Name: Soruşturma von Willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası Model von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Öğrenin, akış odası modeli kullanarak von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumunu gözlemleme ve nicelendirme yöntemini. Bu teknik, inflamatuar uyaranlar altında VWF salınımını ve trombosit tutunmasını incelemek için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alison Michels Frederick Banting ve Charles en iyi Kanada Yüksek Lisans Bursu dan Kanada kurumları, Sağlık Araştırma (CIHR) bir alıcı var. Laura L. Swystun alıcının CIHR bursu var. David Lillicrap bir Kanada araştırma sandalyede moleküler hemostaz alıcı olduğunu. Bu çalışmada kısmen grant (paspas-97849) çalışan bir CIHR tarafından finanse edildi.

Bu çalışmalar araştırma Etik Kurulu, Kraliçe'nin üniversite, Kanada tarafından kabul edildi.
1. endotel hücre stimülasyon
<ol><li>
Kollajen-kat 6-iyi doku kültürü plaka.
	<ol>
<li>24 s önceden, kat 6-iyi doku kültürü plaka kollajen 1 mL ile 37 ° C'de tampon (50 µg/mL sıçan kuyruk kollajen tip 1 ile 0,02 M buzul Asetik asit).</li>
		<li>Wells 2 mL, Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) ile iki kez yıkayın. Not: Tabak olabilir kalay folyo sarılı ve hava geçirmez bir plastik torba 4 ° C'de depolanan</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tohum büyüme orta içeren % 10 fetal sığır serum (FBS) 2 mL bir kuyu başına 1 x 106 hücre yoğunluğu, endotel hücreleri. 24 h 37 ° C'de (%5 CO2) için hücreleri kuluçkaya. Not: Burada, kan akıbet endotel hücreleri (BOECs) pasajlar 5 ve 15 arasında kullanıldı. BOECs Starke vd içinde başvurulan bir yöntem kullanılarak wildtype VWF sırası ile sağlıklı gönüllü izole edildi 22 bir şekilde bir daha önce Jüpiter23tarafından açıklanan benzer.</li>
	<li>Orta 24 h sonra kaldırmak ve HBSS hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>1 mL serum-Alerjik orta (en az önemli büyüme orta FBS olmadan) içeren phorbol 12-myristate 13-asetat ekleyin (PMA; 100 nM), unfractionated Histon (UH) ve HK veya İK (25 µg/mL hiç) hücreleri için 2 h 37 ° C'de (%5 CO2) için. Not: Bu konsantrasyon Histon Xu et al. tarafından önceki vitro sitotoksisite raporlara dayanarak yapıldı. 24 ve Abrams ve ark. 50 µg/mL kullanılan 25 .</li>
	<li>Orta 2 h sonra toplamak ve analiz kadar-20 ° C'de saklayın.</li>
</ol>2. VWF Quantification enzim bağlı Immunosorbent Assay (ELISA) tarafından
<ol><li>Mikroplaka arabellek (10 mM dibasic sodyum fosfat ve 145 mM Sodyum Klorür, pH 7.2) içeren 10 µg/mL poliklonal anti-VWF antikor gecede 4 ° C'de kaplama 100 µL ile kat</li>
	<li>Üç kez ile yıkama arabelleği 250 µL tabak yıkama (10 mM dibasic sodyum fosfat, 500 mM Sodyum Klorür ve % 0.1 ara 20, pH 7.2).</li>
	<li>1:2 ve 1:4 yıkama arabelleği ile orta ölçekli örnekler sulandırmak ve 1:10 başlayan bir standart eğri normal başvuru plazma kullanmak seyreltme.</li>
	<li>Seyreltilmiş örnekleri ve standartları gecede 4 ° C'de 100 µL plaka</li>
	<li>Üç kez ile yıkama arabelleği 250 µL plaka yıkayın.</li>
	<li>Seyreltilmiş anti-VWF, HRP Birleşik algılama antikor (1.1 µg/µL yıkama arabelleği) plaka 100 µL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Plaka yıkama ve üreticinin yönergelerine göre O boya dihydrochloride (OPD) Reaktif ile 10 min için kuluçkaya.</li>
	<li>100 µL ile reaksiyon 1 M H2o yüzden bırak4 ve okuma 492 plaka nm.</li>
</ol>3. katı faz Histon-VWF bağlama tahlil
<ol><li>Bir Mikroplaka % 0.5 sodyum deoxycholate 50 mM karbonat arabelleği (pH 9,6) gecede 4 ° C'de 10 µg/ml sulandırılmış Histon ile kat</li>
	<li>Üç kez 250 µL % 0.1 ile desteklenmiş PBS ile tabak yıkama ara 20, 10 dk arasında yıkama için kuluçka.</li>
	<li>PBS ile % 0,1 ara 20 ve % 1 sığır serum albümin (BSA) oda sıcaklığında 1 h için takıma 200 µL ile plaka engellemek.</li>
	<li>3.2 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Seri olarak plazma kaynaklı insan VWF/faktör VIII karmaşık 200 mU/mL 25 mU/ml serum fizyolojik arabelleği seyreltik (10 mM dibasic sodyum fosfat, 500 mM Sodyum Klorür ve % 0.1 ara 20, pH 7.2). 100 µL oda sıcaklığında 2 h plaka ekleyin.</li>
	<li>3.2 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>VWF bağlamaya immobilize Histon 100 µL HRP için oda sıcaklığında 1 h için Birleşik PBS-0.1% ara 20 ve 1:1,000 tavşan poliklonal anti-VWF antikor içeren bir çözüm kullanarak bulmak.</li>
	<li>3.2 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>100 µL ile 30 dk OPD reaktif plaka kuluçkaya ve 100 µL ile reaksiyon 1 M H2o yüzden bırak4. Optik yoğunluk itibariyle 492 ölçmek nm.</li>
</ol>4. tohum akışı Chambers üzerine endotel hücreleri
<ol><li>Kollajen-kaplama arabelleği (2.1. adımda açıklanan) 0.5 mL radarı-kilit 1 mL şırınga yükleyin.</li>
	<li>Şırınga radarı-kilit sonu bir akış odası slayt rezervuar twist.</li>
	<li>Pistonu yavaş yavaş tüm lane kaplı ve her depo dolu kadar basın. Her lane için yineleyin ve 24 saat için 37 ° C'de odası kuluçkaya.</li>
