Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Bu protokolün genel amacı, spesifik genomik bölgelerdeki histon işaretlerinin dağılımını incelemek için fare T-hücre hatlarında kromatin immünopresipitasyonunu, makul bir sürede ve yüksek tekrarlanabilirlikle verimli bir şekilde gerçekleştirmektir. Bu yöntem, kromatin yapısının T-hücresi bölünmesi veya aktivasyonu sırasında nasıl düzenlendiği gibi, özellikle T-hücrelerine odaklanan kromatin biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kromatin fragmentasyonunun verimli ve yüksek düzeyde tekrarlanabilir olmasıdır.

Fenol-kloroform izoamil alkol basamakları zorlayıcı olabildiğinden ve kromatin parçalama koşullarını belirlemek güç olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Prosedürü, laboratuvarımızda doktora öğrencisi olan Francesca Ferrante gösterecektir. Birinci günde, fare T-hücrelerini altı kuyucuklu plakadan 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Ardından hücreleri 24 °C'de yaklaşık 271 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini 30 mL IMDM hücre kültür besiyerinde yeniden süspanse ettikten sonra, bir Neubauer kamarası kullanarak hücreleri sayın. 20 milyon hücrelik alikotları yeni 50 mL'lik tüplere toplayın. Daha sonra, hücre kültür besiyerine doğrudan %1 son konsantrasyonda formaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında on dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, 1 M glisin (pH 7,5) çözeltisinden toplam hacmin 1/8'i kadar ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Hücreleri 24 °C'de ve yaklaşık 271 ×g'de beş dakika santrifüj ederek çöktürün. Sonra hücre peletini 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspandirip santrifüj işlemini tekrarlayarak hücreleri yıkayın. Hücreleri 1 mL PBS ile tekrar yıkayın.

Santrifüjlemeden önce resüspande edilen hücrelerin 1,5 mililitrelik tüplere aktarılması. Kromatinin parçalanması; hücre miktarına, parçalama tüplerine, cihaza ve lizis tamponuna yanı sıra parçalama parametrelerine bağlı olduğu için en kritik adımdır. Yıkama işleminin ardından, hücre peletini bir mililitre SGS lizis tamponunda resüspande edin ve buz üzerinde inkübe edin.

10 dakika sonra, her örneği bir sonikasyon tüpüne aktarın. Ardından, metin protokolünde belirtilen ayarlara uygun olarak odaklanmış bir ultrasonikatör kullanarak parçalama (shearing) işlemini gerçekleştirin. Parçalamadan sonra, örnekleri 1,5 mililitre tüplere aktarın.

4 °C'de ve yaklaşık 18.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatantı yeni tüplere aktarın. Kesme verimliliğinin belirlenmesi için 50 µL toplayın ve kesilmiş lizatı sıvı azot içerisinde hızlıca dondurun. Lizatı, tek kullanımlık alikotlar halinde -80 °C'de saklayın.

Kesme verimliliğini belirlemek için, öncelikle her bir kesilmiş lizata 50 µL elüsyon tamponu ekleyin. Karışımları 65 °C'de, sallayarak gece boyunca inkübe edin. İkinci günde, örneklere 100 µL TE tamponu ve 4 µL 10 mg/mL Rnase A ekleyin.

Numuneleri karıştırın ve 37 °C'de, çalkalayarak iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, her numuneye 20 mg/mL proteinaz K'den iki µL ekleyin ve 55 °C'de, çalkalayarak iki saat daha inkübe edin. Sonrasında, her numuneyi fenol kloroform izoamil alkol ekstraksiyonuna uygun bir jel tüpe aktarın.

Tüpleri üretici talimatlarına göre kullanın. 200 µL fenol kloroform izoamil alkol ekleyin ve tüpleri çalkalayın. Santrifüj işleminin ardından, üst fazı yeni tüplere aktarın.

Bu işlemi bir kez tekrarlayın. Üretici talimatlarına uygun olarak, membranı iki kez yıkama işlemi hariç, DNA'yı saflaştırma kolonları kullanarak saflaştırın. Son yıkamadan sonra, kalıntı etanolün uçması için tüpü oda sıcaklığında iki dakika boyunca açık bırakın.

Elüsyon için kolona 50 µL su ekleyin ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin. Ardından, membranın uygun şekilde ıslanması için tüpü bir saniye boyunca santrifüjleyin. DNA'yı santrifüjle elüye etmeden önce membranı oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin.

Saflaştırılmış DNA'yı, üretici talimatlarına uygun olarak yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak florometrede miktar belirleyin. Son olarak, saflaştırılmış DNA'nın yaklaşık 500 nanogramını %1,8'lik agaroz jelde ve yaklaşık bir nanogramını yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak bir elektroforez sisteminde analiz edin.

