Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Bu prosedürün genel amacı, hücreye özgü düzenleyici bölgeleri tanımlamak için murin lösemi virüsünden türetilen retroviral vektörlerin entegrasyon bölgelerini haritalamaktır. Bu yöntem, gen terapisi ve gen düzenleme çalışmalarında, vektörün insan genomuna nerede entegre olduğu ve hangi düzenleyici unsurun belirli bir alt tip aracılığıyla aktif olarak kullanılabileceği gibi kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İlk olarak, gen terapisi çalışmalarında, MLV vektörlerinin aktif alt spesifik promotörlere ve arttırıcılara entegre olduğunu gözlemleyerek bu yöntem için fikir sahibi olduk.

Hedef hücreleri, EGFP raportör genini barındıran ve VSV-G veya amfitopik zarf glikoproteini ile psödotiplenmiş MLV'den türetilmiş bir retroviral vektör ile dönüştürerek başlayın. Sahte transdüksiyonlu hücreler negatif kontrol olarak kullanılır. Transdüksiyondan 48 saat sonra, numuneleri santrifüjleyin ve daha sonra yüzde iki fetal sığır serumu içeren 300 mikrolitre PBS'de 100.000 hücreyi yeniden süspanse edin.

Ardından, akış bölgesi metrik analizi ile EGFP ifadesini ölçün. Genomik DNA hazırlığı ve müteakip kısıtlama enzimi sindirimi için 0,5 ila beş milyon dönüştürülmüş hücre daha hasat edin. 1,5 mililitrelik tüplerde numune başına dört kısıtlama enzimi sindirimi ayarlayın.

Her tüpte 0.1 ila bir mikrogram G-DNA'yı sindirin. 10 mikrolitrelik bir son hacimde numune başına 10 birim TRU91 ve bir mikrolitre tampon M ekleyerek. Karışımın iki mikrolitresini sindirim tüplerine dağıtın.

Ve sonra reaksiyonları altı saat veya gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından 1,5 mililitrelik bir tüpe 40 mikrolitre su ekleyin. Aynı tüpte, numune başına 10 birim PST1 ve bir mikrolitre tampon H ekleyin.

Sindirim tüplerine 10 mikrolitre sindirim reaksiyonu karışımı dağıtın. Reaksiyonları altı saat veya gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 1.5 mililitrelik tüplerde sekiz bağlayıcı ligasyon reaksiyonu ayarlayın.

Her reaksiyon için, ligaz reaksiyon karışımını 10 mikrolitre sindirim genomik DNA'sına ekleyin. 16 santigrat derecede üç ila altı saat inkübe edin. İlk tur PCR için, 0,2 mililitrelik tüplerde 48 PCR reaksiyonu ayarlayın.

Her PCR için, bağlayıcı primer ve MLV3 prime LTR primeri içeren reaksiyon karışımını ligasyon reaksiyonunun iki mikrolitresine ekleyin. Numuneleri ısıtıcı kapaklı bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Döngü parametrelerini ayarlayın ve ilk tur PCR reaksiyonunu çalıştırın.

İkinci tur PCR için, bağlayıcı iç içe astar ve MLV3 prime LTR iç içe astar dahil olmak üzere reaksiyon karışımını ayarlayın. Ardından, şablon olarak ilk tur PCR'den iki mikrolitre PCR ürünü ekleyin. Ardından, nihai LN PCR ürünlerini oluşturmak için ikinci tur PCR reaksiyonunu çalıştırın.

İkinci tur PCR'den sonra, 48 iç içe LM PCR reaksiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe çekin. Ardından, havuzlanmış ve çökeltilmiş LM PCR ürününün 100 mikrolitresine 20 mikrolitre yükleme tamponu ekleyin. Ve numuneyi 100 baz çifti DNA merdiveni ile birlikte yüzde bir agaroz jel üzerine yükleyin.

Bantlar çözüldükten sonra jeli 30 ila 60 dakika boyunca santimetre başına beş voltta çalıştırın, 500 ila 150 baz çifti uzun amplikon içeren jelin oranını kesin. LM PCR ürününü kolon bazlı bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırdıktan sonra, kütüphane hazırlığına geçmeden önce bir UV spektrofotometresi kullanarak konsantrasyonu ölçün. Ayrıca, üreticinin talimatlarına göre bir biyoanalizör cihazı kullanarak LM PCR ürünlerinin uzunluğunu değerlendirin.

