Name: Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Öğrenin, hücre adezyonu sırasında lokalize translasyon olaylarını puromisin ve konfokal görüntüleme kullanarak görselleştirme ve nicel ölçüm yöntemini. Bu teknik, hücre göçü ve erken ilaç yanıtı çalışmaları için hızlı, kolay ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Hücre görüntüleme birimi teknik yardım için araştırma merkezinin teşekkür ediyoruz. M.-É. Huot olan bir Junior 1 araştırma bilim adamı Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Bu eser Kanada kurumları, Sağlık (sayı CIHR, paspas-286437 M.-É için hibe. araştırma tarafından desteklenmiştir Huot).

1. Puromycilation koşullar belirlenmesi Not: Bu teknik MRC-5 hücre adezyon işlemi 5 sırasında yerelleştirilmiş çeviri değerlendirmek için kullanılan yöntemi tanımlar. Puromycilation herhangi bir hücreyi yapılabilir gibi bu tedavi koşulları açısından puromisindir konsantrasyon ve istenen her hücre satırı için özdeş değil çünkü puromycilation koşulları kullanılmak üzere belirli hücre hatları için optimize etmek önemlidir kuluçka süresi. Bu koşullar nasıl tanımlandığını göstermek için üç örnek hücre hatları (Yani, HeLa, MRC-5 ve ha-7) için farklı kuluçka süreleri puromisindir konsantrasyonları artan ile tedavi edildi ( Resim 1).
<ol><li>Grow uygun 0.5 ml 24-şey plaka hücrelerde aynı sayıda kültür orta test önce 16 h tamamlayın. Tohum 30.000 MRC-5 hücre, 50.000 HeLa hücreleri veya iyi başına 50.000 ha-7 hücre. % 60-70 izdiham (şekil 1A) aşmasını önlemek emin olun.</li>
	<li>Puromisindir (0, 5, 10, 15, 20 ve 30 µg/mL) konsantrasyonları artan tam hücre kültür ortamının 1,5 mL ile hazırlamak 6 tüpleri. Önceden sıcak 37 ° C'de</li>
	<li>Puromisindir orta (hazırlanan adım 1.2), her toplama aktarmak için 0.5 mL her 6 yeni tüpler içine tüp ve sikloheksimit 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon tüm 6 yeni tüpler için ekleyin. Önceden sıcak 37 ° C'de</li>
	<li>Orta 0.5 mL tam kültür ortamının (satır 1 ve 2) ile değiştirin. İçin üçüncü satır, 0.5 mL 50 µg/mL ile sikloheksimit ( şekil 1B) takıma tam kültür ortamının ekleyin. 
	Not: Sikloheksimit tedavi için protein puromycilation çeviri uzama engellemek için onun yetenek nedeniyle en iyi negatif kontrol olarak kurulmuştur. Puromisindir birleşme çeviri uzamasını gerektirdiği için sikloheksimit tedavi puromycilated protein sinyalleri 5 , 18 bir kaybına neden.</li>
	<li>15dk 37 ° C'de (%5 CO 2) için kuluçkaya.</li>
	<li>0,5 mL 0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL, son konsantrasyonları sırasıyla A, B, C, D, E ve F. sütunlarda elde etmek için ikinci sırada 1.2. adımda hazırlanan puromisindir orta ekleyin Aynı zamanda, üçüncü sıradaki ( şekil 1 c) sikloheksimit takıma orta (Adım 1.3) puromisindir 0.5 mL ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL ( şekil 1 c) son konsantrasyonları elde etmek için ilk satırı 1.2. adımda hazırlanan puromisindir Orta 0.5 mL ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama her de fosfat tamponlu 1-3 1 mL olan satırları buz gibi 1 X serum fizyolojik (PBS) 5 dk sonra eklenmesi için ilk satır (iki kez yıkama) kuyu puromisindir, dan. 1 X Laemmli arabelleği 75 µL ekleyin (%4 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), % 4 2-mercaptoethanol, 0.120 M Tris HCl pH 6.8, %0,004 bromophenol mavi ve % 10 gliserol) bütün hücreli lysates her koşul için elde etmek için.</li>
	<li>Çalıştır % 10 SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) puromisindir birleşme değerlendirmek için 1/3 hazır örnekleri kullanarak.
	<ol><li>Belirleme birincil antikor kuluçka arabellek (%2 sığır serum albumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 ve %0.01 1:25,000 oranında sulandırılmış bir anti-puromisindir antikor (12 D 10) kullanarak Western blot analizi tarafından puromisindir şirketleşme düzeyi Sodyum azid). 
		Not: Resim 2 örnek olarak temsili Resim 1. adımda açıklandığı gibi yapılan farklı hücre satırı özleri karşılık gelen gösterilir.</li>
	</ol></li></ol> 2. Cellulo içinde Çeviri görselleştirme lokalize Not: Burada açıklanan tekniği SICs MRC-5 hücrelerdeki içinde yerelleştirilmiş çeviri sırasında yapışma işlemi 5 değerlendirmek için kullanıldı. MRC-5 hücreleri burada kullanılmasına rağmen diğer hücre hatları 2.1. adımda açıklanan aynı metodolojisi ile kullanılabilir.
<ol><li>Hücre hazırlık.
	<ol><li>Ayırmak MRC-5 hücrelerin % 0.25 tripsin/2.21 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) Hank kullanarak &#39; s dengeli tuz çözüm (HBSS). Santrifüjü (200 x g de 5 dk) 15 mL konik santrifüj tüpü içinde tarafından hücreleri cips ve onları Dulbecco içinde askıya &#39; s sayım odası ile sayım sonra % 10 fetal sığır serum (FBS) 40.000 hücre/mL, ile takıma modifiye kartal orta (DMEM).</li>
