Name: Peptid ve Protein miktar kullanarak otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Keşfedin, otomatik immuno-MALDI (iMALDI) teknolojisiyle karmaşık biyolojik sıvılarda peptid ve protein miktar tayini yapın. Bu hassas yöntem, erken teşhis ve tedavi takibi için düşük düzeyli biyobelirteçleri ölçmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Genom yenilikler ağ (cin) aracılığıyla mali destek genom Kanada ve genom British Columbia işlemleri (204PRO) ve teknoloji geliştirme (214PRO) için teşekkür ederiz. İlaç keşif platformu Araştırma Enstitüsü McGill Üniversitesi Sağlık Merkezi için filme MALDI-TOF enstrüman kullanımı için teşekkür ediyoruz. H.L. desteği Ulusal Bilim ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) bir doktora sonrası bursu dan minnettardır. C.H.B öncü bağış Fonu (LEEF) üzerinden destek için minnettar olduğunu. C.H.B. desteği (Montreal, Quebec, Kanada) McGill Üniversitesi'nde moleküler Onkoloji Segal McGill sandalyeden minnettardır. M.X.C. ve C.H.B. Yahudi Genel Hastanesi (Montreal, Quebec, Kanada) için Warren Y. Soper hayırsever güven ve Alvin Segal Aile Vakfı çekmek için minnettarız.

aşağıda açıklanan reaktifler miktarda 20 hasta plazma numuneleri ölçüm üzerinde temel alır. İletişim kuralı aşağıdaki Victoria Üniversitesi kuralları sunulan &#39; s insan araştırma Etik Komitesi.
 1. Ang üretimi ben insan plazma <ol><li>çözülme plazma numuneleri (&#8805; 200 µL) bir odada sıcaklık su banyo için 5 min ve örnekleri tamamen çözdürülen kadar buza koy.</li>
	<li>Transfer 200 µL el ile kuyu 1.1 mL derin-şey plaka (örnek plaka), ayrı ve 2 ° C ve 1278 x g. 10 dk santrifüj plaka santrifüj kapasitesi her plazma örneği</li>
	<li>Seri olarak tavuk yumurta akı albümin ile altı Kalibratör çözümleri hazırlamak için bir 500 fmol/µL Ang I NAT standart çözüm sulandırmak için sistem işleme bir otomatik sıvı kullanın (0,1 0,2 0,6, 1.9, 5,7, 17.2 fmol/µL).</li>
	Örnek plaka <li>pipet 200 µL her Kalibratör iyi ve 125 µL nesil için arabelleğe. 
	Not: Fosfat tamponlu tuz (PBS) arabelleği gerektiriyor denemenin gün taze hazırlanacak CEWA.</li>
	<li>Bir otomatik sıvı sistemi işleme kullanarak, yeni bir tabak içinde 125 µL plazma süpernatant karıştırmak ya da PBS CEWA 125 µL Ang 25 µL ile ben 1 M Tris, 0.2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ve 1 mM içerir üretimi arabellek phenylmethylsulfonyl florür (PMSF). 
	Not: Ang hazırlamak ben bir 1 M Tris/0.2 mM EDTA sulu tampon karıştırma tarafından üretimi arabellek (pH 5.5 ayarlamak Asetik asit kullanarak) ve PMSF çözüm (metanol içinde 100 mM). 4 ° C. Mix iki çözümleri de 1 ay deneme günü için her iki çözüm de depolanması.</li>
	<li>Otomatik olarak çözümler bir 96-şey plaka, çözüm başına 3 çoğaltır, iyi başına 34 µL içine aktarın. Plaka için 3 h. 37 ° C'de kuluçkaya</li>
</ol> 2. IMMUNO-Ang zenginlik ben kullanarak antikor kaplı boncuk <ol><li>antikor manyetik Protein G boncuklar üzerine konjugasyon Not: Boncuk ile antikor konjugasyon el ile 3 h sırasında Ang gerçekleştirilen ben üretimi dönemi denemenin gün. Diğer analitler için konjuge boncuk %0,015 arkadaşlar (PBSC) 4 ° C'de 3 ay veya daha uzun, özellikleri ve sağlamlık-in antikor bağlı olarak içeren PBS arabellek depolanması mümkün olabilir.