	<li>Kollajen-kaplama arabellek 200 μL pipet ile Aspire edin. 1 mL HBSS ile başka bir şırınga yüklemek ve dalgıç yavaş yavaş akış odasının her lane yıkamak için tuşuna basın. Yıkama akışı odası karşıt ucunda 200 μL pipet ile Aspire edin. İki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Yaklaşık 100 µL % 10 büyüme ortamında 3 x 106 hücre/mL endotel hücre (BOEC) çözümünün pipet FBS lane, bir akış odasının içine. Not: Endotel hücreleri tohumlama yoğunluğu odası kapasitesini aşıyor. Bu maksimum kanal kapsama sağlamak için. yapışık olmayan hücreleri içinde belgili tanımlık sonraki yıkama adım kaldırılır.</li>
	<li>Odası 24 h değişiklik için 37 ° C'de orta radarı-kilit şırınga (aynı derecede içinde adım 4.4) kullanarak her 8-12 h kuluçkaya. Şerit içinde hava kabarcığı yok görünür olduğundan emin olun.</li>
</ol>5. insan tam kan trombosit yalıtma
<ol><li>Bir biyolojik Emanet 30 G iğne ile kabine, asit-sitrat dekstroz arabelleği (85 mM TRISODYUM sitrat, 111 mM D-glukoz ve 71 mM sitrik asit, pH 4.5) 300 µL bir katkı maddesi içermeyen 3 mL kan toplama tüp ekleyin.</li>
	<li>Tam kan (Anti-trombosit ve non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar yedi gün boyunca ücretsiz) sağlıklı gönüllülerden iz (3 mL üç tüpler), Bernardo ve ark26tarafından Yayınlanan benzer bir iletişim kuralı aşağıdaki toplamak.</li>
	<li>İz ile ilişkili ilk doku hasarı spontan trombosit aktivasyon neden olabilir ilk tüp atmak.</li>
	<li>Yavaşça vacutainers üç kez kan antikoagülan ile karıştırmak için tersine çevirin.</li>
	<li>Vacutainers vasıl 150 x g 24 ° c (oda sıcaklığında) 15 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Ve dikkatle 15 mL konik tüp transfer yavaş yavaş bir pipet ile (süpernatant) trombosit açısından zengin plazma biyolojik Emanet dolabı çıkarın. Her tüp trombosit açısından zengin hacmi potansiyel çapraz-harekete geçirmek önlemek için tek bir konik tüp için transfer. Not: Biyolojik Emanet bakteriyel kirlenme ve potansiyel yapay trombosit ve/veya endotel etkinleştirme önlemek için kabine trombosit yalıtım yapılmalıdır.</li>
	<li>24 ° c (oda sıcaklığında) trombosit cips için 10 dk 900 x g, konik tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Pipet ve trombosit-yoksul süpernatant atın.</li>
	<li>Pelet dikkatle sitrat-glikoz-sodyum (CGS) arabelleği (13 mM sodyum sitrat, 30 mM D-glukoz ve 120 mM Sodyum Klorür, pH 7,0) 1 mL ile yıkayın. Not: Trombosit-ecek gözükmek WISP benzeri oluşumlar CGS arabellek eklendiğinde ve Pelet hafifçe resuspended. Yapılan trombosit aktivasyon tarafından kontamine trombosit değil kolayca resuspend ve biçimsiz görünecektir.</li>
	<li>Bir kez tam olarak resuspended, 900 x g 10 min 24 ° c (oda sıcaklığında) için de örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>CGS yıkama arabellek kaldırmak ve Pelet Tyrode'nın arabellek (138 mM Sodyum Klorür, 5.5 mM D-glikoz, 12 mM sodyum bikarbonat, 2,9 mM Potasyum klorür ve 0,36 mM dibasic sodyum fosfat, pH 7,4) 3 mL resuspend. Trombosit tam resuspension emin olun ve toplamalardan gözlenir, örnek atmak.</li>
	<li>20 mM DiOC6 hisse senedi çözüm (erime 57.25 mg 5 ml metanol) 1,5 µL 1 µM son bir konsantrasyon için yıkanmış trombosit her 3 mL konik tüp ekleyin. Not: DIOC6 etiket trombosit için bu deneyde kullanılan yeşil flüoresan mitokondrial boya var.</li>
	<li>Üç 1,5 mL microcentrifuge tüpler yıkanmış trombosit çözümü aliquot 1 mL. Not: Bu deneme için gerekli trombosit cilt akışı odası, istenen kesme stres ve deney (adım 6.5) uzunluğu boyutu üzerinde temel alınarak hesaplanır. Sıvı akış için yeterli hacim olması için koşullar değiştikçe bu protokol ayarlanabilir.</li>
	<li>2s tecrit içinde yıkanmış trombosit kullanın.</li>
</ol>6. akış aparatı montaj
<ol><li>Steril silikon bir erkek dirsek radarı bağlayıcıyı bir ucunda ve diğer kadın radarı kilit adaptörü (1.6 mm iç çapı) boru 70 cm parçası ekleyin.</li>
	<li>20 mL şırınga için tüp bağlı kadın radarı kilit adaptörü takın.</li>
	<li>6.1 ve 6.2 iki kez üç özdeş şırınga-boru bağlantıları oluşturmak için adımları yineleyin.</li>
	<li>
Bir şırınga pompa sıvı akış oluşturmak için kullanın. Giriş şırınga pompa içine aşağıdaki ayarları: iç çapı şırınga ve akış hızı. Not: 20 mL şırınga bir 19.55 mm iç çapında. Akış hızı temel alınarak istenen kesme hızı/makaslama stres ve akış odası boyutları hesaplanır. 1 dyn/cm2 (içinde gözlenen düşük Venöz kesme), elde etmek için mevcut çalışmada kullanılan akış odası için bir akış hızı 9,37 µL/dk gereklidir. Histon Venöz tromboz için bağlama kanıt yüzünden orta Venöz bükme 4,45 dyn/cm2 seçilir. Bu da tampon su benzer bir viskozite vardır varsayımına dayanır. Akış hızı sonra çeşitli akış odası boyutları için akış hızı-ebilmek bulunmak vasýl hesaplamakta kullanılan 41.7 µL/dak denklemler için eşittir:<ol>
<li>Pompa enjektör pompa üzerinde düğme seçeneğini kullanarak sıvı geri ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjektör pompa tüp bağlı üç şırınga yük ve şırıngalar ve itici etrafına köşeli ayraçlar sıkıca güvenli.</li>
	<li>Erkek dirsek radarı ikinci 20 cm biteviye-in steril silikon tüp her iki ucuna iliştirin.</li>
	<li>Bir dirsek radarı körelmenin 18'lik iğne için bağlayın.</li>