		<li>Süspansiyon korumak için bir tüp rotator 20 dk için kullanarak nazik döndürme altında 37 ° C'de askıya alınan hücreler kuluçkaya. 
		Not: Bu odak yapışma kompleksleri tam ayrılma için izin vermek için kritik bir adımdır.</li>
		<li>Askıya alınmış MRC-5 (40.000 hücre/mL) hücrelerde iki 35-mm cam alt tabak tabak 2 mL. İlk 35-mm cam alt çanak puromycilation tahlil için kullanın (bkz. Adım 2.1.5) ve ikinci bir negatif kontrol kullanın (bkz. Adım 2.1.6).</li>
		<li>Hücreleri hücre adezyon ve SIC oluşumu için izin vermek 55 dk. 37 ° C'de (%5 CO 2) tutmak.</li>
		<li>Ekle puromisindir orta önceden tanımlanmış 1 bölümünde konsantrasyon kullanarak 35-mm cam alt yemekleri (tahlil). MRC-5 hücreleri tedavi etmek için 10 µg/mL puromisindir 37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kullanın.</li>
		<li>Bir negatif kontrol sikloheksimit ikinci 35-mm cam alt çanak 40dakika hücreleri onları önceden 50 µg/mL sikloheksimit ( şekil 2B) ile tedavi etmek için tohum sonra ekleyin. Sonra sikloheksimit ek olarak sonra 15 dk ekleyin puromisindir aynı konsantrasyonu kuluçka bu kez adım 2.1.5 (Örneğin, kullanım 10 µg/mL puromisindir 37 ° c (%5 CO 2) MRC-5 için 5 min için) gibi orta.</li>
		<li>Yıkama her plakalı iki kez buz gibi 2 mL 1 X PBS hücreleri ile ve 1 mL (1 X PBS içinde seyreltilmiş) % 4 formaldehit 15 dakika oda sıcaklığında (RT) düzeltin. 
		Dikkat: Paraformaldehyde kesinlikle kimyasal bir mahallede kullanılmalıdır.</li>
	</ol></li> <li>Immunostaining.
	<ol><li>Pimlerle yapılan fiksasyon ardından paraformaldehyde, yıkama ile üç kez 2 mL 1 X PBS ve PBS-TritonX-100 (% 0.5) 500 µL içinde 20 dk RT hücreleri permeabilize az için kuluçkaya.</li>
		<li>Spesifik olmayan antikor bağlama önlemek için 500 µL PBS ile örnek blok &#8211; BSA (% 1) için dik, 20 dk</li>
		<li>PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile üç kez yıkayın ve 1 X PBS RT. 1 h için anti-puromisindir antikor (12 D 10) seyreltilmiş 1:12,500 300 µL ile kuluçkaya</li>
		<li>Yıkama PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile 3 kez ve anti-fare IgG Birleşik bir fluorophore 300 µL ile kuluçkaya (burada, 488 nm) puromycilated polipeptitler görselleştirmek için PBS ve phalloidin Birleşik ile seyreltilmiş başka bir fluorophore için (burada, 555 nm) F-aktin görselleştirmek için. Dik, 1 h için kuluçkaya</li>
		<li>Yıkama PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile üç kez ve daha sonra 5 1 µg/mL ile 4 takıma min için RT, içinde 300 µL PBS-Tween20 (% 0,1), kuluçkaya &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
		<li>2 mL PBS-Tween20 (% 0,1) ile üç kez yıkayın ve 2 mL 1 X PBS ile yıkayın. Hücreleri örnek 2 mL 1 X PBS resim alma sırasında tutarak kurumasını önlemek.</li>
	</ol></li></ol> 3. İmmünfloresan resim alma Not: aşağıdaki metodoloji-ebilmek var olmak kullanılmış ile piyasada bulunan herhangi bir confocal görüntüleme sistemi.
Miktar için dinamik alanı en üst düzeye çıkarmak için <ol><li>belirleme uygun ayarları için her fluorophore. 
	Not: Temsilcisi miktar yalnızca piksel doygunluk kaçınılması ve sinyal eşik düzgün ayarlanır elde edilebilir. Bu ayarları, dikkatle lazer gücü, yüksek voltaj, ayarlayarak elde kazanç, ve ofset.
	<ol><li>Ayarlama yakınlaştırma faktörü (5 X) ve piksel boyutunu optimize etmek için piksel (512 x 512). 
		Not: Bu Nyquist teoremi göre optik çözünürlük, en azından 2,3 - kat daha küçük olmalıdır.</li>
		<li>İnceden inceye gözden geçirmek hız (12,5-20 µs/piksel) azaltmak ve yukarıda belirtilen ayarlara göre sinyal-gürültü oranı artırmak için (2 - 3 kez) ortalama kullanın.</li>
	</ol></li> <li>El ile uygun üst belirlemek ve odak uçaklar en uygun adım boyu (0.4 µm/dilim) ile z ekseni boyunca alt. 
	Not: Adım boyutu uçak 2.3 tarafından bölünmüş Aksiyel çözünürlük Nyquist teoremi göre belirlenir. Genellikle 20-25 katmanları yapışık hücreleri tüm hücre derinliği karşılamak gereklidir.</li>
	<li>Tüm bir tek hücre bir 60 X Apo planı yağı daldırma hedefi (1,42 sayısal diyafram) ile confocal bir görüntüsünü elde.</li>
</ol> 4. İmmünfloresan görüntü miktar <ol><li>zenginleştirme belirlenmesi.
	<ol><li>ImageJ yazılım (freeware http://fiji.sc kullanılabilir) kullanarak alınan hücre veri dosyasından faiz z-uçak katmanına karşılık gelen bir görüntüyü açmak.</li>
