Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

Bu prosedürün genel amacı, DNA boyunca molekül transportunu incelemek için basit, sağlam ve yüksek verimli bir tek molekül akış germe testi oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle biotinlenmiş bir oligonun lambda-DNA'ya ligasyonu ile biotin işaretli lambda-DNA hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım ise, tek aşamalı bir reaksiyon protokolünü takip ederek Polietilen Glikol veya PEG fonksiyonelleştirilmiş lameller hazırlamaktır.

Ardından, önceden kesilmiş kanallara sahip çift taraflı bir bant, PEG fonksiyonelleştirilmiş bir lam ve giriş-çıkış delikleri içeren bir polidimetilsiloksan veya PDMS blok arasında sandviç yapılarak yüksek verimli bir akış hücresi oluşturulur. Son adım, zaman ayarlı Toplam İç Yansıma Floresans veya TIRF görüntüleme kullanılarak akış kanalındaki tekil floresan moleküllerin yörüngelerinin izlenmesidir. Akışla gerilmiş lambda-DNA boyunca difüze olan tekil moleküllerin yörüngelerini belirlemek için, ham floresans görüntülerini analiz etmek amacıyla güvenilir ve verimli, özel bir tek parçacık izleme yazılımı kullanılır.

Bu analiz konfigürasyonunun alternatiflere göre temel avantajları; lamel hazırlığının güvenilirliği, daha yüksek çıktı kapasitesi, örnek hazırlama için gereken manuel sürenin azalması ve daha optimize edilmiş denetimsiz veri analizidir. Prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Kan Xiong gerçekleştirecektir. Bu analize başlamadan önce, protokol metninde açıklandığı şekilde gerekli tüm reaktifleri hazırlayın.

0,5 mg/mL lambda-DNA stokunu 65 °C'de 60 saniye boyunca ısıtın ve hemen ıslak buza daldırın. Bir mikrosantrifüj tüpü içinde 100 µL lambda-DNA çözeltisini 2 µL 10 µM biotin işaretli oligo ile karıştırın. Karışımı 65 °C'de 60 saniye boyunca ısıtın ve ardından yavaşça oda sıcaklığına soğutun.

Karışımı buza yerleştirin. 11 µL T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu ekleyin ve nazikçe karıştırın. Ardından 800 unit'e eşdeğer iki µL T4 DNA ligaz ekleyin ve nazikçe karıştırın.

Karışımı iki saat boyunca 16 °C'de veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Ürünü, 100 kDa nominal molekül ağırlığı sınırına sahip santrifüj filtre tüpleri kullanarak saflaştırın. Bir numaralı lamel camları, bir boyama kavanozu içinde %95 etanol ile 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun ve ardından üç kez ultrapure su ile durulayın.

Boyama kabını bir molar potasyum hidroksit ile doldurun, tekrar 10 dakika boyunca sonikasyon uygulayın ve ardından üç kez ultrapure su ile durulayın. Bu döngüyü iki kez tekrarlayın. Lamel kapaklarını temiz, kuru azot gazı akışı altında kurutun.

900 millitorr basınçta beş dakika boyunca hava plazma işlemi uygulayarak lamelleri daha fazla temizleyin ve kurutun. Lamelleri, %95 etanolde çözünmüş 25 mg/mL silan-polietilen glikol-biyotin içeren 50 µL çözelti ile oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Fazla polietilen glikolü ultrapure su ile yıkayarak uzaklaştırın ve polietilen glikol kaplı lamelleri temiz kuru azot gazı akışı altında kurutun.

CAD yazılımı kullanarak akış kanallarını tasarlayın ve kanalları bir bant kesici yardımıyla çift taraflı bant üzerine kesin. Kanalların içindeki bant kalıntılarını temizleyin. PDMS plakalar hazırlamak için, bir karıştırıcı kullanarak 45 gram PDMS ile beş gram çapraz bağlayıcı reaktifi iyice karıştırın.

Karışımı iki adet 100 milimetrelik Petri kabına dökün ve tüm hava kabarcıkları gidene kadar kapları yaklaşık 30 dakika boyunca bir vakum odasında bekletin. PDMS katılaşana kadar kapları yaklaşık iki saat boyunca 80 derece santigrat derece bir fırında bırakın. Önceden kesilmiş kanallara sahip çift taraflı bandın boyutuyla eşleşen bir PDMS tabakası kesin.

Çift taraflı bandın koruyucu filmlerinden birini soyun ve PDMS bloğunun düz tarafına yapıştırın. 23 gauge iğneli bir biyopsi delgeç kullanarak PDMS bloğu üzerinde çıkış ve giriş delikleri açın. Çift taraflı bandın diğer koruyucu filmini soyun ve lamelin fonksiyonelleştirilmiş yüzeyine yapıştırın.

Montajı tamamlanmış akış hücresini bir mikroskop tablası aparatına sabitleyin. Önceden gazı alınmış tüm reaktifleri, bir solenoid valfe bağlı Tygon borusu ve reaktiflerin geri akışını önleyecek bir PEEK boruya bağlı başka bir boru bulunan rezervuarlara yükleyin. Reaktif akışı, bir betik programlama uygulaması tarafından kontrol edilen solenoid valflerle yönetilir.