	<li>İki kez, akış odası için şerit üç üç özdeş Intake Sistemleri oluşturma tekrarlayın. Not: Yeniden önce distile su ve ardından % 10 çamaşır suyu ile silikon tüp ve yapma yıkanabilir. Bu akış odaları yeniden kullanmak için tavsiye edilmez.</li>
</ol>7. mikroskop ayarları
<ol><li>Tam otomatik bir sahne ile donatılmış bir iplik disk mikroskop kullanın. Aydınlatma ile 405, 458, 491, 543 ve 633 nm lazer çizgiler sağlar bir lazer denize indirmek gerçekleştirin. 20 X amacı ile tüm görüntüleri yakalamak. Analiz yazılımı (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf) ile tüm parametreleri ayarlayın.</li>
	<li>Kanal ayarları seçin (emisyon filtre: 520/35), 491, uyarma ile nm, Alım için. Tam dinamik veri aralığı elde etmek için şarj kuplajlı cihaz 150, 200 MS, bir çekim hızı ile bir elektron çarparak kazanç için çarparak elektron ayarlayın. Not: Bir yeşil flüoresan boya, DiOC6, dalga boyu maxima ile trombosit etiketli (uyarma, 482 nm; emisyon, 504 nm).</li>
	<li>491 nm lazer güç % 20 için ayarlayın.</li>
	<li>Tüm şerit üç Merkezi işaretlemek ve z aralığı için 1 mikron ve 0.5 mikron adım boyu için seçin. Her 10 saat Puanlar (Yani, süre) ve bir yansımasını yakalamak için görüntüleri (Yani, aralığı) arasındaki süre seçin s; "60 saat puan" slayt seçin. Şerit üç görüntüleri yakalama ve bunları bir belirlenen deneme klasöre kaydetmek için mikroskop ayarlayın. Not: akış odası şerit üç olduğundan, çekim için üç pozisyon arasında geçiş yapmak mikroskop gerekir.</li>
</ol>8. VWF-trombosit dize oluşumu
<ol><li>Kültür orta akış odasından (Adım 4) kaldırmak adım 4.4 olduğu gibi aynı tekniği kullanarak.</li>
	<li>Her iki histamin (25 µM), PMA 100 µL ekleyin (100 nM), UH, HK veya 15 dakika oda sıcaklığında ve ortam O2co2BOEC monolayer uyarmak için (aynı derecede içinde adım 1.4) serum serbest ortamda seyreltilmiş HR (25 µg/mL hiç). Not: VWF yayımı için değil gerekli olmasa da, bu uyarımı 37 ° C de performans VWF ekzositozu27artıracaktır.</li>
	<li>Bunu üç sağlamak akışı odası ayrı şerit deneysel bir denetimi olarak işlenmemiş kalır.</li>
	<li>1 mL şırınga kullanarak orta kaldırmak ve 100-200 µL endotel monolayer kapalı secretagogues yıkamak için PBS, onun yerine.</li>
	<li>Akış odası yer odasında güvenliğini sağlamak için vasküler küçük resimleri kullanma bir slayt stand üzerine monte.</li>
	<li>Kullanılabilir erkek radarı konektörü (şırınga için bağlı) 70 cm boru ucundaki akışı odası rezervuarı iliştirin. İki diğer akış odası şerit için yineleyin.</li>
	<li>PBS yıkama kaldırmak için şırınga pompa başlatın. Karşıt akışı odası rezervuar içine pipet ek PBS şerit kuru çalıştırmayın emin olmak için.</li>
	<li>Akış sistemi eşdeğer akışı için tüm üç yolları gözlemlemek ve şırınga pompa duraklayın.</li>
	<li>Albümdeki her lane, deneyler arasında kabaca aynı bölgede orta hakkında yakalamak için bir alan seçin. Not: mikroskop çalışan kişi deneysel koşullar kör. Bu adım mikroskop trombosit akışı önce odaklanmıştır sağlar (7. adıma bakın).</li>
	<li>Bir kadın radarı coupler eklemek<a> </a>5 mL şırınga ve daha sonra ücretsiz erkek radarı konektörü (adım 6,8) ve yıkanmış trombosit solüsyon (Adım 5.13) içeren 1.5 mL microcentrifuge tüp körelmenin iğneyi daldırın. Yavaş yavaş yok hava kabarcıkları sistemi içinde emin olmak için tüp ile trombosit çözüme çizin.</li>
	<li>5 mL şırınga kaldırmak ve erkek radarı akışı odası açık rezervuarı ekleyebilirsiniz. Üç şerit için yineleyin.</li>
	<li>Enjektör pompa yeniden başlatın ve karanlıkta 10 min için adım 7 mikroskop ve iletişim kuralı ayarlarını kullanma trombosit akışı sırasında esir alma imge.</li>
	<li>10 dk sonra radarı akışı odası rezervuar üzerinde emme boru bağlantısını kesmek ve rezervuar üzerinde endotel monolayer akışını korumak için PBS ile doldurun.</li>
</ol>9. VWF-trombosit dize miktar
Not: PBS, sürekli akış VWF-trombosit dize uzama görüntü analizi için korumak için gereklidir. Akışı kesilmesi küresel hale VWF neden olur ve VWF-trombosit dize miktar zarar. Bu görüntü yakalama sırasında her rezervuar PBS ile kontör için esastır. Bu adımı sırasında hücre daralma veya dekolmanı gözlem yapılırsa HBSS PBS değiştirebilirsiniz.
<ol><li>İlk lane ile başlayan slaytın orta etrafında bir 20 X objektif lens kullanarak çakışma olmadan slayt başına 10 resim yakalama. Her lane için bu işlemi yineleyin. Not: su depoları çevreleyen alanları çalkantılı kesme stres nedeniyle kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Görüntü işleme yazılımı kullanarak, parlaklığı ayarlamak yanında tıkırtı "görüntü,"Ayarlama"ve" Parlaklık/Kontrast."" Yapıştırılan trombosit-ebilmek var olmak görüş için yeterince iyi miktar kadar kaydırma çubuğunu sürükleyin.</li>
	<li>Üç veya daha fazla hizalanmış trombosit resimdeki gözlendiğinde VWF-trombosit dize kaydedin. Görüntüdeki tüm VWF-trombosit dizeleri saymak. Tüm 10 resimler için yineleyin ve deneme için ortalama. Not: miktar gerçekleştiren kişi için deneysel koşullar kör. Bu bağımsız çalışmalar8,28,29tarafından onaylandıktan gibi VWF için ortak leke gerekli değildir.</li>
	<li>Denemenin en az her salgılatıcı değerlendirmek için üç kez tekrarlayın.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