		<li>Çizgi çizme aracını kullanarak çizgi çizin (araç çubuğu &#8594; düz) nerede miktar isteniyorsa hücre bölgelerinde aracılığıyla. Üzerinde çift tıklatarak çizgi genişliğini değiştirmek &#34; düz; &#34; yoğunluk değerleri (8 şekil 3 ' de ayarla) çizginin genişliğini üzerinden ortalama olarak. 
		Not: Daha ince bir çizgi sinyal örtüşme farklı yapılardan önlemek için tercih edilir.</li>
		Yolun doğru şekilde ayarladıktan sonra <li>profil kararlı eksen boyunca sinyal yoğunluğu (menü çubuğu &#8594; analiz &#8594; arsa profil). 
		Not: Seçili z-uçak bölümü için hattı boyunca sinyal yoğunluğu (özel fluorophore) seçilen kanalın her piksel için karşılık gelen bir profili gösteren yeni bir pencere açılacaktır.
		<ol><li>Tekrar işlem için kullanılan fluorophore karşılık gelen her kanal (Yani, bir miktar için 488, 568 ve 405 için bir tane). 
			Not: Sinyal yoğunluk değeri her zaman çizilmiş çizgiyi yönünü takip sıralanır.</li>
		</ol></li> <li>Gri ölçekli sayısal değerler seçili z-uçak katman quantifications için karşılık gelen profil her piksel için elde etmek için profil verileri kopyalayın (Görüntü penceresinin menü çubuğundan &#8594; kopya) ve herhangi bir elektronik tablo yazılımı yapıştırın.</li>
		Confocal elde edilen görüntünün her z-uçak bölüm ve miktar istendiği nerede her kanal için <li>Yinele adımları 4.1.1-4.1.4. 
		Not: Farklı z-uçak katmanları miktar toplam değeri her z-uçak katman hattı boyunca her pikselin hesaplayarak sinyal özel zenginleştirme genel bir değerlendirmesini elde etmek için havuza alınmış. Çizilen çizgi ortalama değerlerde dahil her z-uçak katman aynı ise bu tür havuz sadece elde edilebilir.</li>
		<li>Farklı kanalları çok sayıda Katmanlar ile bütün hücreli miktar için alternatif bir yöntem, StackprofileData olarak adlandırılan makroyu kullanmak (bkz. Ek dosya). 
		Not: Bu makro https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt serbestçe erişilebilir ve aşağıdaki gibi kullanılabilir: <ol><li>makro bir metin dosyasına yapıştırın ve bunu kaydedin</li>
			<li>Hücre confocal katmanları içerir görüntü dosyasını açın.</li>
			<li>Bir çizgi çizin, 4.1.2. adımda açıklandığı gibi makro almak için yeni bir pencere açın (menü çubuğu &#8594; eklentileri &#8594; makroları &#8594; çalıştırmak), StackprofileData makro karşılık gelen önceden kaydettiğiniz metin dosyasını seçin ve tıklatın &#34; açık. &#34; 
			Not: makro ithalat, yeni bir pencere adlı &#34; sonuçları &#34;-ecek açık ve tüm miktar kararlı eksen boyunca her z-uçak katmanı için listelenen ve resim dosyalarında mevcut kanal.</li>
			<li>Her kanal için veri kopyala (menü çubuğu &#8594; düzenleme &#8594; kopya) sinyal quantifications karşılık gelen grafik profili temsil elde etmek için. Herhangi bir elektronik tablo yazılımı yapıştırın. Her kanal boyunca her z-uçak katmanı için yolun her piksel için toplam değerini hesaplamak. Grafik şekil 3 ' te sunulan benzer oluşturmak için bu değerleri kullanın.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Sinyal belirlenmiş hücresel alanda veya birim miktar.
	<ol><li>ImageJ yazılımı ile belgili tanımlık imge eğe açık.</li>
		<li>Çizmek geometrik form işlevini kullanarak ilgi alanı belirtmek için bir alan (araç çubuğu &#8594; &#34; dikdörtgen, &#34; &#34; oval, &#34; veya &#34; çokgen &#34;). 
		Not: Çizilmiş forma karşılık gelen alan için miktar değeri belirlenecektir.</li>
		<li>Herhangi bir arka plan sinyal önlemek için eşik düzeyi ayarlamak (menü çubuğu &#8594; görüntü ayarı &#8594; eşik); piksel yoğunluklarda çubuk grafik formunda temsil etmek için yeni bir pencere açılacaktır. Kaydırıcıyı kullanarak miktar piksellerindeki içerme/dışlama üzere değerleri değiştirin. Kırmızı renkte piksel miktar dahil olarak, hücre dışında kalan kırmızı pikseller ortadan kaldıran bir eşik seçin.</li>
		<li>Arka plan sinyal olmadan seçili alanı içinde piksel sinyal ölçmek için ölçü parametrelerini tanımlamak (menü çubuğu &#8594; analiz &#8594; ayarla ölçümleri) ve kontrol etmek emin olun &#34; Eşik sınırı &#34; ve &#34; entegre yoğunluk &#34; kutuları.</li>
		<li>Seçili alan için sayısal değerleri ölçmek (menü çubuğu &#8594; analiz &#8594; ölçü birimi). 
		Not: Sinyal şiddeti miktar-ecek sunulmak altında yeni bir pencerede &#34; IntDen &#34; ürün ortalama gri değerleri ve seçili alanı içinde piksel sayısını temsil eden kimlik.</li>
		<li>Çizmek geometrik formu kullanarak hücrenin tamamını içeren bir alanı (araç çubuğu &#8594; &#34; dikdörtgen, &#34; &#34; oval, &#34; veya &#34; çokgen &#34;) ve toplam sinyal için karşılık gelen bir değer elde etmek için adımlar 4.2.3-4.2.5 ile devam edin. İlgi alanı içinde sinyal yüzde elde etmek için tüm sinyal üzerinde seçili alanı içinde sinyal oranını hesaplamak.</li>
