Name: Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Keşfedin MLV türevli retroviral vektörlerin insan hücrelerindeki entegrasyon bölgelerini haritalama yöntemini. Bu protokol gen tedavisi ve gen düzenleme çalışmalarında hücreye özgü düzenleyici bölgeleri tanımlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), İtalya Eğitim Bakanlığı, Üniversiteler ve Araştırma Bakanlığı&#39;nın (Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003&#39;teki FIRB-Futuro) hibeleriyle desteklendi , EPIGEN Epigenomik Flagship Projesi), İtalyan Sağlık Bakanlığı (Genç araştırmacılar Çağrı 2011 GR-2011-02352026) ve Imagine Enstitüsü Vakfı (Paris, Fransa).

1. İnsan Hücrelerinin MLV İletimi <ol><li> Hedef hücreleri izole edin ve bunları eGFP raportör genini barındıran ve Veziküler Stomatit Virüs G (VSV-G) veya amfotropik zarf glikoproteini 16 ile pseudotiplenen bir mLV türevi retroviral vektör ile transdüseyin. <ol><li> Aşağıdaki analizler için sahte transduced hücreleri olumsuz bir kontrol olarak tutun. MLV&#39;ye dayalı retroviral vektörler etkili bir şekilde bölünen hücreleri dönüştürdüğünden, hedef hücre popülasyonunu hücre bölünmesini uyaran koşullarda kültürleyin. Transdüksiyon koşulları, çalışılan her hücre tipi için özel olarak optimize edilmelidir. İnsan hematopoietik progenitörleri, T hücreleri ve epidermal hücreler için hücre büyümesi ve transdüksiyon koşulları Referans 7, 14, 15 ve 17&#39;de açıklanmaktadır. </li></ol></li><li> Transdüksiyondan 48 saat sonra, 100,000 hücreyi% 2 fetal sığır serumu içeren fosfat tamponlu salin (PBS) 300 mcL içinde tekrar süspanse edin ve eGFP ekspresyonunu f olarak ölçünDüşük sitometrik analiz (488 nm uyaran lazer). Sahte iletim hücreleri negatif kontrol olarak kullanın. En uygun entegrasyon bölgesi alımı için, GFP + hücrelerini Floresan Aktif Hücre Ayırma (FACS) ile arındırın. </li><li> Genomik DNA hazırlığı için 0.5 ila 5 milyon hücre toplayın. Entegre edilmemiş provirüsün seyreltilmesi için uzun bir kültür periyodu (&gt; 7 gün) tercih edilir ve iyi nazlı kök hücrelerin uzun vadeli yavrularının analizi yapılırken gereklidir (bkz. Tartışma Bölümü ve referans 15 ). Hücre peletleri derhal dondurulabilir ve kullanıma kadar -80 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 2. Linker aracılı PCR (LM-PCR) ile mLV entegrasyon alanlarının amplifikasyonu <ol><li> Genomik DNA&#39;nın (gDNA) hazırlanması <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre, kolon bazlı bir DNA özütleme kiti kullanarak gDNA&#39;yı çıkarın ve kültürlenmiş hücreler için protokolü takip edin. </li></ol></li><li> Restriksiyon enzim digestiüzerinde <ol><li> 1.5 mL tüpler içinde numune başına 4 kısıtlama enzim sindirimi oluşturun. 10 uL&#39;lik bir son hacimde 1 uL Tru9I (10U) ve 1 uL Tampon M ilave ederek her tüpte 0.1 ila 1 μg gDNA&#39;yı özümleyin. Reaksiyonları 6 saat boyunca veya gece boyunca 65 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her reaksiyona 1 μL PstI (10U), 1 μL Tampon H ve 8 μL su ilave edin. Reaksiyonları 37 ° C&#39;de 6 saat veya gece boyunca inkübe edin. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> Bağlayıcı ligasyonu <ol><li> Bağlayıcı artı iplikçiği ve bağlayıcı eksi iplikçik oligonükleotidlerini 100 uM konsantrasyonda karıştırarak 1.5 mL&#39;lik bir tüp içinde 100 uM Tru9I bağlayıcı stok solüsyonu hazırlayın. Tüpü 100 ° C&#39;ye ayarlanmış bir suya koyun ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Tru9I linker stok solüsyonu kullanıma kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> 1.5 mL tüplerde 8 bağlayıcı ligasyon reaksiyonu oluşturun. Her reaksiyon için aşağıdaki bileşeni ekleyinS ila 10 uL kısıtlama enzimi sindirimi: 1.4 uL 10X T4 DNA Ligaz Reaksiyon tamponu, 1 uL 10 uM bağlayıcı Tru9I, 1 uL (2.000 U) T4 DNA ligazı ve 0.6 uL su. 16 ° C&#39;de 3 ila 6 saat inkübe edin. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> Birinci PCR <ol><li> 0.2 mL tüpler içinde 48 PCR reaksiyonu (her ligasyon tüpünden 6 reaksiyon) ayarlayın. Her bir PCR için ligasyon reaksiyonundan 2 μL&#39;ye aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 5 μL 10X PCR tamponu, 50 μM magnezyum sülfat 2 μL, 10 μM deoksinükleotit (dNTP) Karışımı, 1 μL 10 uM bağlayıcı primer, 1 μL 10 uM mLV-3 &#39;LTR primeri, 0.3 uL (1.5U) Taq DNA Polimeraz ve 37.7 uL su ilave edildi. Primer sekanslar Tablo 1&#39;de verilmektedir. </li><li> Aşağıdaki gibi ısıtılmış kapaklı bir termal döngüleyici içinde PCR reaksiyonu yapın: 95 ° C&#39;de 2 dakika; 15 saniye için 95 ° C, 25 ° C&#39;de 30 saniye, 72 ° C&#39;de 1 dakika; 72 °5 dakika boyunca C; 4 ° C&#39;de tutun. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> İkinci PCR <ol><li> 0.2 mL&#39;lik tüplerde 48 PCR reaksiyonu ayarlayın (her biri &quot;birinci PCR&quot; tüpünden 1&#39;dir). Her bir PCR için, ilk PCR reaksiyonunun 2 μL&#39;sine aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 5 μL 10X PCR tamponu, 50 mM Magnezyum Sülfat, 1 μL 10 mM dNTP Mix, 10 uM linker iç içe geçmiş primer 1 uL, 2 μL 10 uM mLV-3 &#39;LTR iç içe astar, 0.3 uL Taq DNA Polimeraz (1.5 U) ve 37.7 uL su ilave edildi. Seçilen spesifik muazzam sıralama stratejisi için tasarlanmış iç içe geçmiş primerler kullanın: (i) Illumina platformuyla uyumlu bağlayıcı iç içe astar ve mLV-3 &#39;LTR iç içe astar; (Ii) Roche platformuyla uyumlu bağlayıcı iç içe astar ve mLV-3 &#39;LTR iç içe astar. Primer sekanslar Tablo 1&#39;de listelenmiştir. </li><li> Aşağıdaki gibi ısıtılmış kapaklı bir termal döngüleyici içinde PCR reaksiyonu yapın: 95 ° C&#39;de 2 dakika; 2595 ° C&#39;de 15 saniye, 58 ° C&#39;de 30 saniye, 72 ° C&#39;de 1 dakika; 72 ° C&#39;de 5 dakika; 4 ° C&#39;de tutun. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> 48 yuvalanmış PCR reaksiyonlarını 15 mL&#39;lik bir tüpe (son hacim ~ 2.4 mL) doldurun. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> Agaroz jel elektroforezi ile LM-PCR ürünlerinin varlığını ve boyutunu belirleyin. <ol><li> 20 mcL LM-PCR ürünlerine 4 mcL Yükleme Tamponu ekleyin ve 100 bp DNA merdiven ile birlikte% 1 agaroz jel üzerine numune yükleyin. Jel 30 ila 60 dakika boyunca 5 V / cm&#39;de çalıştırın ve etidyum bromid boyama ile PCR ürünlerini görselleştirin. </li><li> Olumsuz kontrol olarak taklit transduced örnek bir LM-PCR reaksiyonu çalıştırın. </li></ol></li><li> Amfikonları, 0.1 hacim sodyum asetat çözeltisi (3 M, pH 5.2) ve 2.5 hacim% 100 etanol ekleyerek çöktürün. Karıştırıp -80 ° C&#39;de 20 dakika boyunca dondurun. <ol><li> Fuarda dönüyorStandart bir mikrosantrifüjde 20 dakika 4 ° C&#39;de hız uygulayacağız. Süpernatantı atın ve pelleti% 70 etanol ile yıkayın. Standart bir mikrosantrifüjde 4 ° C&#39;de 5 dakika tam hızda döndürün. </li><li> Süpernatantı atın ve peleti havayla kurutun. 200 μL PCR sınıfı su ekleyin ve DNA&#39;yı tekrar süspanse edin. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> 100 μL LM-PCR ürününe 20 μL Yükleme Tamponu ekleyin ve 100 bp DNA merdiveni ile birlikte% 1 agaroz jel üzerine numune yükleyin. <ol><li> Jel 30 ila 60 dakika boyunca 5 V / cm&#39;de çalıştırın ve 150 ila 500 bp uzunluğunda amplikon içeren jel kısmını kesin. </li><li> LM-PCR ürünlerini kolon bazlı bir jel özütleme kiti ile saflaştırın ve bir UV spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçün. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir biyolojik analiz cihazı kullanarak LM-PCR ürünlerinin uzunluğunu değerlendirmek için 1 μL kitaplık kullanın. </li><li><sTrong&gt; Amfikonların Shotgun klonlaması <ol><li> Saflaştırılmış LM-PCR ürünlerinden 20 ng kullanın ve üreticinin talimatlarına uygun olarak pCR2.1-TOPO vektörüne klonlayın. </li><li> Uygun olan örnekleri tanımlamak için klonların% 50&#39;sinde viral genom kavşakları (mLV-3 &#39;LTR iç içe astar dahil) varlığını açığa çıkarmak için M13 Universal primerini ve ardından oluşan dizilerin genomik haritalanmasını takip eden sekanslama reaksiyonları gerçekleştirin Muazzam sıralama için. Bir viral-genom kavşağı örneği: <img alt="kavşak" src="/files/ftp_upload/55919/55919junction.jpg" /> MLV-3 &#39;LTR iç içe astar 454 ve bağlayıcı iç içe astar 454 ( Tablo 1 ) kalın olarak ve viral LTR&#39;nin italik olarak 3&#39; ucunda belirtilmiştir. İnsan genom dizisi kırmızı metinle vurgulanır (chr10: 6439408-6439509, hg19). </li></ol></li></ol> 3. mLV Entegrasyon Sitelerinin Devasa Dizilimi NOT: LM-PCR prodTicari platformlar kullanılarak sekanslar sıralanabilir (ikinci PCR reaksiyonunda uygun iç içe geçmiş primer çiftinin seçilmesi, alt bölüm 2.5.1&#39;e bakınız). Roche GS-FLX pirosequencing platformu ile sıralama için, önceki kağıtlara 7 , 14 , 15 bakınız. Bu bölümde, Illumina sıralama platformu için yeni optimize edilmiş bir protokol açıklanmaktadır. <ol><li> Kütüphane hazırlığı <ol><li> 0.2 mL tüpler içinde numune başına 1 endeksleme PCR reaksiyonu oluşturun. Her bir PCR için 5 μL (150-170 ng) saflaştırılmış LM-PCR ürününe aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 5 μL Index Primer 1, 5 μL Index Primer 2, 25 μL 2X Master Mix ve 10 μL PCR- Düşük su. Her numune için farklı bir indeks kombinasyonu kullanın. </li><li> Aşağıdaki gibi, ısıtılmış kapaklı bir termal döngüleyici içinde PCR reaksiyonlarını gerçekleştirin: 95 ° C&#39;de 3 dakika; 30 saniye için 95 ° C, 8 saat 30 saniye boyunca 55 ° C, 30 saniye boyunca 72 ° C; 72 ° C&#39;de 5 miçinde; 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> Bir katı faz reversible immobilizasyon (SPRI) boncuk izolasyon protokolünü kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın: Yeni 1.5 mL tüplerde, her bir numuneye 56 μL boncuk ekleyin ve üretici talimatlarını takip edin. 25 mcL Tris-HC1 10 mM içinde elute edin. Kütüphaneler kullanıma kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> Kütüphane kontrolü <ol><li> Bir biyolojik analiz cihazı kullanarak kütüphane boyutunu değerlendirmek için 1 uL örnek kullanın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre, floresan esaslı bir Gerçek zamanlı PCR testi kullanarak kütüphane molaritesini nicelemek için 1 uL numune kullanın. </li></ol></li><li> Kütüphane seyreltme ve sıralama <ol><li> Tris-HC1 10 mM kullanarak kütüphaneleri 10 nM&#39;ye seyreltin. Kütüphaneleri bir araya getirmek için, her bir seyreltilmiş kütüphanenin 5 uL&#39;ini yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın ve ardından havuzu, 10 mM Tris-HC1 içinde 4 nM&#39;ye seyreltin. </li><li> 5 μL seyreltilmiş havuzu, 5 mcL 0.2 N NaOH ile yeni bir 1,5 mL tüp, kısaca vorteksleyin, aşağı spinleyin ve kütüphaneleri denatürecek şekilde oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> Tüpleri buz üzerine koyun ve önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponu (HT1) 990 μL