VWF-trombosit fizyolojik alaka VWF fizyon proteaz ADAMTS13 huzurunda onların hızlı dağılması nedeniyle tartışmalı kalır dizeleri, onlar trombosit alımı VWF tarafından bir sitede bir ölçülebilir vitro model olarak hizmet Histon düzeyleri5artışlar yerelleştirilmiş bir trombüsü varlığı şeklinde. Ayrıca, trombotik trombositopenik purpura (TTP) olarak - veya inflamatuar microenvironments - ADAMTS13 etkinlik-böyle eksik patolojiler içinde ADAMTS13 etkinliği inhibe VWF trombosit dizeleri viv...

Tromboz ölüm dünya çapında1 önde gelen nedenidir ve yanıt todysregulated trombosit aktivasyon ve Trombin nesil her iki veinsand arterler içinde gelişebilir. VWF plazma seviyeleri kan pıhtılaşması anahtar bir regülatör, mademki düzeyleri düşük (< % 50) von Willebrand hastalığı (VWD)2 ve yüksek düzeyleri olarak bilinen kanama bozukluğu sonucu (> % 150) Venöz3 riski ile ilişkili olan ve Arteryel4 tromboz.
VWF megakaryocytes ve endotel hücreleri tarafından sentezlenen ve trombosit α-granül ve WPBs, sırasıyla depolanan bir multimeric glikoprotein var. Kan durdurucu sargı meydan okuma, VWF endotel WPBs aktive endotel hücreleri5 veya maruz kollajen damar duvarı6dolaşımdaki trombositler urgan üzerinden yayınlanacak. VWF endotel hücrelere ankraj P-selektin7 ve integrin αvβ38tarafından aracılı olduğu gösterilmiştir. Trombosit α-granül mağazaları sonraki sürümü daha da trombosit-trombosit etkileşimleri trombosit tak oluşumu, koagülasyon cascade ve fibrin yayılması için gerekli iskele için stabilize etmek için yerelleştirilmiş VWF konsantrasyonları artırabilirsiniz Yeminli ifade. VWF trombosit-bağlama etkinliği tarafından multimeric yapısı, daha fazla kan durdurucu sargı aktivite9,10sahip yüksek molekül ağırlığı multimers ile düzenlenmiştir. Dolaşımda, VWF da pıhtılaşma faktör VIII bir taşıyıcı olarak davranır.
Sıvı kesme stres VWF Fizyoloji temel bir düzenleyicisidir. Yamultma stres yokluğunda, VWF küresel bir formda, trombosit glikoprotein IB yapışma11için bağlayıcı etki alanlarını gizlemek bulunmaktadır. Yamultma stres olmadığı durumlarda, bir metalloprotease, bir disintegrin ve metalloprotease ile trombospondin motifi (ADAMTS13), bölünme sitesine maruz kalmaktadır. ADAMTS13 böylece onun kan durdurucu sargı etkinlik12azaltarak multimer boyutu, düzenleyen çıplak ve trombosit dekore edilmiş VWF dizeleri cleaves.
VWF bir Akut Faz proteinidir ve hipoksi13, enfeksiyon14ve proinflamatuar sitokinler, dahil olmak üzere çok sayıda çekim gücü, VWF yayın endotel hücrelerden aracılık gösterilmiştir. Benzer diğer inflamatuar ajanlar, hücre dışı Histon da sistemik VWF sürümde fareler15,16 ve trombosit vitro17,18, aktivasyonu teşvik gösterilmiştir 19. bu lizin farklılıkları olarak Histon alt türü bağımlı olmasını gösterildi ve arginin içerik işlev15etkileyebilir. Lysine açısından zengin (HK) etkisini araştırmak için bir akış odası kurmak için çalışma hedeflerimiz model ve arginin bakımından zengin (HR) Histon alt türlerini ve endotel VWF yayın ve gerçek zamanlı trombosit secretagogues yakalama, potansiyel erken olaylarda iltihap kaynaklı kan pıhtılaşması.
Bu akış odası metodoloji subendothelial kollajen, endotel hücreleri, VWF ve trombosit arasındaki etkileşimler vivo içinde görsel, tekrarlanabilir ve ölçülebilir bir vitro sistemde beyannamedir. VWF-trombosit etkileşimleri WPB salgılanması, trombosit aktivasyon ve VWF proteolizis dahil olmak üzere, düzenleyen yolu tüm yönleriyle gerçek zamanlı değerlendirmesi için sağlar. VWF çalışmalar kontrollü kesme stres koşullarında VWF yayın ve trombosit-bağlama işlevi20, WPB Fizyoloji21ve VWF bölünme zarar VWD mutasyonlar değerlendirmek için ADAMTS135tarafından kullanılmıştır. VWF-trombosit dize oluşumu sonucu iltihabi bir uyarıcı olarak ölçmek için bu yöntemi kullanın: hücre dışı Histon.