		<li>Miktar her z-uçak için hücre hacmi elde etmek için Yinele adımları 4.2.2-4.2.6. Geometrik formu gerektiği gibi uyum.</li>
		<li>Kopyala/Yapıştır üzerinden elde edilen veriler &#34; sonuçları &#34; windows için grafik tasvir ve ortalama bir değer bulmak için bir elektronik tabloya her z-uçak katmanı için.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Translation+of+Single+mRNA+Molecules+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo.</a> Cell. 165, 976-989 (2016).</li>
<li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352, 1425-1429 (2016).</li>
<li>Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+dynamics+of+single+mRNAs+in+live+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons.</a> Science. 352, 1430-1435 (2016).</li>
<li>Halstead, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRICK%3A+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).</li>
<li>Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+translation+regulates+cell+adhesion+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration.</a> J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).</li>
<li>El Fatimy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+in+a+Highly+Ordered+Neuronal+RiboNucleoParticles+Population%3A+A+Link+between+Stalled+Polyribosomes+and+RNA+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules.</a> PLoS Genet. 12, e1006192(2016).</li>
<li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib%2C+a+multikinase+inhibitor%2C+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).</li>
<li>Paronetto, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sam68+regulates+translation+of+target+mRNAs+in+male+germ+cells%2C+necessary+for+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis.</a> J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).</li>
<li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUnSET%2C+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nat Methods. 6, 275-277 (2009).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Goodman, C. A., Hornberger, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+synthesis+with+SUnSET%3A+a+valid+alternative+to+traditional+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Exerc+Sport+Sci+Rev%22%5BJournal%5D)">Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques.</a> Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).</li>
<li>Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+muscular+atrophy%3A+the+role+of+SMN+in+axonal+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation.</a> Brain Res. 1462, 81-92 (2012).</li>
<li>Costa-Mattioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+by+the+eIF2alpha+kinase+GCN2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2.</a> Nature. 436, 1166-1173 (2005).</li>
<li>Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+long-lasting+synaptic+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory.</a> Neuron. 61, 10-26 (2009).</li>
<li>Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+cells+move+messages%3A+the+biological+functions+of+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).</li>
<li>Ephrussi, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+the+bicoid+morphogen+gradient+matures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures.</a> Cell. 116, 143-152 (2004).</li>
<li>Mardakheh, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Analysis+of+mRNA%2C+Translation%2C+and+Protein+Localization%3A+Local+Translation+Is+a+Key+Regulator+of+Cell+Protrusions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions.</a> Dev Cell. 35, 344-357 (2015).</li>
<li>Lacsina, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translational+termination+products+are+rapidly+degraded+substrates+for+MHC+class+I+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation.</a> PLoS One. 7, e51968(2012).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+human+diploid+cell+designated+MRC-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5.</a> Nature. 227, 168-170 (1970).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Son teknolojik gelişmeler mekanizmaları translasyonel upregulation ilgili daha iyi bir anlayış ya da nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz gibi biyolojik süreçleri içinde belirli mRNA'ların baskı için izin vermiş. Burada açıklanan düşük maliyetli metodoloji nasıl RNA bağlanıcı proteinler hücre adezyon, geçiş ve işgali gibi metastatik işlemleri düzenleyen çalışma hücrelerdeki görüntülenmeyecektir çeviri olayları sağlar.
De novo protein çeviri değerlendirmek için çeşitli yön...