ekleyin. Yeni bir 1.5 mL tüp içinde 300 uL denatüre edilmiş havuz alınır ve 10 pM son kütüphane havuzunu elde etmek için 300 μL önceden soğutulmuş HT1 ilave edin. </li><li> Buna paralel olarak, 2 mL&#39;lik bir PhiX kontrol kütüphanesi (10 nM) ile 3 mL Tris-HC1 10 mM içeren 1.5 mL&#39;lik bir tüple karıştırın. Seyreltilmiş PhiX denatüre etmek için 5 μL NaOH 0.2 N, kısa bir süre vorteksleyin, spin aşağı indirin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Tüpü buz üzerine koyun ve 990 μL önceden soğutulmuş HT1 ekleyin. </li><li> Yeni bir 1.5 mL tüp içinde 300 uL denatüre PhiX ilave edin ve 10 pM final PhiX elde etmek için 300 μL önceden soğutulmuş HT1 ekleyin. </li><li> Yeni bir 1.5 mL tüp içinde, denatüre edilmiş PhiX kitaplığının 90 uL&#39;si ile denatüre edilmiş kütüphane havuzu 510 uL&#39;yi karıştırın, böylece% 15 PhiX kontrollü bir son 10 pM havuz elde edin. </li><li> Bu 600 μL numuneyi pipetleyinÇözülmüş sıralama reaktifi kartuşunun Load Sample deposuna boşaltın ve hemen tek okunan 150 çevrimlik bir çalışma yapmak için devam edin. NOT: Bu protokol için gerekli kritik reaktifler ve primer dizileri Tablo 1&#39;de listelenmiştir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+enhancers%3A+from+properties+to+genome-wide+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions.</a> Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-enhancers+in+the+control+of+cell+identity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Super-enhancers in the control of cell identity and disease.</a> Cell. 155 (4), 934-947 (2013).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+identifies+active+regulatory+elements+in+human+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors.</a> Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).</li>
<li>Biasco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+profile+of+retroviral+vector+in+gene+therapy+treated+patients+is+cell-specific+according+to+gene+expression+and+chromatin+conformation+of+target+cell%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell.</a> EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).</li>
<li>De Ravin, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+are+major+targets+for+murine+leukemia+virus+vector+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration.</a> J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).</li>
<li>LaFave, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mLV+integration+site+selection+is+driven+by+strong+enhancers+and+active+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters.</a> Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).</li>
<li>Gupta, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromo-+and+extraterminal+domain+chromatin+regulators+serve+as+cofactors+for+murine+leukemia+virus+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration.</a> J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BET+proteins+promote+efficient+murine+leukemia+virus+integration+at+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).</li>
<li>De Rijck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BET+family+of+proteins+targets+moloney+murine+leukemia+virus+integration+near+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites.</a> Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).</li>
<li>Romano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional%2C+epigenetic+and+retroviral+signatures+identify+regulatory+regions+involved+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment.</a> Sci Rep. 6, 24724(2016).</li>
<li>Cavazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Transcriptional+and+Epigenetic+Regulation+of+Human+Epidermal+Keratinocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation.</a> Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).</li>
<li>Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+helper-free+amphotropic+retroviruses+that+transduce+a+dominant-acting%2C+methotrexate-resistant+dihydrofolate+reductase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene.</a> Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+defines+the+fate+of+allogeneic+T+cells+after+donor+lymphocyte+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion.</a> PLoS One. 5 (12), e15688(2010).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Biffi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+benefits+metachromatic+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy.</a> Science. 341 (6148), 1233158(2013).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li>
<li>Gillet, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+genomic+environment+of+the+provirus+determines+the+abundance+of+HTLV-1-infected+T-cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones.</a> Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, kromatin bölgelerini hedefleyen bir epigenetik olarak aktif promotörler ve arttırıcılar olarak işaretlenmiş bir retrovirüs olan mLV&#39;nin entegrasyon sitelerinin genom çapında haritalandırılması için bir protokolü açıkladık. Protokolün kritik adımları ve / veya sınırlamaları şunları içerir: (i) hedef hücre popülasyonunun mLV iletim; (Ii) LM-PCR ile virüs-konakçı bağlantı noktalarının çoğaltılması; (Iii) entegrasyon alanlarının yüksek bir kısmının alınması. MLV tabanlı retroviral vektörler bölerek bölünen hücre...

