasında Cephalic Kompleksi Genetik İndüksiyon ve Benign ve İnvaziv vizüalizasyonun için Protokol<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila'nın yetişkin yapıları, hayali diskler adı verilen kese benzeri yapılardan türetilmiştir. Bu disklerin analizi, doku tayini, kompartman sınırı oluşturma, hücre proliferasyonu, hücre kaderi spesifikasyonu ve düzlemsel hücre polaritesi dahil olmak üzere birçok gelişimsel süreç hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, ışık/floresan mikroskobu için hayali diskleri hazırlamak için kullanılır.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren Drosophila melanogaster

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Burada, Drosophila gastrulasyonunun canlı görüntülerini yakalamak için bir prosedürü açıklıyoruz. Bu, erken gelişimde yer alan apikal daralmayı daha iyi anlamamızı ve doku yapısı modifikasyonu sırasında hücresel hareketleri yöneten mekanizmaları daha fazla analiz etmemizi sağladı.

Hücre Şekli Alteration ve Hücre Hareketi Görüntüleme Drosophila Gastrulasyon kullanarak DE-kaderin Muhabir Transgenik Sinekler

Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Canlı Drosophila kanadı hayali disklerindeki bitişik epitel tabakalarındaki hücreler arasındaki temasları GFP sulandırma tabanlı bir yaklaşım kullanarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi

Bu makale, reaktiflerle ekonomik olan ve az sayıda hayali disklerin işlenmesini kolaylaştıran verimli bir imaginal disk diseksiyon ve antikor boyama protokolünü tanımlar.

Drosophila melanogaster'den Göz-Antenli ve Kanat Hayali Disklerinin Küçük Ölçekli Diseksiyonu ve Antikor Boyama

Keşfedin Drosophila imaginal disklerinde GAL4-UAS sistemiyle tümör indüksiyonu ve fenotip sınıflandırması. Bu yöntem kanser modellemesinde tümör gelişim aşamalarını anlamak için güvenilir bir protokol sunar.

Tümörlerin İndüksiyon ve Teşhisi

Daha fazla video keşfet