Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout'larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Bu prosedürün amacı, iki tip CRIPSR/Cas9 aracılı genom düzenlemesi tarafından üretilen klonal nakavt hücre dizilerini izole etmek ve tanımlamaktır. Bir yöntem, homolog olmayan uç birleşmenin neden olduğu protein nakavtını tespit ederken, diğeri homolojiye yönelik onarım tarafından üretilen genomik bozulmaları tespit eder. Bu yöntem, genetik bozulmalara sahip hücre dizilerinin üretilmesinin gen fonksiyonunun diseksiyonunda önemli bir araç olduğu moleküler biyoloji alanında özellikle yararlıdır.

Bu tekniğin temel avantajı, temel moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak kolayca uygulanabilen hızlı ve nispeten yüksek verimli bir yöntem olmasıdır. Homolog olmayan uç birleştirme, küçük delesyonlar veya eklemeler yapar ve bir nokta immünobot ile değerlendirilirken, homolojiye yönelik onarım daha büyük ve daha kesin bozulmalara izin verir ve koloni PCR ile değerlendirilir. Bu deney, 37 santigrat derecede %10 FBS ve %5 karbondioksit ile desteklenmiş DMEM ortamında kültürlenmiş T-REx-293 hücrelerini kullanır.

Transveksiyondan önce, hücreleri altı kuyucuklu plaka üzerine yerleştirin ve transveksiyonsuz bir kontrol için bir kuyu ekleyin. Hücreleri yaklaşık% 70 birleşim noktasına kadar büyütün. Ticari bir transveksiyon protokolü kullanarak hücreleri 2.5 mikrogram toplam plazmit ile transvect edin.

Hücrelerin seçim yapılmadan transveksiyonu için 2.5 mikrogram Cas9-sgRNA plazmidi kullanın. Seçimli hücrelerin transveksiyonu için 0.75 mikrogram Cas9-sgRNA1, 0.75 mikrogram Cas9-sgRNA2 ve bir mikrogram homolog rekombinasyon şablonu kullanın. Transvected hücreleri ve transvected edilmemiş kontrolü 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 48 saat boyunca inkübe edin.

Seçim ile transveksiyona tabi tutulan hücreler için, hücreleri bu durumda Neomisin olan uygun ilaçla tedavi ederek ilaç seçimine başlayın. Altı oyuklu plakayı inkübatöre geri koyun. Transvekte edilmemiş kontroldeki tüm hücreler ölene kadar, hücre ölüm oranlarını kontrol etmek için tedavi edilen hücreleri günde bir kez gözlemleyin.

Klonal popülasyonları izole etmek için, önce hücreleri seçimden sonra orijinal kuyuda %100 birleşim noktasına kadar büyütün. Daha sonra hücrelerin seri seyreltmelerini yapın ve hücreleri sayın. Monoklonal kolonilerin uygun şekilde oluşturulması, tam bir nakavt elde etmenin anahtarı olduğundan, istenen yoğunlukta oturma hücreleri için doğru seyreltmeyi belirlemek için özen gösterilmelidir.

Doğru seyreltme belirlendikten sonra, hücreleri oyuk başına 0.33 hücre yoğunluğunda 96 oyuklu plakalara yerleştirin. Üç adet 96=kuyucuklu plaka oturtmak, birden fazla doğru klonun izolasyonunu sağlamak için iyi bir başlangıç noktasıdır. İki ila dört haftalık bir süre boyunca, koloniler gözle görülene kadar kolonileri gözlemleyin.

Bu temsili görüntüler, büyümenin farklı aşamalarındaki kolonileri gösterir. Oturmada tek bir hücre, beşinci günde hücreler ve 10. günde iyi kurulmuş bir koloni. Steril bir pipet ucu kullanarak, görünür kolonileri dikkatli ve hassas bir şekilde toplayın ve tek katmanlı büyümeyi teşvik etmek için yeni kuyucuklara yeniden yerleştirin.

Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte büyütmeye devam edin. Seçim yapılmayan nakavt adayları, protein ürününü yüksek verimli bir şekilde değerlendirmek için nokta immunoblot ile taranır. Tek tek klonları %50 ila %100 birleşme oranına kadar büyüttükten sonra, kuyu içinde pipetleyerek tek hücre tabakasını yerinden çıkarın.

Her kuyucuktan 100 mikrolitrelik toplam hacmin 90 mikrolitresini temiz bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Bu videonun amaçları doğrultusunda, yalnızca iki örnek işlenecektir. Beş dakika boyunca 6.000 RPM'de döndürün, ortamı çıkarın ve hücre paletini 10 mikrolitre 1X SDS yükleme tamponunda parçalayın.

Kuyucuktaki hücrelerin geri kalanına 90 mikrolitre yeni ortam ekleyin ve hücreleri çoğaltmaya devam etmek için plakayı inkübatöre geri koyun. Bir nokta oluşturmak için bir mikrolitre hücre lizatını kuru bir nitroselüloz membran üzerine pipetleyin. Her numuneyi iki ayrı zar üzerinde iki kez kurulayın ve iki özdeş numune modeli oluşturun.

Membranları TBST'de% 5'lik sütte oda sıcaklığında, sallanarak bir saat boyunca bloke edin. Bir saat sonra, önerilen primer antikor seyreltmesinde primer antikorlar ve TBST artı% 5 süt ile zarları kurulayın. Bu deneyde bir zar üzerinde hedef protein olan ELAVL1'e karşı birincil antikor kullanın.

Diğer zarda, değişmesi beklenmeyen bir kontrol proteini için birincil antikoru kullanın, burada PUM2 kullanılır. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Birincil antikor çözeltisini her lekeden çıkarın, TBST ekleyin ve beş dakika inkübe edin.

