Soruşturma von Willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası Model von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumu
14 Ağustos 2017
Bu yazıda, endotel von Willebrand değerlendirmek için bir yöntem tarif faktör yayın ve sonraki trombosit yakalama inflamatuar bizi canlı tutan bir vitro akış odası sistemi kullanarak sıvı kesme oluşuyor.
Bu prosedürün genel amacı, sekretagoglara yanıt olarak von Willebrand faktörü veya VWF-trombosit dizisi oluşumunu gözlemlemek ve ölçmektir. Bu yöntem, Von Willebrand faktör biyolojisi ve wavo-palyatif vücut patofizyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, von Willebrand faktör salınımını ve trombosit bağlama fonksiyonunu bozan mutasyonlar hakkındaki soruları yanıtlamamıza yardımcı olur.
Bu tekniğin temel avantajı, subendotelyal kollajen, endoetolyal hücreler, VWF ve trombositler arasındaki in vivo etkileşimleri görsel ve ölçülebilir bir in-vitro sistemde özetlemesidir. Bu yöntemin görsel gösteriminin hayati önem taşıdığını düşünüyorum. VWF-trombosit dizisi oluşumunu gerçek zamanlı olarak birden fazla eşzamanlı koşul altında yakalamak için gerekli mikroskopi adımlarının yalnızca metinle ustalaşması zor olabilir.
1 mililitrelik luer kilitli şırıngaya 0,5 mililitre kollajen kaplama tamponu yükleyerek başlayın. Şırınganın ucunu bir akış odası sürgüsünün rezervuarına çevirin ve tüm şerit kaplanana ve her bir rezervuar dolana kadar pistona yavaşça bastırın. Her birinin dolu olduğundan emin olmak için rezervuarları doldurun.
Tüm şeritler yüklendiğinde, odayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, kollajen kaplama tamponunu çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra her şeridi HBSS ile durulayın ve salini 200 mikrolitrelik bir pipetle aspire edin.
HBSS'nin üçüncü turu atıldıktan sonra, akış odasının her bir şeridine% 10 FBS ile desteklenmiş, 100 mikrolitre büyüme ortamında mililitre başına 6. Kan Büyümesi Endotel Hücrelerine yaklaşık üç kez 10 ekleyin. Daha sonra odayı 24 saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre geri koyun ve ortamı her sekiz ila 12 saatte bir değiştirin. Akış aparatını monte etmek için, önce üç adet 70 santimetrelik steril silikon boru parçasının her birinin bir ucuna bir erkek dirsek luer konektörü takın.
Ve her tüpün diğer ucuna bir dişi luer kilit adaptörü takın. Dişi luer kilit adaptörlerini ayrı ayrı 20 mililitrelik şırıngalara bağlayın ve şırınga pompasını programlayın. Şırıngaları pompaya yükleyin ve şırıngaların ve pistonların etrafına braketleri sıkıca sabitleyin.
Ardından, üç farklı 20 santimetrelik steril silikon borunun her iki ucuna ayrı erkek dirsek luerleri takın ve üç dirsek luerinin her birine körelmiş 18 gauge bir iğne bağlayın. Ardından, tam otomatik bir tabla ile donatılmış bir eğirme diski mikroskobunda 20x objektifi seçin ve uygun kanal ayarlarını yapın. Tam dinamik veri aralığını elde etmek için, elektron çarpma yükü birleştirilmiş cihazı, 200 milisaniyelik bir maruz kalma süresi ile 150'lik bir elektron çarpma kazancına ayarlayın.
491 nanometre lazer gücünü %20'ye ayarlayın ve üç şeridin de merkezini işaretlemek için mikroskop yazılımını kullanın. Z aralığını 1,0 mikrometre ve adım boyutunu 0,5 mikrometre olarak ayarlayın. Son olarak, slayt başına 60 zaman noktasında her 10 saniyede bir görüntü yakalamak için süreyi ve aralığı seçin.
VWF trombosit dizilerinin oluşumunu indüklemek için, kültür ortamını akış odasının üç şeridinden, kontrol olarak tek başına serumsuz ortamla değiştirin, daha sonra 100 mikrolitre serumsuz ortamda ilave şeritlere seyreltilen ilgili uyarıcı değiştirin. Daha sonra odayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Stimülasyon süresinin sonunda, şeritlerin üçünü de 100 ila 200 mikrolitre PBS ile yıkayın ve akış odasını bir kayar standa eşlemek için vasküler klipsler kullanın.
Akış odasının her bir rezervuarına 70 santimetrelik bir boru parçasının ucundan bir erkek luer konektörü takın. Ve PBS yıkamasını çıkarmak için şırınga pompasını çalıştırın. Şeritlerin kuru çalışmamasını sağlamak için karşı akış odası rezervuarına ek PBS pipetleyin.