	<ol><li>Transfer 110 µL boncuk Bulamaç (20 örnekleri ölçme ve 6 puntoluk standart eğri yapmak için yeterli), 1,5 mL tüp içine. Boncuk yedi kez % 25 Asetonitril/PBSC 1 mL ile üç kez PBSC 1 mL ile yıkayın. Her yıkama adım arasında boncuk cips için manyetik bir stand kullanın. Sonra son yıkama yıkama arabellek kaldırma 
		Not: 7 kez % 25 ile yıkama Asetonitril/PBSC ara-20 gibi boncuk Bulamaç MS-uyumsuz katkı maddeleri kaldırmak için önemlidir. Seçili boncuk böyle katkısız iseniz, bu geniş çamaşır adım gerekli olmayabilir.</li>
		<li>Boncuk PBSC 110 µL içinde resuspend ve anti-Ang 110 µL ekleyin ben antikor (son antikor konsantrasyon: 100 µg/mL). Boncuk ve çözüm pipetting tarafından mix ve onları 1s 8 rpm'de dönen için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>3 kez ile 1 mL PBSC boncuk yıkama ve PBSC 1100 µL içinde resuspend. 
		Not: herhangi bir boncuk çözüm tüp kap kuluçka sırasında aktı, benchtop santrifüj 2680 x g. kullanarak çözüm aşağı spin</li>
		<li>Boncuk çözüm el 96-şey plaka (Boncuk standart plaka) aktarın. Aliquot sisteme aynı 96-şey plaka başına iyi. 120 µL boncuk işleme otomatik sıvı kullanın</li></ol></li> <li>IMMUNO-zenginleştirme boncukları üzerinde <ol><li>3 h Ang ben üretimi dönemi, yerleştirdikten sonra kuluçka plaka buz Ang ı. nesil sonlandırmak 10 dk</li>
		<li>Otomatik olarak 100-fold SIS peptid hisse senedi çözüm (10 pmol/μL) seyreltik PBS ile tampon ve otomatik olarak daha fazla aliquot bir 96-şey PCR plakasına istikrarlı isoptope standart peptid seyreltme. (100 fmol içeren) bir çözümün kararlı izotop standartları (SIS) peptid 1,5 µL kuluçka plaka her kuyunun içine aktarmak ve plazma numuneleri veya PBS arabelleklerindeki CEWA ile karıştırarak.</li>
		<li>Otomatik olarak boncuk çözüm, 10 mL başına iyi kuluçka plaka içeriğini aktarmak, mix.</li>
		<li>4 ° c için 1 h plaka 8 rpm'de dönen kuluçkaya.</li>
		<li>Boncuk üç kez otomatik olarak 5 mM amonyum bikarbonat (AmBic) çözümü, iyi yıkama başına başına 100 µL ile yıkayın. Son yıkama sonra 5 mm AmBic çözüm her şey içinde 7 µL boncuk resuspend. Boncuk son yıkama sonra altına çekmek için bir mıknatıs kullanın</li>
	</ol></li></ol> 3. Transfer bir maldı hedef plaka ve matris çözüm ekleme üzerine boncuk <ol><li>otomatik olarak bir maldı hedef plaka üzerine boncuk Bulamaç Aktarım 7 µL 2.600 spot büyüklüğü µm. Boncuk kurumasına izin. 
	Not: Küçük USB-yeti hayranı boncuk kurutma işlemi hızlandırmak için kullanılabilir.</li>
	<li>Otomatik olarak α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (HCCA) 2 µL Ekle-matris çözümden (3 mg/mL HCCA, 1.8 mg/mL amonyum sitrat, % 70 Asetonitril ve % 0.1 trifluoroacetic asit içeren) her örnek hedef plaka üzerinde spot üzerine de matris .</li>
</ol> 4. Sinyal alma bir MALDI-TOF-MS ve veri analizi <ol><li>analiz örnek noktalar olumlu reflektör modunu kullanarak bir MALDI-TOF aleti ile. İç kalibrasyon, veri düzeltme ve temel çıkarma satıcıya özel yazılım ile otomatik olarak gerçekleştirmek. 
	Not: MALDI-TOF ölçüm hedef peptidler veya protein bağlıdır için seçilen modu (pozitif/negatif, doğrusal/reflektör).</li>
	<li>(Nat/SIS yoğunluğu oranı) göreli yanıt oranını hesaplamak ve her örnek konsantrasyonu belirlemek Ang için standart eğri karşılaştırın. Denklem (1), nerede kullanarak PRA hesaplamak Δt Ang ben üretimi Ang ı. oluşturulmasında kullanılan süreyi temsil eder 
	PRA = [Ang ben] / Δt Ang ben üretimi (1)</li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li>
<li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Chemical+Genomics+and+Proteomics%3A+Reviews+and+Protocols%22">Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols</a>. Zanders, E. D. , Humana Press. 227-240 (2012).</li>
<li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI%2FTOF-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li>
<li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li>
<li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li>
<li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li>
<li>Razavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+SISCAPA+Quantitation+of+Peptides+from+Human+Plasma+Digests+by+Ultrafast%2C+Liquid+Chromatography-Free+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).</li>
<li>Anderson, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SISCAPA+Peptide+Enrichment+on+Magnetic+Beads+Using+an+In-line+Bead+Trap+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).</li>
<li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li>
<li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+%28iMALDI%29+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li>
<li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li>
<li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+%28iMALDI%29+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20(2013).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+EGFR+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li>
<li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+chimica+acta%22%5BJournal%5D)">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li>
<li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+%28iMALDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li>
<li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , US 7846748 B2 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , CA 2507864 C (2011).</li>
<li>Weiß, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li>
<li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+fragments%3A+Hope+and+hype%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS%3A+PCSK9+as+an+example+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li>
</ol>

C.H.B patent iMALDI teknoloji üzerinde tutar.

