Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Bu prosedürün genel amacı, hücreye özgü düzenleyici bölgeleri tanımlamak için fare lösemi virüsü kaynaklı retroviral vektörlerin entegrasyon bölgelerini haritalandırmaktır. Bu yöntem; vektörün insan genomunda nereye entegre olduğu ve hangi düzenleyici elementin belirli bir alt tip aracılığıyla aktif olarak kullanılabileceği gibi, gen tedavisi ve gen düzenleme çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem için ilk fikir, gen tedavisi çalışmalarında MLV vektörlerinin aktif alt spesifik promotörlere ve enhancer'lara entegre olduğu gözlemlenerek geliştirilmiştir.

EGFP raporlayıcı genini taşıyan ve VSV-G veya amfrotropik zar glikoproteini ile psödotipleştirilmiş MLV türevli bir retroviral vektör ile hedef hücreleri transduse ederek başlayın. Sahte transduse edilmiş hücreler negatif kontrol olarak kullanılır. Transdüksiyondan 48 saat sonra örnekleri santrifüjleyin ve ardından 100.000 hücreyi, yüzde iki fetal bovin serum içeren 300 mikrolitre PBS içinde yeniden süspanse edin.

Ardından, EGFP ekspresyonu akış sitometrisi analizi ile ölçülür. Genomik DNA preparasyonu ve ardından yapılacak restriksiyon enzimi sindirimi için transduksiyon yapılmış başka 0,5 ile beş milyon hücre toplanır. Örnek başına dört restriksiyon enzimi sindirimi 1,5 mililitrelik tüplerde hazırlanır.

Her tüpteki 0.1 ile 1 µg arasındaki G-DNA'yı sindirin. Örnek başına 10 unit TRU91 ve 1 µL tampon M ekleyerek toplam hacmi 10 µL'ye tamamlayın. Karışımdan 2 µL'yi sindirim tüplerine aktarın.

Ardından reaksiyonları 65 °C'de altı saat veya gece boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 1,5 mL'lik bir tüpe 40 µL su ekleyin. Aynı tüpe, örnek başına 10 ünite PST1 ve 1 µL tampon H ekleyin.

Sindirilm tüplerine 10 µL sindirim reaksiyon karışımı dağıtın. Reaksiyonları 37 °C'de altı saat veya gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, 1,5 mL tüplerde sekiz adet linker ligasyon reaksiyonu hazırlayın.

Her bir reaksiyon için, ligaz reaksiyon karışımını 10 µL sindirilmiş genomik DNA'ya ekleyin. 16 °C'de üç ila altı saat boyunca inkübe edin. Birinci tur PCR için, 0,2 mL tüplerde 48 PCR reaksiyonu hazırlayın.

Her bir PCR için, linker primer ve MLV3 prime LTR primer içeren reaksiyon karışımını, iki microliter ligasyon reaksiyonuna ekleyin. Numuneleri ısıtmalı kapaklı bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Döngü parametrelerini ayarlayın ve ilk tur PCR reaksiyonunu gerçekleştirin.

İkinci tur PCR için, linker nested primer ve MLV3 prime LTR nested primer içeren reaksiyon karışımını hazırlayın. Ardından, kalıp olarak birinci tur PCR'dan elde edilen PCR ürününden iki mikrolitre ekleyin. Daha sonra, nihai LN PCR ürünlerini üretmek için ikinci tur PCR reaksiyonunu gerçekleştirin.

İkinci tur PCR'dan sonra, 48 nested LM PCR reaksiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe toplayın. Ardından, havuzlanmış ve çöktürülmüş LM PCR ürününün 100 mikrolitresine 20 mikrolitre yükleme tamponu ekleyin. Örneği, 100 baz çiftlik DNA merdiveni ile birlikte yüzde bir oranında agaroz jeli üzerine yükleyin.

Bantlar ayrıştıktan sonra jeli santimetre başına beş volt gerilimle 30 ila 60 dakika boyunca çalıştırın ve 500 ila 150 baz çifti uzunluğundaki amplikonları içeren jel kısmını kesin. LM PCR ürününü kolon bazlı bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırdıktan sonra, kütüphane hazırlama aşamasına geçmeden önce konsantrasyonu bir UV spektrofotometre kullanarak ölçün. Ayrıca, üretici talimatlarına uygun olarak bir bioanalyzer cihazı kullanarak LM PCR ürünlerinin uzunluğunu değerlendirin.