Hücre kimliği, spesifik gen gruplarının ifadesi ile belirlenir. Organizmalar ve arttırıcılar gibi cis düzenleyici elemanların rolü, hücre tipi spesifik transkripsiyonel programların aktivasyonu için çok önemlidir. Bu düzenleyici bölgeler, çeşitli hücre tipleri 1 , 2 , 3&#39;te genom geniş tanımlaması için yaygın olarak kullanılan özel histon modifikasyonları, transkripsiyon faktörleri ve ko-faktör bağlama ve kromatin erişilebilirliği gibi spesifik kromatin özellikleri ile karakterizedir. Özellikle, histone H3 lizin 27&#39;nin (H3K27ac) asetillenmesinin genom çapındaki profili aktif promotörleri, arttırıcıları ve süper arttırıcıları 4 , 5 , 6 tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Moloney fare lösemi virüsü (MLV) gen için yaygın olarak kullanılan bir gamma-retrovirüsüdürMemeli hücrelerinde transfer. Bir hedef hücrenin enfekte edilmesinden sonra, retroviral RNA genomu, ön entegrasyon kompleksini (PIC) birleştirmek için viral ve hücresel proteinleri bağlayan çift sarmallı bir DNA molekülüne retro-transkribe edilir. PIC çekirdeğe girer ve konakçı hücre kromatini bağlar. Burada, anahtar bir PIC bileşeni olan viral integraz, proviral DNA&#39;nın konukçu hücre genomuna entegrasyonuna aracılık eder. Genomik DNA&#39;daki mLV entegrasyonu rasgele değil, ancak promotör ve güç arttırıcılar gibi aktif cis düzenleyici elemanlarda, hücreye özel bir biçimde 7 , 8 , 9 , 10 meydana gelir. Bu özel entegrasyon profiline, mLV integraz ile hücresel bromodomain ve ekstraterminal alan (BET) proteinleri 11 , 12 , 13 arasındaki doğrudan etkileşim aracılık eder. BET proteinleri (BRD2, BRD3 veBRD4), konak kromatin ve mLV PIC arasında bir köprü görevi görürler: ekstratik alan, mLV integraz 11,12,13 ile etkileşirken, bromodomainsleri yoluyla yüksek oranda asetillenmiş cis düzenleyici bölgeleri tanımaktadırlar. Burada, mLV&#39;nin entegrasyon özelliklerine dayalı aktif cis düzenleyici bölgeleri haritalamak için yeni bir araç olan retroviral taramayı tarif ediyoruz. Kısaca hücreler, arttırılmış yeşil floresan protein (eGFP) raportör genini eksprese eden mLV türevi retroviral vektör ile transdüser hale getirilir. Genomik DNA özümlemesinden sonra, mLV vektörünün 3 &#39;uzun terminal tekrarlaması (LTR) ile genomik DNA arasındaki bağlantı noktaları, bağlayıcı aracılı PCR (LM-PCR) ile çoğaltılmakta ve kitlesel sekanslanmaktadır. MLV entegrasyon bölgeleri insan genomuna eşlenir ve mLV tarafından yüksek oranda hedeflenen genomik bölgeler, mLV entegrasyon siteleri kümeleri olarak tanımlanır. Retroviral taramaNing birçok insan primer hücrelerinde hücreye özgü aktif düzenleyici elementleri tanımlamak için kullanılmıştır 14,15. MLV kümeleri, çoğu H3K27ac gibi aktif histon işaretlerini barındıran ve hücreye spesifik olan, epigenetik olarak tanımlanmış yükselticiler ve eşlenik maddeler ile birlikte eşlendi. Retroviral tarama prospektif olarak saflaştırılmış hücre popülasyonlarında 7 , 14 yanı sıra prospektif izolasyon için etkili belirteçlerden yoksun olan keratinosit kök hücreleri gibi retrospektif olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarında DNA düzenleyici elementlerin genom çapında belirlenmesini sağlar.