Farklı hücresel işlevler tarafından çeviri Yönetmeliği yeni araçlar ve mRNA çeviri ve düzenlenmiş protein sentezi1,2 hücre altı lokalizasyonu belirlemek için yöntemler geliştirmek için birçok araştırma ekipleri yol açtı ,3,4. Bu son teknolojik gelişmeleri içeren çeviri upregulation veya belirli mRNA'ların baskı nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz5 gibi biyolojik süreçler sırasında mekanizmaları gelişmiş bir anlayış için izin ver ,6,7,8. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı veya tehlikeli Kimyasalları ve çoğu laboratuvarları kullanılabilir olmayabilir belirli donanımları gerektirir. Bu nedenle, özellikle bu olası sorunları aşmak için çeviri olaylar hızlı değerlendirmesi için izin vermek için uygun maliyetli bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem belirli hücresel süreçler sırasında ortaya çıkan akut translasyonel modülasyon algılar ve ayrıca confocal mikroskobu kullanarak Çeviri Yerelleştirme için sağlar.
Yöntem tanımlamak burada yerelleştirilmiş çeviri Yayilim başlatma merkezleri (SIC)5denilen hücre altı bölmeleri içinde izlemek için kullanılmıştır. SICs yeni doğmakta olan yapışma kompleksleri üzerine yerelleştirilmiş numaralı seribaşı hücrelerde bulunan geçici yapılar vardır. SICs ve yapışma kompleksler farklı olmakla birlikte, onların kaderi yakından bağlantılıdır. Gerçekten de, SICs giderek odak yapışma karmaşık olgunlaşma bir yapışma siteye yapışma başlangıç aşamasında ortadan olduğu bilinmektedir. Bulduk RNA bağlanıcı proteinler özellikle mRNA çeviri (Örneğin, Sam68, FMRP ve G3BP1) kontrol etmek için bilinen ve RNA'ların bunlar içinde zenginleştirilmiş poliadenile yapıları5. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, SIC ilişkili mRNA çeviri bir denetim noktası olanak verecek şekilde davranır düzenlenmesi hücre adezyon birleştirilecek hücreler seribaşı gösterdi. Bu yöntemi, puromisindir birleşme göre yüzey çeviri tahlil (SunSET) algılama adapte bir sürüm düşünülebilir. Aslında sigara radioactively etiketli bir amino asit kullanarak küresel protein sentezi oranları ölçmek için geliştirilmiş, protein puromycilation de novo protein sentezi9görselleştirmek için etkili bir yol sunar. Bu yöntem puromisindir, çeviri erken zinciri fesih ribozom10üzerinden engeller bir antibiyotik iç davranışını kullanır. Gerçekten de, puromisindir yapısal olarak tyrosyl-tRNA, peptid zincirleri bir peptit bağı oluşumu ile elongating içine şirketler için sağlar benzerdir. Ancak, puromisindir bağlama büyüyen bir peptit zincirine yeni bir peptit bağı puromisindir tRNA içinde bulunan hydrolysable ester bağı yerine hydrolysable Amid bağı olduğundan sonraki aminoasil tRNA ile oluşturulmaktadır engeller. Böylece, erken sürümü ile aktif olarak çevrilmiş mRNA9,11' e,12 karşılık gelen çok sayıda kesilmiş puromycilated polipeptitler polipeptitler elongating içine puromisindir birleşmesiyle sonuçları .
Bu yöntemi kullanarak, kısa sürede dul içinde aktif çeviri değerlendirmek mümkün (Örneğin, 5 min) hücresel yapışma antibiyotik ile 5 dk süre takviye hücrelerde puromisindir karşı spesifik bir antikor kullanarak sırasında hücre adezyon sırasında farklı zaman noktalarda5işlem. Çok özel antikorlar karşı puromycilated yan yönettiği bu tahlil duyarlığını güvenmektedir. Puromycilated polipeptid immünfloresan tespiti de confocal görüntüleme sistemleri kullanarak büyük bir hassasiyetle sayısal yeni çevrilmiş mRNA genel hücre altı yeniden bölümlenir sağlar.
Bu nedenle, bu yöntem çok sayıda translasyonel düzenleyici mekanizmaları nöronal granülasyon6,13,14, gibi süreçleri dahil eğitim laboratuvarları için ilgili bir seçenek sunar 15, morphogen mRNA Yerelleştirme ve çeviri sırasında geliştirme16,17. Ayrıca hızlı biyolojik olaylarda, hücre göç, yapışma veya işgal gibi veya sadece translasyonel değişiklikleri5, neden ilaç tedavileri değerlendirmek için yerelleştirilmiş veya bölümlere çeviri eğitimi için de uygun olduğu 7 , 18. genel olarak, bu yöntem, hızlı, hassas ve düşük maliyetli bir şekilde yerelleştirilmiş veya kontrollü çeviri olaylar görselleştirme için sağlar.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>wisent</td><td>325-043 EL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Puroycin antikoru 12D10</td><td>EMD milipore</td><td>MABE343</td><td>western blot seyreltme 1: 25.000 İmmünofloresan seyreltme 1: 10.000</td></tr><tr><td>Anti-fare IgG, HRP'ye bağlı Antikor</td><td>hücre sinyali Teknoloji</td><td>7076</td><td>Western Blot Seyreltme 1:8.000</td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare IgG (H + L), F (ab') 2 Fragman (Alexa Fluor 488 Konjugat)</td> <td>hücre sinyalizasyon teknolojisi</td><td>4408</td><td>immünofloresans seyreltme 1:400</td></tr><tr><td>CF568 Phalloidin</td><td>biotium</td><td>00044</td><td>immünofloresan seyreltme 1:400</td></tr><tr><td>Sikloheksid</td><td>Sigma</td><td>C1988-1G</td><td>50 ve mikro; g / ml nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)</td> <td>İnvitrojen</td><td>D1306</td><td>nihai konsantrasyon 1 & mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>biyo-Temel</td><td>PJ593</td><td>2.5 ve mikro; g / ml ila 10 ve mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Ibidi &micro;-Dish 35 mm, yüksek, ibiTreat</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>HeLa hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7 hücreleri</td><td>Dr. Mazroui'den (Universit&eacute; Laval)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fv1000</td><td>olympus</td><td></td><td>konfokal görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>Fiji yazılımı</td><td></td><td></td><td>http://fiji.sc</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td><td>bio-Basic</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit %37 Çözelti</td><td>biyo-Basic</td><td>C5300-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>bio-Basic</td><td>TB0198</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