<table><tbody><tr><td>Buzağı-timus fraksiyone olmayan histonlar (UH)</td><td>Worthington Biyokimyasal</td><td>HLY</td><td>Serumla azaltılmış ortamda sulandırıldı (5 mg / mL)</td></tr><tr><td>Buzağı-timus lizin açısından zengin histonlar (HK)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H5505</td><td>Serumla azaltılmış ortamda sulandırıldı (5 mg / mL)</td></tr> <tr><td>Buzağı-timus arginin açısından zengin histonlar (HR)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H4830</td><td>Serumla azaltılmış ortamda sulandırıldı (5 mg / mL)</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>DMSO'da Yeniden Oluşturuldu (20 mM)</td></tr> <tr><td>Histamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125-1G</td><td>Suda Sulandırıldı (50 mg / mL)</td></tr><tr><td>3,3 'Diheksiloksakarbosiyanin İyodür (DiOC6)</td> <td>İnvitrojen</td><td>D273</td><td>Metanol (20 mM) içinde sulandırıldı</td></tr> <tr><td>VWF ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için Tavşan Anti-VWF Kaplama Antikoru DAKO A0082Tavşan Anti-VWF Tespit Antikoru, HRP konjuge</td><td>DAKO</td><td>P0026</td><td>VWF ELISA ve histon-VWF bağlanma testi için</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp düz tabanlı 96 kuyulu mikroplakalar</td><td>eBioscience</td><td>44-2404-21</td><td>Histon-VWF bağlama testi için</td></tr><tr><td>Immulon 4 HBX Düz Tabanlı Mikrotitre 96 Kuyulu Plakalar</td><td>VWF ELISA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humate-P</td><td>CSL Behring</td><td>N / A için Thermo Scientific</td> <td>3855Plazmadan türetilmiş insan von Willebrand faktör/faktör VIII kompleksi</td></tr><tr><td>Normal Referans Plazma</td> Hassasiyeti VWF için <td>BioLogic</td><td>CCNRP-05</td><td>ELISA standart eğrisi</td></tr><tr><td>O-Fenilendiamin dihidroklorür (OPD) reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8287</td><td>ThermoFisher Scientific aracılığıyla temin edilebilen eşdeğer ürün (Katalog Numarası: 34006)</td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Kültür ve başlangıç için BOEC</td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinin (HBSS)</td> <td>tohumlanmasıThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan kuyruğu Kollajen Tip 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>31985070</td><td>Endotel hücre stimülasyonları için</td></tr><tr><td>METAMORF Mikroskopi Otomasyonu ve Görüntü Analiz Yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Kan Alma Tüpleri, Katkısız</td><td>BD Biosciences</td><td>366703</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide III 0.1 (akış odaları)</td><td>Ibidi</td><td></td><td>Bu ürünün üretimi durdurulmuştur. &micro;-Slide VI 0.1 (#80661) veya 0.4 (# 80601) kullanmanızı ve 4.45 dyn/cm2'lik bir kesme gerilimini korumak için gereken akış hızını ve trombosit hacmini yeniden hesaplamanızı öneririz</td></tr>. <tr><td>Silikon Boru 1.6 mm İç Çap: 5 m, sterilize</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Luer Kilit Konektörü Dişi: doğal Polipropilen, sterilize</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Dirsek Luer Konnektör Erkek: beyaz Polipropilen, sterilize</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Körelmiş 18G İğne</td><td>BD Biosciences</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 mL şırıngalar</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Pompası</td><td>New Era Pompa Sistemleri A.Ş. NE-1600 Multi-PhaserTM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Quorum WaveFX- 4X1 eğirme diski mikroskobu</td><td>Quorum Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü İşleme Yazılımı</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