<table><tbody><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoScientific</td><td>10010031</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ThermoScientific</td><td>16000044</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>0.2 ml tüpler</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tüpler</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN QIAmp DNA mini Kiti ve nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>51306</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz Reaksiyon tamponu</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Bağlayıcı Artı Strand oligonükleotid</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td>5'-PO 4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3' &nbsp; (Arıtma derecesi: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Bağlayıcı Eksi Iplikçik oligonükleotid</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td>5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Arıtma derecesi: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Tru9I</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11464825001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer M</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417983001</td><td></td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>10798991001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Tampon H</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417991001</td><td></td></tr><tr><td>Platin Taq DNA Polimeraz Yüksek Sadakat&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Karışımı</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>PCR sınıfı su</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu termal döngüleyici (ısıtmalı kapaklı)</td> <td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bağlayıcı astar</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td>5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Arıtma derecesi: PCR sınıfı)</td></tr><tr><td>MLV-3' LTR astar</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td>5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (Arıtma derecesi: PCR sınıfı)</td></tr><tr><td>bağlayıcı iç içe astar 454</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td>5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG [AGGGCTCCGCTTAAGGGAC] (Saflaştırma sınıfı: SDS-PAGE)</td></tr> <tr><td>MLV-3' LTR iç içe astar 454</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td>5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Saflaştırma sınıfı: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>bağlayıcı iç içe astar Illumina</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td>5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Saflaştırma derecesi: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3' LTR iç içe astar Illumina</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td>5'-GTCTCGTGGCGGAGATGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Saflaştırma derecesi: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Sodyum Asetat Çözeltisi (3M) pH 5.2</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji için etanol (mutlak)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Topo TA Klonlama kiti (pCR2.1-TOPO vektör ile)</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Etidyum bromür&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>100 bp DNA merdiveni</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>6x Yükleme Tamponu</td><td>ThermoScientific</td><td>R0611</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 UV-Vis Spektrofotometre</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT İndeks kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001 veya FC-131-1002</td><td></td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi Sıcak Başlangıç Hazır Karışımı&nbsp;</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>2 ml tüpler için dinamik stand</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 60 ml kiti</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl 10 mM, pH 8.5</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2200 TapeStation sistemi Agilent</td><td>Technologies</td><td>G2964AA</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>D1000 Reaktifleri</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Illumina platformları için KAPA Kitaplığı Miktar Belirleme Kiti (ABI Prism)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4835</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7900HT Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4329003</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 1.0 N, moleküler biyoloji sınıfı</td><td>genel laboratuvar tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT1 (Hibridizasyon Tamponu)</td> <td>Illumina&nbsp;</td><td>MiSeq Reaktif Kitinde</td><td></td>sağlanır</tr><tr><td>MiSeq Reaktif Kiti v3 (150 döngü)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Sistemi</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