Eşdeğer akış onaylandıktan sonra şırınga pompasını duraklatın. İlk serbest erkek luer konektörüne dişi luer kilit kuplörü olan 5 milileterlik bir şırınga takın. Ve körelmiş iğneyi, floresan etiketli yıkanmış trombosit çözeltisi içeren 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne batırın.
Sistem içinde hava kabarcığı olmadığından emin olmak için trombosit solüsyonunu yavaşça borudan çekin. Erkek luer'i akış odasının açık rezervuarına takın ve diğer iki şeridi az önce gösterildiği gibi trombosit çözeltisi ile yükleyin. Tüm bağlantıların sağlam olduğundan emin olmak için akış sistemi kurulumunu kontrol edin.
Şırınga pompasını yeniden başlatın ve karanlıkta 10 dakika boyunca trombosit akışını görüntüleyin. Ardından, luer'i akış odası rezervuarındaki giriş borusundan ayırın. Ve endotel hücresi tek tabakası üzerinde hafif bir tuzlu su akışı sağlamak için rezervuarı PBS ile doldurun.
VWF-trombosit dizisi oluşumunu ölçmek için, slaytın ortasından üst üste binme olmadan her şeritten slayt başına 10 görüntü yakalayın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, görüntü işleme yazılımını açın ve görüntüye tıklayın, ayarlayın ve parlaklık kontrastını ayarlayın. İlk görüntünün parlaklığını ayarlamak için, yapışan trombositler miktar tayini için yeterince iyi görüntülenene kadar kaydırma çubuğunu sürükleyin.
Ardından, üç veya daha fazla hizalanmış trombosit gözlendiğinde bir VWF trombosit dizisi kaydedin ve görüntüdeki tüm dizeleri sayın. Akış koşullarının başlamasını takiben, tedavi edilmemiş hücreler, histamin veya PMA ile tedavi edilen hücrelere kıyasla çok az VWF-trombosit dizisi gösterir. Bu, görüş alanı başına ortalama iki ila üç dize sergiler.
Ayrıca, endotel hücrelerinin yanı sıra trombositleri aktive eden histonlar, tedavi edilmemiş veya histamin veya PMA ile uyarılmış kontrollerden daha fazla VWF trombosit dizisinin üretimini indükler. Bu prosedürü denerken, ilk kan alma toplama tüpünü atarak, tüm reaktifleri oda sıcaklığında tutarak ve nazik bir pipetleme tekniği kullanarak akış deneyine kadar trombositleri hareketsiz tutun. Lökositlerin, trombosit aktive edici ajanların varlığında VWF-trombosit dizisi oluşumunu veya parçalama enzimi atomu TS13 tarafından dize çözünmesini değerlendirmek için bu prosedürde değişiklikler yapılabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, sekretogog kaynaklı VWF-trombosit dizisi oluşumunun ve in vitro akış odası modelinin nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, in vitro bir akış odası sistemi kullanarak, inflamatuar stimülasyonlar nedeniyle oluşan sıvı kayma gerilmesi altında endotelyal von Willebrand faktör (VWF) salınımının ve trombosit yakalanmasının değerlendirilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, sekretagoglara yanıt olarak VWF-trombosit zinciri oluşumunun gözlemlenmesine ve miktarının belirlenmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Hemostaz
Arkaplan
- Von Willebrand faktörü kan pıhtılaşmasında kritik bir rol oynar.
- VWF salınımını ve trombosit bağlanmasını anlamak, çeşitli patofizyolojik durumların incelenmesi için temel teşkil eder.
- VWF'yi etkileyen mutasyonlar kanama bozukluklarına yol açabilir.
- Bu yöntem, in vivo etkileşimleri kontrollü bir ortamda taklit eder.
Çalışmanın Amacı
- Kayma gerilmesi altında VWF-trombosit etkileşimlerini nicelleştirmek.
- İnflamatuar stimülasyonların VWF salınımı üzerindeki etkilerini incelemek.
- VWF mutasyonlarının trombosit bağlanması üzerindeki etkilerini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kayma stresini simüle etmek için in vitro akış odası sistemi.
- Gerçek zamanlı gözlem için mikroskopi teknikleri.
- VWF-trombosit dizisi oluşumunun kantitatif analizi.
- Sekretagogların VWF salınımı üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- VWF-trombosit etkileşimlerinin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- İnflamatuar uyaranların VWF salınımı üzerindeki etkisinin kanıtlanması.