Bir indeksleme PCR'si kurarak kütüphaneyi hazırlayın. Her PCR için, her örnek için farklı indeks kombinasyonları kullanarak 150 ila 170 nanogram saflaştırılmış LM PCR ürünü kullanın. PCR'yi, belirtildiği şekilde ısıtmalı kapaklı bir termal döngüleyici cihazda gerçekleştirin.

PCR işleminin ardından, saflaştırılmış kütüphaneyi 10 millimolar tris HCL ile 10 nanomolar olacak şekilde seyreltin. Ardından, yeni bir 1.5 milliliter tüp içerisinde beş mikrolitre seyreltilmiş havuzu beş mikrolitre 0.2 newtons sodyum hidroksit ile karıştırın. Kısa süre vorteksleyin, santrifüjleyin ve kütüphaneleri denatüre etmek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Denatüre edilmiş havuz tüplerini ve önceden soğutulmuş 990 µL HT1 hibridizasyon tamponunu buz üzerine yerleştirin. Ardından, denatüre edilmiş havuzdan 300 µL'lik bir miktarı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. On picomolar nihai kütüphane havuzu elde etmek için 300 µL önceden soğutulmuş HT1 ekleyin.

Paralel olarak, 1,5 mililitrelik bir tüp içerisinde 3 mikrolitre 10 milimolar tris HCl ile 2 mikrolitre hacminde 10 nanomolar sabit kontrol kütüphanesini karıştırın. Beş mikrolitre 0,2 newton sodyum hidroksit ekleyin ve kısa süre vortexleyin. Santrifüjle çöktürdükten sonra, seyreltilmiş sabiti denatüre etmek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından tüpü buza yerleştirin ve 990 µL önceden soğutulmuş HT1 ekleyin. Şimdi, denatüre edilmiş fix'ten 100 µL'yi yeni bir 1,5 mL tüpe alikotlayın ve fix'in 10 pM nihai konsantrasyonunu elde etmek için 300 µL önceden soğutulmuş HT1 ekleyin. Son olarak, yeni bir 1,5 mL tüpte, 510 µL denatüre kütüphane havuzunu 90 µL denatüre sabitlenmiş kütüphane ile karıştırarak, sekanslanacak olan ve %15 fix kontrolü içeren nihai 10 pM'lik bir havuz elde edin.

Bu görüntü, sırasıyla hematopoetik kök progenitör hücrelerde 3498, eritroid progenitörlerde 2989 ve miyeloid progenitörlerde 4103 tekrarlayan MLV entegrasyon bölgesi kümesinin analizini göstermektedir. Her hücre popülasyonunda, MLV kümelerinin %95'inden fazlası epigenetik olarak tanımlanmış enhancerlar ve promotörlerle örtüşmüştür. Hücreye özgü MLV hedefli bölgeler yüksek derecede asetillenmişti ve hedeflenen genin hücreye özgü ekspresyonu ile ilişkiliydi.

Örnekler arasında HSP'ye özgü SPINK2 geninin promotörü, eritroide özgü beta benzeri globin genlerinin güçlü enhancerlarını içeren lokus kontrol bölgesi ve NPP'ye özgü LYZ geninin yukarısında yer alan enhancerlar bulunmaktadır.

Lusiferaz raporlayıcı analizleri, EPP ve MPP'deki hücreye özgü MLV hedefli enhancer alt kümesini doğrulamıştır. Eritroide özgü MLV hedefli bölgeler, MPP'ye kıyasla EPP'de daha yüksek aktivite göstermiş ve tersi de geçerli olmuştur; bu durum, MLV'nin yakınlardaki genlerin ekspresyonunu muhtemelen kontrol eden hücreye özgü enhancer'ları tanımladığını doğrulamaktadır. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığında bir hafta içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, optimal entegrasyon bölgesi geri kazanımı için transduksiyon yapılmış hücrelerin sıklığını maksimize etmeyi hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, önce genomik DNA'yı ayarlayıp ardından genomik fragmanları bir DNA bağlayıcısı (linker) ile ligasyon yaparak, ardından konak genom viral eklemini LM PCR aracılığıyla amplifiye ederek ve son olarak amplikon kütüphanesini derin sekanslama ile analiz ederek viral entegrasyon bölgelerinin nasıl haritalandırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.