retroviral tarama: hücreye Özel düzenleyici bölgeleri tanımlamak İçin mlv entegrasyon konumlarının haritalandırılması

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney sıçangil lösemisi (MLV) virüs esaslı retroviral vektörler ağırlıklı olarak asetile arttırıcılar ve yükselticiler ile bütünleşir. Bu nedenle, mLV entegrasyon bölgeleri, aktif düzenleyici elementlerin işlevsel belirteçleri olarak kullanılabilir. Burada, hücreye özgü güçlendiricilerin ve yükselticilerin genom çapında tanımlanmasına olanak tanıyan bir retroviral tarama aleti sunuyoruz. Kısacası, hedef hücre popülasyonu, bir mLV türevi vektör ile transdüser hale getirilir ve genomik DNA sık sık kesme kısıtlama enzimi ile sindirilir. Genomik fragmanları uyumlu bir DNA bağlayıcısı ile bağladıktan sonra, linker aracılı polimeraz zincir reaksiyonu (LM-PCR), virüs konakçı genom kavşaklarının çoğaltılmasına izin verir. Genis çapında mLV entegrasyon profilini tanımlamak için amplikonların seri sıralaması kullanılır. Son olarak, tekrarlayan entegrasyon kümeleri, hücre tipine özgü transkripsiyonel programların aktivasyonundan sorumlu, hücreye özgü düzenleyici bölgelerin tanımlanması için tanımlanır. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Retroviral tarama aleti, prospektif olarak izole edilmiş hedef hücre popülasyonlarında hücreye özgü hızlandırıcıların ve arttırıcıların genom çapında tanımlanmasına izin verir. Özellikle, retroviral tarama, prospektif izolasyon için sağlam belirteçlerden yoksun nadir bulunan popülasyonların ( ör., Somatik kök hücreler) retrospektif olarak tanımlanması için bir enstrümantal tekniktir.

Retroviral tarama prosedürünün iş akışı Retroviral tarama prosedürünün iş akışı Şekil 1&#39;de şematize edilmiştir. Hedef hücre popülasyonu arıtılır ve bir eGFP raportör geni ifade eden bir mLV türevi retroviral vektör ile transforme edilir. Transgen, viral genomun konak DNA&#39;sına sentezini, ters transkripsiyonunu ve entegrasyonunu sağlayan, iki özdeş uzun terminal tekrarları (5 &#39;ve 3&#39; LTR...

Burada, insan hücrelerinde Moloney fare lösemi virüsü tabanlı retroviral vektörlerin entegrasyon alanlarının genom çapında haritalanması için bir protokolü açıklıyoruz.