MRNA çeviri düzenleyen mekanizmalar mikrop çizgi geliştirme, hücre farklılaşma ve organogenesis, gibi çeşitli biyolojik süreçlerin yanı sıra birden çok hastalıklar söz konusu. Çok sayıda yayın inandırıcı belirli mekanizmaları sıkıca mRNA çeviri düzenleyici göstermiştir. Çeviri kaynaklı protein ifade Yönetmeliği artan ilgi çalışma ve de novo protein sentezi cellulo içindetakip roman yöntemleri gelişmesine neden olmuştur. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı yapım onları ve kez okudu olabilir mRNA hedef sayısını sınırlama, karmaşıktır. Bu makale yalnızca temel reaktifler ve ölçmek ve herhangi bir hücre satırında çeşitli koşullarda oluşan değişiklikleri mRNA çeviri görselleştirmek için bir confocal floresan görüntüleme sistemi gerektirir bir yöntem öneriyor. Bu yöntem son zamanlarda zaman böylece biyolojik çeşitli sırasında kısa bir süre için de novo çeviri görselleştirme imkanı sunan, kısa bir süre içinde yapışık hücreleri hücre altı yapıları yerelleştirilmiş çevirisini göstermek için kullanılan işlemler veya değişiklik translasyonel faaliyet belirli uyaranlara yanıt olarak doğrulanması.