soruşturma von willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası model von willebrand faktör-trombosit dize oluşumu

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Von Willebrand faktör (VWF) trombosit adezyonu ve endotel hasarı sitelerdeki toplama aracılık eder ve bu faktör VIII dolaşımda taşıyan bir multimeric glikoprotein koagülasyon faktördür. VWF endotel hücreleri tarafından sentezlenir ve de yapısal plazma serbest bırakılır veya Weibel Palade organları (WPBs) adı verilen özel organelleri içinde yanıt Kan durdurucu sargı meydan okuma olarak isteğe bağlı yayın için depolanır. Procoagulant ve proinflamatuar uyaranlara hızla WPB ekzositozu ve VWF yayın teşvik edebilirsiniz. Endotel hücreleri tarafından yayımlanan VWF çoğunluğu plazmada dolaşır; Ancak, VWF bir kısmı endotel hücre yüzeyine demirli. Fizyolojik kesme koşullar altında endotel demirlemiş VWF nidus trombüsü oluşumu temsil edebilir bir VWF-trombosit dize oluşturan trombosit için bağlayabilirsiniz. Bir akış odası sistemi görsel olarak endotel hücreleri VWF sürümünden ve tekrarlanabilir ve VWF aracılı trombüsü oluşumu Patofizyoloji alakalı bir şekilde yakalamak sonraki trombosit gözlemlemek için kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak, endotel hücreleri bir akış odasında kültürlü ve daha sonra secretagogues ile WPB ekzositozu ikna etmek için teşvik vardır. Yıkanmış trombosit sonra aktive endotel üzerinde derin. Trombosit aktif hale gelir ve daha sonra sıvı akış yönü uzun VWF dizelerinde bağlayın. Hücre dışı Histon procoagulant ve proinflamatuar uyarıcı kullanarak, biz endotel hücreleri Histon tedavi tedavi edilmezse endotel hücrelere göre artan VWF-trombosit dize oluşumu gözlenen. Bu iletişim kuralı bir nicel, görsel ve gerçek zamanlı değerlendirme modelleri trombozu ve hemostaz VWF-trombosit etkileşimleri aktivasyon açıklar.

Doğrudan VWF yayın endotel hücrelerden Histon etkisini değerlendirmek için için 2 h serum-Alerjik orta içeren PMA (pozitif kontrolü), UH, İK ve HK Konfluent BOECs biz maruz. Biz HK indüklenen VWF protein (VWF:Ag) işlem görmüş endotel hücreleri (şekil 1) orta logosuna 2 kat artış gösterdi. BOECs Ah ve İK ile teşvik zaman ilginçtir, orada daha az VWF:Ag orta tedavi edilmemiş durumda algılandı. Histon için doğrudan30VWF bağlayabilirsiniz ...

Bu yazıda, endotel von Willebrand değerlendirmek için bir yöntem tarif faktör yayın ve sonraki trombosit yakalama inflamatuar bizi canlı tutan bir vitro akış odası sistemi kullanarak sıvı kesme oluşuyor.