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Bu prosedürün genel amacı, hücreye özgü düzenleyici bölgeleri tanımlamak için fare lösemi virüsü kaynaklı retroviral vektörlerin entegrasyon bölgelerini haritalandırmaktır. Bu yöntem; vektörün insan genomunda nereye entegre olduğu ve hangi düzenleyici elementin belirli bir alt tip aracılığıyla aktif olarak kullanılabileceği gibi, gen tedavisi ve gen düzenleme çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem için ilk fikir, gen tedavisi çalışmalarında MLV vektörlerinin aktif alt spesifik promotörlere ve enhancer'lara entegre olduğu gözlemlenerek geliştirilmiştir.EGFP raporlayıcı genini taşıyan ve VSV-G veya amfrotropik zar glikoproteini ile psödotipleştirilmiş MLV türevli bir retroviral vektör ile hedef hücreleri transduse ederek başlayın. Sahte transduse edilmiş hücreler negatif kontrol olarak kullanılır. Transdüksiyondan 48 saat sonra örnekleri santrifüjleyin ve ardından 100.000 hücreyi, yüzde iki fetal bovin serum içeren 300 mikrolitre PBS içinde yeniden süspanse edin.Ardından, EGFP ekspresyonu akış sitometrisi analizi ile ölçülür. Genomik DNA preparasyonu ve ardından yapılacak restriksiyon enzimi sindirimi için transduksiyon yapılmış başka 0,5 ile beş milyon hücre toplanır. Örnek başına dört restriksiyon enzimi sindirimi 1,5 mililitrelik tüplerde hazırlanır.Her tüpteki 0.1 ile 1 µg arasındaki G-DNA'yı sindirin. Örnek başına 10 unit TRU91 ve 1 µL tampon M ekleyerek toplam hacmi 10 µL'ye tamamlayın. Karışımdan 2 µL'yi sindirim tüplerine aktarın.Ardından reaksiyonları 65 °C'de altı saat veya gece boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 1,5 mL'lik bir tüpe 40 µL su ekleyin. Aynı tüpe, örnek başına 10 ünite PST1 ve 1 µL tampon H ekleyin.Sindirilm tüplerine 10 µL sindirim reaksiyon karışımı dağıtın. Reaksiyonları 37 °C'de altı saat veya gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, 1,5 mL tüplerde sekiz adet linker ligasyon reaksiyonu hazırlayın.Her bir reaksiyon için, ligaz reaksiyon karışımını 10 µL sindirilmiş genomik DNA'ya ekleyin. 16 °C'de üç ila altı saat boyunca inkübe edin. Birinci tur PCR için, 0,2 mL tüplerde 48 PCR reaksiyonu hazırlayın.Her bir PCR için, linker primer ve MLV3 prime LTR primer içeren reaksiyon karışımını, iki microliter ligasyon reaksiyonuna ekleyin. Numuneleri ısıtmalı kapaklı bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Döngü parametrelerini ayarlayın ve ilk tur PCR reaksiyonunu gerçekleştirin.İkinci tur PCR için, linker nested primer ve MLV3 prime LTR nested primer içeren reaksiyon karışımını hazırlayın. Ardından, kalıp olarak birinci tur PCR'dan elde edilen PCR ürününden iki mikrolitre ekleyin. Daha sonra, nihai LN PCR ürünlerini üretmek için ikinci tur PCR reaksiyonunu gerçekleştirin.İkinci tur PCR'dan sonra, 48 nested LM PCR reaksiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe toplayın. Ardından, havuzlanmış ve çöktürülmüş LM PCR ürününün 100 mikrolitresine 20 mikrolitre yükleme tamponu ekleyin. Örneği, 100 baz çiftlik DNA merdiveni ile birlikte yüzde bir oranında agaroz jeli üzerine yükleyin.Bantlar ayrıştıktan sonra jeli santimetre başına beş volt gerilimle 30 ila 60 dakika boyunca çalıştırın ve 500 ila 150 baz çifti uzunluğundaki amplikonları içeren jel kısmını kesin. LM PCR ürününü kolon bazlı bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırdıktan sonra, kütüphane hazırlama aşamasına geçmeden önce konsantrasyonu bir UV spektrofotometre kullanarak ölçün. Ayrıca, üretici talimatlarına uygun olarak bir bioanalyzer cihazı kullanarak LM PCR ürünlerinin uzunluğunu değerlendirin.Bir indeksleme PCR'si kurarak kütüphaneyi hazırlayın. Her PCR için, her örnek için farklı indeks kombinasyonları kullanarak 150 ila 170 nanogram saflaştırılmış LM PCR ürünü kullanın. PCR'yi, belirtildiği şekilde ısıtmalı kapaklı bir termal döngüleyici cihazda gerçekleştirin.PCR işleminin ardından, saflaştırılmış kütüphaneyi 10 millimolar tris HCL ile 10 nanomolar olacak şekilde seyreltin. Ardından, yeni bir 1.5 milliliter tüp içerisinde beş mikrolitre seyreltilmiş havuzu beş mikrolitre 0.2 newtons sodyum hidroksit ile karıştırın. Kısa süre vorteksleyin, santrifüjleyin ve kütüphaneleri denatüre etmek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Denatüre edilmiş havuz tüplerini ve önceden soğutulmuş 990 µL HT1 hibridizasyon tamponunu buz üzerine yerleştirin. Ardından, denatüre edilmiş havuzdan 300 µL'lik bir miktarı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. On picomolar nihai kütüphane havuzu elde etmek için 300 µL önceden soğutulmuş HT1 ekleyin.Paralel olarak, 1,5 mililitrelik bir tüp içerisinde 3 mikrolitre 10 milimolar tris HCl ile 2 mikrolitre hacminde 10 nanomolar sabit kontrol kütüphanesini karıştırın. Beş mikrolitre 0,2 newton sodyum hidroksit ekleyin ve kısa süre vortexleyin. Santrifüjle çöktürdükten sonra, seyreltilmiş sabiti denatüre etmek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından tüpü buza yerleştirin ve 990 µL önceden soğutulmuş HT1 ekleyin. Şimdi, denatüre edilmiş fix'ten 100 µL'yi yeni bir 1,5 mL tüpe alikotlayın ve fix'in 10 pM nihai konsantrasyonunu elde etmek için 300 µL önceden soğutulmuş HT1 ekleyin. Son olarak, yeni bir 1,5 mL tüpte, 510 µL denatüre kütüphane havuzunu 90 µL denatüre sabitlenmiş kütüphane ile karıştırarak, sekanslanacak olan ve %15 fix kontrolü içeren nihai 10 pM'lik bir havuz elde edin.Bu görüntü, sırasıyla hematopoetik kök progenitör hücrelerde 3498, eritroid progenitörlerde 2989 ve miyeloid progenitörlerde 4103 tekrarlayan MLV entegrasyon bölgesi kümesinin analizini göstermektedir. Her hücre popülasyonunda, MLV kümelerinin %95'inden fazlası epigenetik olarak tanımlanmış enhancerlar ve promotörlerle örtüşmüştür. Hücreye özgü MLV hedefli bölgeler yüksek derecede asetillenmişti ve hedeflenen genin hücreye özgü ekspresyonu ile ilişkiliydi.Örnekler arasında HSP'ye özgü SPINK2 geninin promotörü, eritroide özgü beta benzeri globin genlerinin güçlü enhancerlarını içeren lokus kontrol bölgesi ve NPP'ye özgü LYZ geninin yukarısında yer alan enhancerlar bulunmaktadır.Lusiferaz raporlayıcı analizleri, EPP ve MPP'deki hücreye özgü MLV hedefli enhancer alt kümesini doğrulamıştır. Eritroide özgü MLV hedefli bölgeler, MPP'ye kıyasla EPP'de daha yüksek aktivite göstermiş ve tersi de geçerli olmuştur; bu durum, MLV'nin yakınlardaki genlerin ekspresyonunu muhtemelen kontrol eden hücreye özgü enhancer'ları tanımladığını doğrulamaktadır. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığında bir hafta içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, optimal entegrasyon bölgesi geri kazanımı için transduksiyon yapılmış hücrelerin sıklığını maksimize etmeyi hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, önce genomik DNA'yı ayarlayıp ardından genomik fragmanları bir DNA bağlayıcısı (linker) ile ligasyon yaparak, ardından konak genom viral eklemini LM PCR aracılığıyla amplifiye ederek ve son olarak amplikon kütüphanesini derin sekanslama ile analiz ederek viral entegrasyon bölgelerinin nasıl haritalandırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