- VWF-trombosit bağlanma mekanikleri hakkında içgörü sağlanması.
- VWF biyolojisinin incelenmesinde bu yöntemin öneminin vurgulanması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, VWF'nin incelenmesi için in vivo koşulları etkili bir şekilde taklit eder.
- VWF ile ilişkili patolojilerin anlaşılması için değerli bir araç sunar.
- Görsel gösterim, karmaşık etkileşimlerin kavranmasını kolaylaştırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama Uygunluğu
Bu akış odası modeli, fizyolojik kayma kuvveti altında VWF-trombosit etkileşimlerinin kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak tromboz ve hemostaz hedef doğrulamasında mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Sekretagogla tetiklenen VWF salınımını ve trombosit bağlanmasını gerçek zamanlı olarak görselleştirerek bu yöntem, protrombrotik yolakların ve endotelyal disfonksiyonun değerlendirilmesi için öngörülebilir bir güvenilirlik sağlar. Trombus oluşum modellerinde VWF'nin patofizyolojik önemini netleştirerek erken keşif kararlarını destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: VWF aracılı trombosit adhezyonu ve agregasyon yolaklarına ilişkin terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Kayma gerilimi altında ölçülebilir iplik oluşumu yoluyla VWF hedeflerinin fonksiyonel validasyonunu sağlar.
- Bilimsel Değer: Trombus nidus oluşumuyla ilgili endotel yerleşimli VWF dinamiklerini modelleyerek biyolojik risk azaltımını destekler.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilişkili endotelyal sistemleri, VWF salınımı ve trombosit yakalamasının standardize değerlendirmesi için hazırlar.
- Operasyonel Değer: Analiz standardizasyonu için VWF-trombosit dizisi oluşumunun tekrarlanabilir, kantitatif okumalarını sağlar.
- Bilimsel Değer: Kontrollü akış koşulları altında VWF salınımı ve trombosit bağlanması üzerindeki etkileri ölçerek güvenilir bileşik değerlendirmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Hücre dışı histonlar gibi inflamatuar stimülasyonlara yanıt olarak VWF salınımını modelleyerek translasyonel biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir, kayma bağımlı VWF-trombosit etkileşimleri aracılığıyla keşif aşamasından preklinik validasyona kadar süreklilik sağlar.
- Bilimsel Değer: Prokoagülan stimülasyon etkilerini trombosla ilgili sonlanım noktaları üzerinden nicelleştirerek risk ayarlı ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, mekanistik anlayışı ve bileşik taramasını destekleyen, VWF-trombosit etkileşimlerinin kayma kuvvetine bağımlı, kantitatif okumalarını sağlayarak hedef doğrulamadan öncül bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: VWF salınım mekanizmaları ve fizyolojik kayma altında trombosit bağlanma fonksiyonuna yönelik hipotez testlerini destekler.
- Tarama: VWF salınım modülatörlerini değerlendirmek için tekrarlanabilir, ölçülebilir çıktılara sahip, analize hazır endotelyal sistemler sunar.
- Analitik: Hizalanmış trombosit kümelerinin standartlaştırılmış görüntü tabanlı kantifikasyonunu kullanarak farklı koşullar arasında VWF-trombosit zincir oluşumunun karşılaştırılmasını sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Tromboz patofizyolojisi ile ilgili prokoagülan uyarılara verilen endotelyal yanıtları modelleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çok sayıda sekretagog, genetik model ve terapötik müdahale genelinde VWF biyolojisini değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: VWF-trombosit etkileşim yollarındaki mekanik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamada öngörücü güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Kontrollü shear altında string oluşumunun ölçülebilir ve gerçek zamanlı görselleştirmesi aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Trombotik riskin ve endotelyal aktivasyon profillerinin erken değerlendirilmesine olanak tanıyarak go/no-go kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hastalıkla ilgili sistemlerde VWF bağımlı trombüs oluşum potansiyelini nicelleştirerek riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Doğru kurulum ve nicelleştirme için endotel hücre kültürü, akış dinamiği ve floresan mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- Akış odası sistemleri, şırınga pompaları ve EMCCD özellikli spinning disk mikroskoplar dahil olmak üzere özel enstrümantasyona bağımlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için stimülasyon protokollerinin, trombosit hazırlığının ve görüntü analiz eşiklerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı endotel modellerine, lökosit ko-kültürlerine veya proteolitik cleavage analizlerine genişletildiğinde adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Prosedürel önlemlerde belirtildiği üzere, trombosit perfüzyonu sırasında stabil akışın sürdürülmesinin ve hava kabarcığı oluşumunun önlenmesinin teknik karmaşıklığı ile sınırlıdır.