Soruşturma von Willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası Model von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumu

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Bu prosedürün genel amacı, sekretagoglara yanıt olarak von Willebrand faktörü veya VWF-trombosit zinciri oluşumunu gözlemlemek ve nicelleştirmektir. Bu yöntem, von Willebrand faktörü biyolojisi ve damar-palitatif vücut patofizyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, von Willebrand faktörü salınımını ve trombosit bağlanma fonksiyonunu bozan mutasyonlar hakkındaki soruları yanıtlamamıza da yardımcı olur.Bu tekniğin temel avantajı, subendotelyal kollajen, endotelyal hücreler, VWF ve trombositler arasındaki in-vivo etkileşimleri görsel ve nicelenebilir bir in-vitro sistemde yeniden canlandırmasıdır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesinin hayati olduğu kanaatindeyim. VWF-trombosit zincir oluşumunun birden fazla eşzamanlı koşul altında gerçek zamanlı olarak yakalanması için gereken mikroskopi adımlarının, yalnızca metin yoluyla tam olarak kavranması zor olabilir.0,5 mililitre kolajen kaplama tamponunu 1 mililitrelik luer lock şırıngaya çekerek başlayın. Şırınganın ucunu bir akış odası lamının rezervuarına çevirerek takın ve tüm kanal kaplanana ve her bir rezervuar dolana kadar pistonu yavaşça bastırın. Her birinin tam dolu olduğundan emin olmak için rezervuarları tamamlayın.Tüm kanallar doldurulduğunda, hazneyi 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kolajen kaplama tamponunu uzaklaştırmak için 200 µL'lik bir pipet kullanın. Ardından, her bir kanalı HBSS ile durulayın ve salini 200 µL'lik bir pipetle aspire edin.Üçüncü HBSS turu boşaltıldıktan sonra, akış odasının her bir kanalına %10 FBS ile desteklenmiş 100 µL büyüme ortamı içerisinde mililitrede yaklaşık 3 × 10⁶ Blood Outgrowth Endothelial Cells ekleyin. Ardından, ortamı her sekiz ila 12 saatte bir yenileyerek odayı 24 saat boyunca 37 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin. Akış düzeneğini kurmak için, öncelikle üç adet 70 cm'lik steril silikon tüp parçasının her bir ucuna birer erkek dirsek luer konnektörü takın.Her bir tüpün diğer ucuna bir dişi luer kilit adaptörü takın. Dişi luer kilit adaptörlerini ayrı 20 mililitre şırıngalara bağlayın ve şırınga pompasını programlayın. Şırıngaları pompaya yerleştirin ve şırıngaların ve pistonların etrafındaki braketleri sıkıca sabitleyin.Ardından, üç farklı 20 santimetrelik steril silikon tüp parçasının her iki ucuna tekil erkek dirsek luerler takın ve her üç dirsek luerden birine körleştirilmiş 18 gauge bir iğne bağlayın. Daha sonra, tam otomatik bir sahneye sahip dönen disk mikroskobunda 20x objektifi seçin ve uygun kanal ayarlarını yapın. Tam dinamik veri aralığını elde etmek için, elektron çarpanlı şarj bağlı cihazı (EMCCD), 200 milisaniye pozlama süresiyle 150 elektron çarpan kazancına ayarlayın.491 nano-metre lazer gücünü %20'ye ayarlayın ve her üç şeridin merkezini işaretlemek için mikroskop yazılımını kullanın. Z-aralığını 1,0 mikrometreye ve adım boyutunu 0,5 mikrometreye ayarlayın. Son olarak, her lam için 60 zaman noktasında her 10 saniyede bir görüntü yakalayacak şekilde süreyi ve aralığı seçin.VWF-trombosit zincirlerinin oluşumunu indüklemek için, akış odasının üç kanalındaki kültür ortamını; kontrol olarak sadece serumsuz ortam ile, diğer kanallarda ise 100 µL serumsuz ortamda seyreltilmiş ilgili stimülan ile değiştirin. Ardından, odayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Stimülasyon süresinin sonunda, her üç kanalı 100 ila 200 µL PBS ile yıkayın ve akış odasını bir lam standına sabitlemek için vasküler klipler kullanın.70 santimetre uzunluğundaki bir hortum parçasının ucundaki bir erkek luer konnektörü, akış odasının her bir rezervuarına takın. Ve PBS yıkama solüsyonunu uzaklaştırmak için şırınga pompasını çalıştırın. Kanalların kurumadığından emin olmak için karşı akış odası rezervuarına ek PBS pipetleyin.Eşdeğer akış doğrulandıktan sonra şırınga pompasını durdurun. Dişi luer kilitli birleştiricili 5 mililitrelik bir şırıngayı ilk boş erkek luer konnektörüne takın. Ve küt uçlu iğneyi, floresan işaretli yıkanmış trombosit çözeltisi içeren 1,5 mililitrelik bir mikro-santrifüj tüpüne daldırın.Sistem içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için trombosit solüsyonunu tüpler boyunca yavaşça çekin. Erkek luer konnektörünü akış odasının açık rezervuarına takın ve az önce gösterildiği gibi diğer iki kanalı trombosit solüsyonu ile doldurun. Tüm bağlantıların güvenli olduğunu doğrulamak için akış sistemi kurulumunu kontrol edin.Şırınga pompasını yeniden çalıştırın ve trombosit akışını 10 dakika boyunca karanlıkta görüntüleyin. Ardından, luer konnektörünü akış hücresi rezervuarının giriş borusundan ayırın. Endotel hücre monokatmanının üzerinde hafif bir salin akışını sürdürmek için rezervuarı PBS ile doldurun.VWF-trombosit zinciri oluşumunu nicelleştirmek için, lamın orta kısmından başlayarak her bir kulvardan birbirinin üzerine binmeyecek şekilde lam başına 10 görüntü yakalayın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, görüntü işleme yazılımını açın ve görüntü, ayarla ve parlaklık kontrastı seçeneklerine tıklayın. İlk görüntünün parlaklığını ayarlamak için, yapışmış trombositler nicelleştirme için yeterince net görülebilecek düzeye gelene kadar kaydırma çubuğunu sürükleyin.Ardından, üç veya daha fazla hizalanmış trombosit gözlemlendiğinde bir VWF-trombosit zinciri kaydedin ve görüntüdeki tüm zincirleri sayın. Akış koşullarının başlatılmasının ardından, işlem görmemiş hücreler, histamin veya PMA ile işlem görmüş hücrelere kıyasla çok az VWF-trombosit zinciri göstermektedir; işlem görmüş hücreler ise görüş alanı başına ortalama iki ila üç zincir sergilemektedir.Ayrıca, trombositlerin yanı sıra endotel hücrelerini de aktive eden histonlar, tedavi edilmemiş veya histamin veya PMA ile stimüle edilmiş kontrollere kıyasla daha fazla VWF-trombosit dizisinin oluşumunu tetikler. Bu prosedürü uygularken, ilk kan çekim tüpünü atarak, tüm reaktifleri oda sıcaklığında tutarak ve nazik bir pipetleme tekniği kullanarak, akış deneyine kadar trombositlerin inaktif kalmasını sağlayın. Lökositlerin veya trombosit aktive edici ajanların varlığındaki VWF-trombosit dizisi oluşumunu veya atom TS13 kesme enzimi tarafından dizilerin çözülmesini değerlendirmek için bu prosedürde modifikasyonlar yapılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, sekretagogla tetiklenen VWF-trombosit zincir oluşumunun nasıl değerlendirileceği ve in-vitro akış odası modeli hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