retroviral-scanning-mapping-mlv-integration-sites-to-define-cell

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

İnsan genomunun% 8'ini işgal insan endojen retrovirüsleri (herv), kıt kodlama kapasitelerini ama yüz bin uzun terminal tekrarları (LSY) korur. Özel bir Affymetrix mikroarray bireysel herv odağı ifade belirlemek için tasarlanmıştır ve gelecekteki klinik çalışmalar için kavramının bir kanıtı olarak prostat kanseri dokularda kullanıldı.

Prostat Kanserinde Biyomarker Discovery Uygulama: Bireysel herv Lokusları İfade Mikroarray tabanlı Kimlik

Doğrusal amplifikasyon aracılı (LAM)-PCR genomu içinde entegre viral vektörlerin tam konumlarını belirlemek için geliştirilen bir yöntemdir. Teknik gen tedavisi hastaların, vb roman vektör teknolojileri, T-hücresi çeşitlilik, kanser kök hücre modelleri, biyogüvenlik klonal dinamiklerini incelemek için üstün bir yöntem olarak gelişmiştir...

Doğrusal Amplifikasyon Dolayımlı PCR - Bilinmeyen Yollardan DNA Genetik Elemanları ve Karakterizasyonu lokalizasyonu

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) amplifikasyon ve sıralama tek, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses yakınındaki bir verimli ve yüksek işlem hacmi yöntemi sağlar ve potansiyellerini belirlenmesi için izin verir çoğaltma-yetkinlik. DÖNDÜRÜR önceki deneyleri gizli HIV-1 rezervuar sıralamak için tasarlanmış sınırlamalar üstesinden gelir.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

Biz yeni tüp bebek modelleri üretimi için seçili genomik sitelerdeki proviral tümleştirme özetlemek HIV-1 enfeksiyonu için genom mühendislik iş akışı mevcut. HIV kaynaklı gazetecilere hedefleme CRISPR-Cas9-aracılı, siteye özgü genom manipülasyon tarafından yönetilir. Detaylı iletişim kuralları tek hücreli klon üretimi, tarama ve doğru hedefleme doğrulama için sağlanan.

HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik

HIV verimli yeniden etkinleştirme işlev değerlendirmesi ve gizli proviruses boşluk için yüksek aktarım protokolü açıklanan ve müdahaleler HIV transkripsiyon üzerinde etkisini test ve yapıştırma uygulanır. Soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara geri ve yapıştırma gecikme etkisi temsilcisi sonuçları sağlanır.

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Insersiyonel mutajenez, fonksiyonel genomik elementleri tanımlamak için ileri genetikte önemli bir araçtır. Burada, lentivirüs tabanlı bir ekleme mutajenez hücre kütüphanesi içindeki lentivirüs entegrasyon bölgelerini tespit etmek için bir yöntem olan İşlevsel Öğeler ve Transkriptler için Yerleştirme Tabanlı Ekranı (InSET) açıklıyoruz.

Bir İnsersiyonel Mutajenez Hücre Kütüphanesinde İşlevsel Olarak İlgili Lentivirus Entegrasyon Bölgelerinin Tanımlanması

Keşfedin MLV türevli retroviral vektörlerin insan hücrelerindeki entegrasyon bölgelerini haritalama yöntemini. Bu protokol gen tedavisi ve gen düzenleme çalışmalarında hücreye özgü düzenleyici bölgeleri tanımlamaya yardımcı olur.

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Daha fazla video keşfet