Geleneksel MS tabanlı protein miktar için karşılaştırıldığında, iMALDI analitler zenginleştirmek ve onları karmaşık örnekleri, bu nedenle proteinler veya düşük konsantrasyonlarda peptidler ölçmek mümkün hale gelen arındırmak için antikorlar kullanır. İMALDI Protokolü kritik bir adımda hedef peptidler immün zenginlik olduğunu. Bu amaçla, antikorlar yüksek özgüllük ve ilgi ile seçilmesi gerekir. SISCAPA, 10-9 M veya daha iyi, antikor benzeşim düşük ng/mL21yüksek hassasiyet elde etmek için...

Kütle spektrometresi nicel proteomik içinde vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Kütle spektrometresi hedef proteinler veya peptidler kitlelerin belirlemek için bu nedenle elde edilen analit sinyalleri uzun için karşılaştırıldığında çok özel olabilir. İki iyonlaşma yöntemleri, electrospray ve maldı, en çok1,2,3,4proteinler ve peptidler algılamak için kullanılır. Düşük-bereket proteinler yüksek-bereket proteinler huzurunda ng/mL veya pg/mL konsantrasyonlarda karmaşık örneklerinde tespiti MS tabanlı protein miktar içinde büyük bir sorun yatıyor ve insan plazmada bulunan birçok aday protein biyolojik vardır Bu aralığı5içinde. Bu sorun büyük ölçüde doğal olarak geniş dinamik alan ve insan Proteom6karmaşıklığı tarafından nedeniyle oluşur.
Bu algılama zorlukları aşmak için IMMUNO-MS yöntemleri hedef proteinler veya katı bir yüzeye örnek çözümlerinden peptidler zenginleştirmek için geliştirilmiştir analitler ve MS ölçüm7,8 elüsyon tarafından takip , 9 , 10. IMMUNO-zenginleştirme karmaşık örnekleri analitler saflaştırılmış ve bu nedenle diğer molekülleri iyon-bastırma etkilerinden en aza indirilir. Sahip oldukları yüksek antikor Bağlama kapasitesi avantajları ve kullanım kolaylığı gibi çeşitli katı destekler arasında manyetik boncuklar şu anda en yaygın olarak kullanılmaktadır. Farklı functionalizations ve boyutları ile manyetik boncuklar geliştirilen ve immunoprecipitation deneyler için ticari. Bugüne kadar IMMUNO-zenginleştirme boncuk üzerinde electrospray iyonlaşma (ESI) ve maldı-MS ile protein ve peptid ölçüm için sızdı. Kararlı izotop standartları ve yakalama tarafından Anti-peptid antikorlar (SISCAPA) teknolojisi, kuluçka antikor kaplı boncuk IMMUNO-zenginleştirme ile takip örnekleri proteinleri sindirmek. "Klasik" SISCAPA içinde ele geçirilen proteotypic peptidler boncuk eluted ve tarafından sıvı Kromatografi-ESI-MS (LC-MS) veya doğrudan infüzyon ESI-çoklu tepki izleme-MS (ESI-MRM-MS)11,12tarafından ölçülür. IMMUNO-zenginleştirme MRM tahlil duyarlılığı düşük ng/mL Aralık13ulaşan 3-4 büyüklük, geliştirilmiş.