investigating-von-willebrand-factor-pathophysiology-using-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Trombosit adezyon kaskad kayma akışı varlığında yer alır, konvansiyonel (statik) iyi plaka deneyleri için bir faktör değildir. Bu makale, fizyolojik kesme akış koşulları taklit etmek için iyi bir mikroakışkan plaka formatı kullanan bir trombosit agregasyonu tahlil raporları.

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Bakterilerin kesme gerilimi altındaki kan damarları ile etkileşimini incelemek için, vasküler yapışmaya katkıda bulunan bakteri ve konak faktörlerini incelemeye izin veren bir akış odası ve in vivo mezenterik intravital mikroskopi modeli tanımlanmıştır.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

Trombosit transfüzyonu ve hemostazı, kan bankacılığı trombositlerinin işlevini araştırmak için kan sulandırma ve mikroakışkan akış odaları kullanılarak modellendi. Veriler, trombosit depolama lezyonunun in vitro olarak hemostaz üzerindeki sonuçlarını göstermektedir.

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Bu makale aynı zamanda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşmayı ölçen hemostaz deneysel model tanımlamaktadır. Trombosit ve fibrin floresans gerçek zamanlı olarak ölçülür ve platelet yapışma oranı, bir pıhtılaşma hızının, pıhtılaşma başlangıcı belirlenir. Model transfüzyonu için konsantreleri akışı altında trombosit prokoagülan özelliklerini belirlemek için kullanılır.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Bu çalışmada, tanımlanmış akış koşullarında kesme stresi altında farklılaştırılmış insan primer endotel hücrelerinin yüzeyinde üretilen pnömokok komponent dizelerine bağlıpnozyağının mikroskobik takibi açıklanmaktadır. Bu protokol, diferansiyel immünboyama prosedürleri uygulanarak belirli hücre yapılarının ayrıntılı görselleştirilmesi ve bakterilerin sayısallaştırılması için genişletilebilir.

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Akış altındaki trombosit fonksiyonu değerlendirilebilir ve simüle edilmiş hemostatik resüsitasyon, travma ve transfüzyon tıbbında uygulamaları olan bir mikroakışkan cihaz kullanılarak modellenebilir.

Trombosit Fonksiyonunun Değerlendirilmesinde Mikroakışkanlar

Bu makale, tüm kan akışı sitometrisi kullanılarak Doku Faktörü (TF) pozitif trombositlerin yüzdesinin nicelendirilmesi protokolünü özetlemekte ve proteinin değerlendirilmesini sunmaktadır: (1) dinlenme koşullarında hücre içi ve (2) hücre yüzeyinde, hem dinlenme hem de aktif koşullarda. Trombosit açısından zengin plazmada TF-pozitif trombositlerin değerlendirilmesi için de rehberlik sağlanmaktadır.

İnsan Trombositlerinde Doku Faktörü İfadesinin Akış Sitometrisi Analizi

Bu çalışma, kanda trombus oluşumunu tetiklemek için kesme stresi kullanan ve trombü birden fazla boyutlu okuma ile karakterize eden bir mikrofluidik testi tanımlar. Bu test, kan örneklerinin protrombotik eğilimini ölçebilir ve bu nedenle hastalık teşhisi, ilaç keşfi ve trombozla ilgili temel mekanik çalışmalarda faydalıdır.

Trombus Profilleme Testi: Biyomekanik Trombogenezin Kapsamlı Karakterizasyonu İçin Mikrofluidik Tabanlı Bir Platform

Öğrenin, akış odası modeli kullanarak von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumunu gözlemleme ve nicelendirme yöntemini. Bu teknik, inflamatuar uyaranlar altında VWF salınımını ve trombosit tutunmasını incelemek için değerli bir araç sunar.

Soruşturma von Willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası Model von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumu

Daha fazla video keşfet