Üçüncü günde, bir birim parçalanmış lizatı beş birim seyreltme tamponu ile seyreltin. Seyreltilmiş lizatı, soğuk odada rotasyon altında 30 dakika boyunca mililitre başına 30 µL Protein A agaroz boncukları ile ön temizlemeden geçirin. Numuneleri 4 °C'de, yaklaşık 750 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Temizlenmiş lizatın %10'unu girdi numuneleri olarak toplayın ve 4 °C'de saklayın.

Ardından, temizlenmiş lizattan istenen miktarda yeni tüplere paylaştırın. Daha sonra, her tüpe seçilen antikorları ekleyin ve dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca döndürün. Dördüncü günde, 40 microliter Protein A boncuğu ekleyin.

Karışımı, döndürerek 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Boncukları, döndürerek 4 °C'de beş dakika inkübe ederek 1 mL düşük tuzlu tamponla yıkayın. Ardından 4 °C'de ve yaklaşık 950 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Yıkama işlemini yüksek tuzlu tampon, lityum klorür tamponu ve TE tamponu ile tekrarlayın.

Ardından numunelere 110 µL elüsyon tamponu ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin ve her iki dakikada bir vorteksleyin. Tekrar santrifüjledikten sonra, 100 µL süpernatanı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.

Elüsyonu 100 µL elüsyon tamponu ile tekrarlayın ve elüatları birleştirin. Bu sırada, önceden toplanan girdi örneklerine 200 µL nihai hacme ulaşacak şekilde elüsyon tamponu ekleyin. Tüm örnekleri çalkalamalı olarak 65 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Beşinci günde, her bir elüata 200 µL TE tamponu ve 8 µL 10 mg/mL Rnase A ekleyin. Örnekleri, 37 °C'de çalkalayarak iki saat inkübe etmeden önce karıştırın. Ardından, her bir elüata 4 µL 20 mg/mL proteinaz K ekleyerek 55 °C'de çalkalayarak iki saat inkübe edin. Sonrasında, her bir örneği fenol kloroform izoamil alkol ekstraksiyonu için uygun bir jel tüpüne aktarın.

400 µL fenol kloroform izoamil alkol ekleyin ve tüpleri çalkalayın. Tüpleri santrifüj ettikten sonra, üst fazı yeni tüplere aktarın ve bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. Son olarak, DNA'yı daha önce olduğu gibi saflaştırma kolonlarını kullanarak saflaştırın.

Fare T-hücre hatlarının şerleme işlemine ait bu temsili sonuç, kromatinin etkili bir şekilde fragmente edildiğini göstermektedir. Burada, fare T-hücre hatlarında gerçekleştirilen temsili bir kromatin immünopresipitasyon deneyi gösterilmektedir. Temel metabolik gen olan gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenazın promotörü, histon üç üzerindeki lizin dördün trimetilasyonu açısından yüksek düzeyde zenginleşmiştir.

Ve histon 3'teki lizin 27'nin asetillenmesi için geçerlidir. Ancak histon 3'teki lizin 4'ün monometilasyonu için geçerli değildir. Aksine, inaktif deltex-1 geninin enhancer bölgesi, histon 3'teki lizin 4'ün monometilasyonu açısından oldukça zengindir.

Ancak histon üçte lizin dört trimetilasyonu ve histon üçte lizin 27 asetilasyonu için zayıf zenginleştirilmiştir. Bu prosedürü uygularken, örnekleri parçalamadan önce SDS çökeleklerini çözmeyi hatırlamak önemlidir.

Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, T-hücrelerinde gen düzenlemesini çalışırken ortaya çıktı. T-hücrelerini seçtik çünkü tıbbi uygulamalarla oldukça ilgililer ve yüksek ökaryotlarda gen ekspresyonunu incelemek için en iyi tanımlanmış model sistemlerden birini temsil ediyorlar. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, kromatin biyolojisi alanındaki araştırmacıların memeli sistemlerde kromatin düzenlemesini keşfetmelerine ön ayak oldu.

Bu tekniğin etkileri, T hücresi gen ekspresyon programlarının kurulmasının ve düzenlenmesinin ayrıntılı incelenmesine olanak tanıdığı için T hücresi ilişkili hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır. Formaldehit, fenol kloroform ve izoamil alkol ile çalışmanın son derece ciddi olduğunu ve bu prosedür uygulanırken çeker ocak altında çalışmak ve uygun koruyucu ekipman kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu yöntem fare T hücresi kromatin düzenlemesi hakkında bilgiler sağlayabilse de, endotelyal ve akciğer hücre hatları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.