Bu şekilde, lekeleri TBST ile üç kez yıkayın. Daha sonra, her zara uygun HRP konjuge ikincil antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca kurulayın. Bir saat sonra, membranları her seferinde beş dakika boyunca TBST ile üç kez yıkayın.

Üreticinin talimatlarını izleyerek lekelere bir kemilüminesan substrat çözeltisi uygulayın ve lekeli zarları bir dijital kemilüminesans görüntüleyicide görüntüleyin. Son olarak, uygun yazılımı kullanarak hedef ve kontrol proteinleri için nokta yoğunluklarını ölçün ve sonuçları metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edin. Seçilebilir direnç belirtecine sahip adaylar koloni PCR ile taranır.

Bu prosedüre, tek tek kolonileri yeni bir 96 oyuklu plakada çoğaltarak ve hücre lizatlarının hazırlanması için bunları% 100 birleşim noktasına getirerek başlayın. Ortamı bir klon setinden çıkarın, hücreleri ticari bir DNA hazırlama kitinden 30 mikrolitre ekstraksiyon tamponunda her bir oyuktan yeniden süspanse edin ve temiz bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Çözeltiyi 15 dakika boyunca 96 santigrat dereceye ısıtın ve ardından oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

Her mikrosantrifüj tüpüne 30 mikrolitre stabilizasyon tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Koloni PCR ile vahşi tip ve monoalelik veya bialelik mutant hatları tanımlamak için, direnç kasetinin başarılı veya başarısız entegrasyonuna dayalı olarak homoloji kollarının etrafındaki bölgeleri yükseltmek için iki ayrı PCR primer seti tasarlayın. Her iki tarafta, homoloji kolunun dışında tavlanan ortak bir astar kullanın.

Vahşi tip aleli test etmek için, homoloji bölgesini kapsayan endojen diziye tamamlayıcı olan karşılık gelen eşleştirilmiş primer ile ortak primeri kullanın. İstenen mutasyonu test etmek için, ortak astarı, takılan direnç kasetine tamamlayıcı olan başka bir eşleştirilmiş astar ile kullanın. Test edilecek her numune için, 0.5 mikrolitre hücre lizatı, 1.25 mikrolitre 10X KOD tamponu, 0.75 mikrolitre 25 milimolar magnezyum sülfat, 1.25 mikrolitre iki milimolar dNTP, 0.375 mikrolitre ileri astar, 0.375 mikrolitre ters astar, 0.25 mikrolitre KOD polimeraz ve 7.75 mikrolitre su içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayın.

Aşağıdaki koşulları kullanarak, iki dakika boyunca 95 santigrat derece, ardından 20 saniye boyunca 95 santigrat derece 25 döngü, 10 saniye boyunca primer erime sıcaklığı ve KB başına 20 saniye boyunca 70 santigrat derece kullanarak PCR gerçekleştirin. Daha sonra, PCR ürünlerini agaroz jel elektroforezi ile görselleştirin. ELAVL1 nakavt hatları oluşturmak için homolog olmayan uç birleştirme kullanılarak genom düzenlemesi yapıldı ve ardından nokta immünoblot, ELAVL1 ve PUM2 için sondalama yapıldı. Çok az kontrol sinyali gösteren klonlar bir X ile işaretlendi ve daha fazla analizden çıkarıldı.

Düşük ELAVL1 sinyallerine sahip klonlar, western blot ile daha fazla test edildi. Onaylanan adaylar yeşil renkle, geçersiz sayılan adaylar ise gri renkle gösterilir. Bu grafik, artan sırayla protein sinyalini kontrol etmek için ELAVL1'in oranlarını göstermektedir.

Çoğu durumda, en düşük nispi ELAVL1 sinyaline sahip klonal popülasyonlar, nakavtlar olarak doğru bir şekilde tanımlandı. Homoloji yönlendirilmiş onarım yöntemi ile oluşturulan adaylar koloni PCR ile tarandı ve PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi ile görüntülendi. Gösterilenler, endojen iç primerler ve iç astarlar için nakavt kullanan yukarı akış entegrasyon bağlantısını kapsayan primerlerin kullanıldığı örnek sonuçlardır.

Primerler ilk olarak hem ebeveyn hücrelerinde hem de toplu olarak seçilen hücrelerde doğrulandı. 24 ayrı aday klondan elde edilen sonuçlar, vahşi tip, nakavt ve monoalelik delesyon klonları için beklenen bant kalıpları ile birlikte gösterilir. Siyah oklar doğru amplifikasyon ürünlerini, yıldızlar bialelik nakavt klonlarını gösterir.

Bialelik mutant çizgileri, batı blot ile daha da doğrulandı. Homolog olmayan uç birleştirme, tek bir Cas9 kesim ve seçimden bağımsız tarama kullanır, bu nedenle çok az ön hazırlık gerektirir ve nokta lekelerle nakavt klonları için tarama, bir nakavt neslinin başarılı olup olmadığını hızlı bir şekilde belirleyebilir. PCR tabanlı tarama, homolojiye yönelik onarım tarafından oluşturulan büyük genomik bozulmalara sahip doğru adayları doğru bir şekilde tespit eder.

Bu teknikler, moleküler biyolojideki araştırmacıların, hücre dizilerini kullanarak normal veya işlevsiz hücresel süreçleri keşfetmelerine olanak tanıyarak, nakavtları kolayca ve verimli bir şekilde tanımlamalarını sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme tarafından üretilen klonal nakavt hücre hatlarının nasıl izole edileceğini ve tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.