Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Bu deneyin genel amacı, hücre yapışmasının ilk adımları sırasında meydana gelen bölümlere ayrılmış translasyon olaylarını görselleştirmek ve ölçmektir. Bu yöntemin geniş bir uygulaması vardır. Hücre göçü, yapışma veya erken ilaç tepkisini analiz ederken olduğu gibi hızlı spesifik çeviri yanıtı tahlil olabilirken kullanın.

Bu tekniğin temel avantajı, kolay, hızlı ve uygun maliyetli olmasıdır. Sadece puromisin, puromisine karşı yönlendirilmiş antikorlar ve standart konfokal tarama görüntüleme sistemi gerektirir. Başlamak için, MRC-5 hücrelerinin bir süspansiyonunu yapın.

Tripsinizasyon kullanın, ardından santrifüjleme, süpernatantın çıkarılması, daha sonra mililitre başına 40 bin hücrede yüzde on FBS ile DMEM'de yeniden süspansiyon yapın. Odak yapışma komplekslerini tamamen ayırmak için süspansiyonu 20 dakika boyunca hafif bir dönüşle inkübe edin. Bu çok önemli.

Daha sonra, iki adet 35 milimetrelik cam tabanlı tabağa, iki mililitre alikot süspansiyonu ekleyin ve hücresel yapışma ve SiC oluşumuna izin vermek için bunları inkübe edin. 40 dakika sonra, bir plakayı sikloheksimid ile tedavi edin ve inkübatöre geri koyun. Bu plaka negatif kontrol olarak işlev görecektir.

55 dakika sonra, önceden belirlenmiş konsantrasyonda her iki plakaya da puromisin uygulayın ve plakaları beş dakika daha inkübe edin. Bir saatlik tohumlama ve beş dakikalık puromisin işbirliğinden sonra, her plakayı iki mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS'de bir mililitre yüzde dört formaldehit ile sabitleyin.

Fiksasyondan sonra, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın, daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS'de 500 mikrolitre yüzde 0.5 triton X-100 kullanarak hücrelere nüfuz edin. Daha sonra, plakaları PBS ile üç kez yıkayın ve ardından PBS'de 500 mikrolitre yüzde bir BSA uygulayın. Oda sıcaklığında inkübasyona 20 dakika daha devam edin.

Fazla BSA'yı çıkarmak için, hücreleri PBS'de yüzde 0.1 Tween-20 ile üç kez yıkayın. Şimdi, hücreleri 300 mikrolitre anti-puromisin antikoru ile inkübe edin. Bağlanmamış antikoru, yüzde 0.1 Tween-20 ile üç yıkama kullanarak çıkarın.

Daha sonra, puromikolatlı polipeptitleri ve de factem'i görselleştirmek için iki florofor konjuge ikincil antikor karışımından üç yüz mikrolitre uygulayın. Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, bağlanmamış antikorları çıkarmak için plakaları üç kez yıkayın ve ardından DAPI ile desteklenmiş üç yüz mikrolitre yüzde 0.1 Tween-20 çözeltisi uygulayın.

DAPI'nin oda sıcaklığında beş dakika hücrelerde kalmasına izin verin. Son olarak, hücreleri dört kez daha yıkayın ve saf PBS'de bir yıkama ile bitirin. Ardından, hücreleri görüntüleme için iki mililitre PBS'de saklayın.

Piyasada bulunan herhangi bir konfokal görüntüleme sistemini kullanarak, önce niceleme için dinamik aralığı en üst düzeye çıkaran uygun ayarları belirleyin. Kantifikasyona odaklanma, yalnızca tepe boyutu doygunluğundan kaçınılırsa ve konsantrasyon uygun şekilde ayarlanırsa elde edilebilir. Bu ayar, lazer gücü avantajı ve ofsetler dikkatli bir şekilde ayarlanarak elde edilebilir.

İlk olarak, piksel boyutunu optimize etmek için yakınlaştırma faktörünü ve piksel sayısını ayarlayın. Bunu Nyquist teoremine göre yapın. Ardından, tarama hızını azaltın ve sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için ortalamayı kullanın.

Ardından, Z ekseni boyunca uygun üst ve alt odak düzlemlerini manuel olarak belirleyin ve eksenel çözünürlüğü hesaplayarak ve bu mesafeyi 2.3'e bölerek StepSize'ı ayarlayın. Tipik sonuç 20 ila 25 görüntü katmanıdır. Ayarlar değiştirildikten sonra, 1,42 sayısal diyafram açıklığına sahip 60x Plan Apo yağa daldırma objektifi kullanarak tek bir hücrenin tamamının konfokal bir görüntüsünü elde edin.