Doğru bir şekilde puromisindir birleşme kullanarak çeviri olayları gözlemlemek için her farklı puromisindir birleşme Kinetik (şekil 1)9,11 gösterir çünkü her hücre satırı için en uygun koşulları belirlemek için önemlidir ,12,18. Bu nedenle, puromisindir birleşme doğrulamak için istenen hücre kültürünü puromisindir konsantrasyonları...

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Bu deneyin genel amacı, hücre yapışmasının başlangıç aşamalarında meydana gelen bölmelenmiş translasyon olaylarını görselleştirmek ve nicelleştirmektir. Bu yöntem geniş bir uygulama alanına sahiptir. Hücre göçü, yapışması veya erken ilaç yanıtı analiz edildiğinde olduğu gibi, hızlı ve spesifik translasyon yanıtlarının değerlendirilmesi gereken her durumda bu yöntemi kullanın.Bu tekniğin temel avantajları; kolay, hızlı ve maliyet etkin olmasıdır. Yalnızca puromisin, puromisine karşı yönlendirilmiş antikorlar ve standart konfokal tarama görüntüleme sistemi gerektirir. Başlamak için, MRC-5 hücrelerinden bir süspansiyon hazırlayın.Tripsinizasyon uygulayın, ardından santrifüjleme yapın, süpernatantı uzaklaştırın ve sonrasında mililitre başına 40 bin hücre olacak şekilde yüzde on FBS içeren DMEM içinde yeniden süspanse edin. Fokal adezyon komplekslerinin tamamen ayrışması için süspansiyonu hafif rotasyonla 20 dakika inkübe edin. Bu adım kritiktir.Ardından, iki adet 35 mm cam tabanlı kaba ikişer mililitre süspansiyon alikotu ekleyin ve hücresel yapışma ile SiC oluşumu için inkübe edin. 40 dakika sonra, plaklardan birini sikloheksimid ile işleyin ve inkübatöre geri yerleştirin. Bu plak neg