Boş tampon akıtarak bir akış kanalını hazırlayın. Diğer üç PEEK borusunu giriş deliklerine yerleştirin. Kanal içerisinde hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

Çıkış deliğinden bir numune atık kabına, kısa bir PEEK tüp aracılığıyla Tygon tüp bağlayın. 0,2 mg/mL Streptavidin çözeltisi akıtın ve beş dakika inkübe edin. Ardından, bağlanmamış Streptavidin'i yıkayıp uzaklaştırmak için boş tampon akıtın.

1 mg/mL sığır serum albümin çözeltisi akıtın ve bir dakika boyunca inkübe edin. Ardından, bağlanmamış sığır serum albüminini yıkamak için boş tampon akıtın. 100 pM biotin-lambda-DNA çözeltisi akıtın ve 10 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, bağlanmamış lambda-DNA'larını yıkamak için boş tampon akıtın. PEG ile fonksiyonelleştirilmiş lamelin kalitesini kontrol etmek için SYTOX Orange boyası gibi bir DNA boyama boyası akıtın ve floresan görüntülemeye başlayın. Lamelin kalitesi iyiyse, akışla gerilmiş lambda-DNA'larının yoğunluğu yüksek olacaktır.

Ayrıca, neredeyse tamamen akışla gerilmiş lambda-DNA'larının görüntülerinde en yüksek sinyal-gürültü oranını elde etmek için TIRF açısını ayarlayın. Tek moleküllerin yörüngelerini izlemek için, inkübasyonlara yeni bir kanal içinde başlayın, ardından bir şırınga pompası kullanarak subnanomolar florofor işaretli molekülleri yeterince yüksek bir akış hızında kaynaştırın ve 100 Hertz kare hızıyla zaman serili floresan görüntüler toplayın. Tipik olarak, tek bir görüş alanında 10.000 kare toplanır ve birden fazla görüş alanından videolar alınır.

Son aşamada, DNA'ların hâlâ akışla gerilebildiğini doğrulamak için tekrar DNA boyama boyası akıtılır. DNA boyunca difüzyon gösteren tek moleküllerin yörüngelerini belirlemek için özel bir tek parçacık takip yazılımı kullanılacaktır. Yazılım, öncelikle tek parçacıkların merkez konumlarını yüksek doğrulukla belirleyecektir.

Örtü camı yüzeyine yapışmış olan partikülleri kaldırın ve ardından zamanlapse yörüngeleri oluşturmak için farklı karelerdeki partikülleri birbirine bağlayın. Bu yörüngelerden 1D difüzyon sabitleri tahmin edilecektir. Veri analizine başlamak için bir script programlama uygulaması açın ve tek partikül izleme yazılımının dizinine gidin.

largedataprocess3.m isimli bir betik açın. Tanımlanması gereken önemli bir parametre, tek parçacık saptama için eşik değeridir. Optimal eşik değerini belirlemek için determine_threshold_value'yu çalıştırın.

m betiği. Bu betik, eşik değerinin tekil partikül tespitini nasıl etkilediğini görselleştirecektir. Optimal eşik değerini belirledikten sonra, largedataprocess3 betiğini çalıştırın.

m betiği. Tek parçacık takip analizinin tamamlanmasının ardından, raw yörüngeler trajectory_filtering. m betiği çalıştırılarak filtrelenecektir.

Filtreleme adımını görselleştirmek için bir Grafik Kullanıcı Arayüzü (GUI) oluşturulmuştur. GUI panelinde, DNA boyunca minimum yer değiştirmeyi (MinXDisp) iki piksel olarak ayarlayın. DNA'ya dik maksimum yer değiştirmeyi (MaxYDisp) iki piksel olarak ayarlayın.

Minimum kare sayısını, minFrames, 10 olarak ayarlayın. Triplet için minimum durum sayısını, minTriplets, 10 olarak ayarlayın. DNA boyunca minimum difüzyon sabitini, D_par, sıfır olarak ayarlayın.

DNA'ya dik yöndeki maksimum tahmini difüzyon sabitini (D_trans), saniyede 10 mega baz çifti kare olarak ayarlayın. Minimum istatistik parametresini (Chi2 Stat), eksi beş olarak ayarlayın. DNA boyunca yer değiştirmenin DNA'ya dik yöndeki yer değiştirmeye oranının minimum değerini (MinX/Y), iki olarak ayarlayın.

Bu filtreleme parametrelerini karşılayan tüm ham yörüngeler tablo birde, karşılamayanlar ise tablo üçte listelenecektir. Tablo birdeki bir yörünge numarasına tıklayın. Yörünge, grafik bir ve ikide görüntülenecektir.

Ham floresan görüntülerini oynatmak için oynatma düğmesine tıklayın. Eğer bu izlek tek bir molekülün kayma izleği ise tablo2'ye ekle seçeneğine tıklayın. Sonunda, tablo2'ye eklenen tüm izlekler GUI kapatıldığında kaydedilecektir.

Tüm filtreleme adımlarından geçen yörüngeler, ortalama difüzyon sabitinin tahmin edileceği bir havuzda toplanır. Ortalama difüzyon sabitlerini hesaplamak için calculate_mean_diffusion_constant.m betiğini çalıştırmanız yeterlidir. Bu prosedür, in vitro tek molekül biyofiziği üzerine çalışan birçok araştırmacıya fayda sağlayacaktır.