Flurofor sinyallerini ölçmek ve analiz etmek için, önce J görüntüsündeki ilgilenilen z düzlemi katmanına karşılık gelen bir görüntü açın. Ardından, çizim aracını kullanarak, nicelemenin istendiği hücre boyunca bir çizgi yapın. Ardından, düze çift tıklayarak çizgi kokusunu değiştirin. Yoğunluk değerlerinin çizginin genişliği boyunca ortalaması alınacaktır, bu nedenle farklı yapılardan sinyal örtüşmesini önlemek için daha ince bir çizgi kullanın.

Ardından, hat boyunca sinyal yoğunluğunun profilini çıkarın. Şimdi, bir flurofora karşılık gelen kanalda aynı çizgi boyunca sinyal yoğunluğunu toplama işlemini tekrarlayın. Değerler her zaman satırın yönü kullanılarak sıralanır.

Şimdi profil verilerini kopyalayın ve analiz için bir elektronik tabloya yapıştırın. İstatistiksel analize devam etmeden önce, ilgilenilen her Z düzlemi görüntüsünden veri toplama işlemini tekrarlayın. Alternatif olarak, bir eksen boyunca sinyal toplamak yerine, görüntünün bir alanından sinyal toplanabilir.

İlk olarak, ilgilendiğiniz bir bölgeyi seçmek için geometrik form fonksiyonunu kullanın. Ardından, herhangi bir arka plandan kaçınmak için eşik seviyesini ayarlayın. Piksel yoğunlukları histogramında, nicelemeye hangi piksellerin dahil edileceğini ayarlamak için kaydırıcıyı hareket ettirin.

Hücrenin dışındaki tüm kırmızı pikselleri ortadan kaldırmak için eşiği ayarlayın. Şimdi, arka plan sinyalini değil, ilgilenilen sinyali ölçmek için gereken ölçüm parametrelerini tanımlayın. Eşik değeri ve entegre yoğunluk seçenekleri arasında geçiş yapın.

Ardından, measure komutunu kullanın. Bu, seçilen alandaki ortalama gri değerleri ve piksel sayısını içeren yeni bir pencere açacaktır. Şimdi, tüm hücredeki sinyal yoğunluğunu belirlemek için aynı eşiği uygulayarak işlemi tekrarlayın.

Ardından, seçilen alandaki sinyalin tüm hücreninkine oranını hesaplamak için bu verileri kullanın. Purmisin katılımı kullanılarak translasyon olaylarının doğru ölçümü için, eksenel bir ölçüm için en uygun koşullar ilk olarak değerlendirildi. Beş veya on dakikalık bir tedaviye karşı bir konsantrasyon spektrumu karşılaştırıldı.

MRC-5 ve HeLa hücreleri için kabul edilebilir puromisin konsantrasyonu, Huh-7 hücreleri için gerekenden biraz daha yüksekti. Yüksek puromisin konsantrasyonları ile on dakika boyunca tedavi edilen hücreler çoğunlukla daha küçük puromikollenmiş polipeptitler üretti. Daha küçük polipeptitler daha hızlı etkisiz hale getirilir ve arzu edilmez.

Bu nedenle daha kısa kuluçka süresi daha arzu edilir kabul edildi. Sikloheksimid tedavisi etkili ve önemli bir negatif kontroldür. MRC-5 hücrelerinde, sikloheksimid ile tedaviden sonra sadece zayıf bir puromisin sinyali tespit edildi.

Eksenel sinyal ölçümü kullanılarak, yeni sentezlenmiş proteinlere karşılık gelen puromikolasyonlu polipeptitlerin genel lokalizasyonu, hücre içinde farklı seviyelerde değerlendirilebilir. Sinyalin hücre boyunca kantitatif bir dağılımı da mümkündü. Her iki teknik için de, bütün bir hücredeki öteleme olaylarını doğru bir şekilde değerlendirmek için görüntü yığınındaki her Z düzlemi için sinyali ölçmek önemliydi.

Bu videoyu izledikten sonra, hücre altı bölmede translasyon olayının nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü düşündüğümüzde, puromisin konsantrasyonunun ve kuluçka süresinin önemli olduğunu hatırlamak önemlidir.

Difüzyonu sınırlamak için, inkübasyon süresinin sınırlandırılması tercih edilir. İyi sonuçlar elde etmek için görüntü elde etme türünün kalitesinin kritik olduğunu kabul etmek de önemlidir. Formaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kimyasal bir başlıkta çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.