quantitative-immunofluorescence-to-measure-global-localized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, herpes simpleks virüsü-1 enfeksiyonunda enfekte hücre proteini 0, ICP0 trafiğini izlemek için bir yöntem göstermektedir. Post-de novo sentez, ICP0 çekirdeğe yer değiştirir ve daha sonra enfeksiyon ilerlemesi sırasında sitoplazmaya hareket eder. İmmünofloresan mikroskobu, proteinin hücre altı lokalizasyonunu ortaya çıkarır ve analiz ederek, enfeksiyon aşamaları boyunca kaçakçılığına ilişkin içgörüler sunar.

Enfekte Hücrelerde Viral Protein Lokalizasyonu için Bir İmmünofloresan Tekniği

Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA'ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici...

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

Burada, bir proteinin floresan yoğunluğunu uygun bir iç standardınkine normalleştirerek, özellikle sentrozomlarda bir proteinin seviyesindeki değişiklikleri ölçmek için yeni bir kantitatif floresan testi geliştirilmiştir.

Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Golgi sakinlerinin kesin yerelleştirme Golgi hücresel işlevlerini anlamak için önemlidir. Ancak, geleneksel optik mikroskobu alt-Golgi yapısı dönüştürememiş demektir. Burada iletişim kuralı için kantitatif bir protein alt-Golgi yerelleştirme belirlemek geleneksel mikroskobu dayalı süper çözümleme yöntemi açıklanmaktadır.

Floresans Merkezi kütlesi Imaging tarafından Golgi protein nicel yerelleştirme

Nicel immunoblotting ayirt Histoloji formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi bir protein miktarının aracı olarak görüntü analizi ile birleştiğinde doğrulamak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bizim sonuçlar biyomarker proteinler rutin biyopsi örneklerinde göreli miktarı ascertaining için ayirt Histoloji yarar gösterilmektedir.

Hücre hatları nicel Immunoblotting ayirt rutin doku örneklerinde biyomarker protein miktarının için doğrulamak için standart olarak

Burada, bir sinaptik protein ayirt boyama kullanarak işaret protein, confocal mikroskobu ve bilgisayar tabanlı analiz göre dağılımını belirlemek için nicel bir yaklaşım açıklar.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

Tekrarlanarak mRNA'ların içinde bireysel yumurtalar, tek molekül RNA Floresans in situ olarak sayıları saymak için hibridizasyon (RNA-balık) yapışık olmayan hücreler için optimize edildi. Yumurtalar toplanmıştır, transkript belirli probları ile melezleşmiştir ve bir görüntü miktar yazılımı kullanarak sayılabilir.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Bireysel çeviri olaylarını izlemek, kap bağımlı çeviri mekanizmalarının yüksek çözünürlüklü kinetik çalışmalarına izin verir. Burada floresan etiketli antikorlar ve epitop etiketli nascent peptitler arasındaki görüntüleme etkileşimlerine dayanan bir in vitro tek moleküllü test gösteriyoruz. Bu yöntem, aktif in vitro kap bağımlı çeviri sırasında başlatma ve peptit uzama kinetiğinin tek moleküllü karakterizasyonunu sağlar.

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Öğrenin, hücre adezyonu sırasında lokalize translasyon olaylarını puromisin ve konfokal görüntüleme kullanarak görselleştirme ve nicel ölçüm yöntemini. Bu teknik, hücre göçü ve erken ilaç yanıtı çalışmaları için hızlı, kolay ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Daha fazla video keşfet