Bir indeksleme PCR ayarlayarak kitaplığı hazırlayın. Her PCR için, her numune için farklı indeks kombinasyonunda 150 ila 170 nanogram saflaştırılmış LM PCR ürünü kullanın. PCR'yi belirtildiği gibi ısıtmalı kapaklı bir termal döngüleyicide gerçekleştirin.

PCR'yi takiben, saflaştırılmış kütüphaneyi 10 milimolar tris HCL ile 10 nanomolar'a seyreltin. Daha sonra, beş mikrolitre seyreltilmiş havuzu beş mikrolitre 0.2 newton sodyum hidroksit ile yeni bir 1.5 mililitrelik tüpte karıştırın. Kısa bir süre girdaplayın, döndürün ve ardından kitaplıkları denatüre etmek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Denatüre havuz tüplerini buz ve 990 mikrolitre önceden soğutulmuş HT1 hibridizasyon tamponu üzerine yerleştirin. Daha sonra 300 mikrolitre denatüre havuzu 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe alın. Ve on pikomolar son kütüphane havuzu elde etmek için 300 mikrolitre önceden soğutulmuş HT1 ekleyin.

Paralel olarak, iki mikrolitrelik bir hacimde 10 nanomolar sabit kontrol kitaplığını 1.5 mililitrelik bir tüpte 3 mikrolitre 10 milimolar tris HCl ile karıştırın. Beş mikrolitre 0.2 newton sodyum hidroksit ekleyin ve kısaca girdaplayın. Döndürdükten sonra, seyreltilmiş fiksasyonu denatüre etmek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, tüpü buzun üzerine yerleştirin ve 990 mikrolitre önceden soğutulmuş HT1 ekleyin. Şimdi, 1.5 mililitrelik yeni bir tüpte 100 mikrolitre denatüre et ve 10 pikomolar nihai fiksasyon konsantrasyonu elde etmek için 300 mikrolitre önceden soğutulmuş HT1 ekleyin. Son olarak, 1,5 mililitrelik yeni bir tüpte, 510 mikrolitre denatüre kütüphane havuzunu 90 mikrolitre denatüre sabit kütüphane ile karıştırın, böylece sıralanacak %15 sabit kontrole sahip son 10 pikomolar havuz elde edin.

Bu görüntü, hematopoietik kök progenitör hücrelerde, eritroid progenitörlerde ve miyeloid progenitörlerde sırasıyla 3498, 2989 ve 4103 tekrarlayan MLV entegrasyon bölgelerinin analizini göstermektedir. Her hücre popülasyonunda, MLV kümelerinin %95'inden fazlası epigenetik olarak tanımlanmış arttırıcılar ve promotörlerle örtüşmüştür. Hücreye özgü MLV hedeflenen bölgeler yüksek oranda asetillendi ve hedeflenen genin hücreye özgü ekspresyonu ile ilişkilendirildi.

Örnekler, HSP'ye özgü SPINK2 geninin promotörüdür. Eritroid spesifik beta benzeri globin genlerinin güçlü arttırıcılarını içeren lokus kontrol bölgesi. NPP'ye özgü LYZ geninin yukarısında bulunan arttırıcılar.

Lusiferaz raportör testleri, EPP ve MPP'de hücreye özgü MLV hedefli arttırıcıların alt kümesini doğruladı. Eritroid spesifik MLV hedeflenen bölgeler, EPP'de MPP'den daha yüksek aktiviteye sahipti ve bunun tersi de geçerlidir, bu da MLV'nin muhtemelen yakındaki genlerin ekspresyonunu kontrol eden hücreye özgü arttırıcıları tanımladığını doğrulamaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa bir hafta içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, optimum entegrasyon bölgesi alımı için dönüştürülen hücrelerin frekansını en üst düzeye çıkarmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, önce genomik DNA'yı ayarlayarak, ardından genomik fragmanları bir DNA bağlayıcı ile bağlayarak, ardından konakçı genom viral bağlantısını LM PCR ile amplifiye ederek ve son olarak amplikon kütüphanesini derin dizileyerek viral entegrasyon bölgelerinin nasıl haritalanacağını iyi anlamış olmalısınız.