Electrospray-MS için karşılaştırıldığında, maldı-MS daha hızlı ve böylece hiçbir ertelenmiş ve kirlenme sorunları, temizlik ve LC sütunların yeniden denge yüksek üretilen iş çalışmaları14için daha uygun hale anlamına gelmez. IMMUNO-maldı teknoloji bizim laboratuvar IMMUNO-zenginleştirme maldı-MS ile hassas ve belirli miktar peptidler ve proteinler (proteotypic peptidler Nefelometri üzerinde dayalı) için birleştirmek için geliştirilen15,16 ,17. IMMUNO-zenginleştirme sonra boncuk maldı hedef tabağa yatırılır, matris çözüm için boncuk eklenir ve plaka kuruduktan sonra bir MALDI-TOF-Bayan göre analiz için hazırdır. Boncuk üzerinden peptidler elüsyon ayrı bir adım olarak gerçekleştirilir, ancak böylece numune hazırlama basitleştirilmesi ve örnek kaybını en aza boncuk noktalarına eklendiğinde benzeşme bağlı analitler maldı matris çözüm tarafından eluted. İMALDI teknoloji uygulamaları18,19, çeşitli uygulanan ve son zamanlarda edilmiş otomatik ve anjiyotensin ölçmek için kullanılan ben (Ang ben) plazma renin aktivitesi (PRA)20belirlemek için. Bu iletişim kuralı bir otomatik iMALDI tahlil gerçekleştirmek için kullanılan yordam gösterecektir. Örnek olarak, daha az % 10 arası gün CVs PRA tahlil alarak sağlanmıştır edildi 744 örnek gün20/ ölçme yeteneği ile otomasyon yoluyla.
Bu el yazması gösterdi iMALDI PRA tahlil hedef molekül olarak protein sindirimi gerektirmez (Ang ben) bir peptid 1295.7 Da Moleküler ağırlığı olduğunu. Diğer deneyleri içinde nerede protein sindirimi gereklidir ve bir peptid için olduğu gibi protein vekil olarak kullanılır, eşsiz ve bunun c kolayca ayırt edilebilir böylece 800 Da üzerinde bir kitle ile hedef protein iMALDI için seçili peptid olmalıdır Hemical gürültü maldı matris çözümden. Anti-peptid antikorlar peptidler IMMUNO-zenginleştirme için gereklidir. İletişim kuralı PRA ölçme bir iMALDI tahlil için dört adımlardan oluşur: 1) Ang nesil ben insan plazma; 2) IMMUNO-zenginleştirme Ang I istimal boncuk antikor kaplı; 3) boncuk bir maldı hedef plaka ve transfer ekleyerek matris çözüm; ve 4) sinyal Alım bir MALDI-TOF-MS ve veri analizi20tarafından.

<table><tbody><tr><td>Sağlıklı kontrol insan</td><td>plazması Biyoıslah</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum sitrat dibazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (> =% 98)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk yumurtası beyazından albümin (% >98)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-siyano-4-hidroksisinnamik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>LC-MS sınıfı</td></tr><tr><td>asetonitril</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>LC-MS sınıfı</td></tr><tr><td>su</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td>LC-MS sınıfı</td></tr><tr><td>asetik asit</td><td>Fluka</td><td>320099</td><td>LC-MS sınıfı</td></tr><tr><td>Tris(hidroksimetil)aminometan</td><td>Roche Teşhis</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G manyetik boncuklar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &mu; m, 30 mg / mL</td></tr><tr><td>anti-Ang I keçi poliklonal antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat ve SIS Ang I,</td><td>Victoria Üniversitesi-Genome BC Proteomik Merkezi'nde</td><td></td><td></td>sentezlendi</tr><tr><td>Otomatik sıvı işleme sistemi</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Agilent Bravo robotik iş istasyonu</td></tr><tr><td>Mıknatıs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Invitrogen DynaMag-2 mıknatıs</td></tr><tr><td>Tüp döndürücü</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Labquake Tüp Döndürücü</td></tr><tr><td>Mıknatıs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 yan etekli mıknatıs</td></tr><tr><td>Mıknatıs</td><td>VP Scientific</td><td>771RM-1</td>, <td>boncukları kuyunun dibine çekmek için kullanılır</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker Bruker</td><td></td><td>Microflex LRF cihazı</td></tr></tbody></table>

peptid ve protein miktar kullanarak otomatik immuno-maldı (imaldi)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Kütle spektrometresi (MS) her hedef molekül kütlesi ücret oranı doğrudan tespiti sonucunda mükemmel tahlil özgüllük ile karmaşık örnekleri, protein miktarının için en sık kullanılan teknolojileri biridir. Ancak, çoğu diğer analitik teknikler gibi MS tabanlı proteomik yüksek-bereket analitler ölçme doğru bir önyargı var, elde etmek zor bu yüzden düşük ng/mL algılama sınırlar veya pg/mL karmaşık örnekleri ve bu konsantrasyon aralığın çoğu için biofluids insan plazma gibi hastalık ilgili proteinleri verdik. Düşük-bereket analitler algılama içinde yardımcı olmak için IMMUNO-zenginleştirme konsantre ve MS ölçüm, önemli ölçüde tahlil duyarlılık geliştirmek önce analit arındırmak için tahlil içine entegre edilmiştir. Bu çalışmada, IMMUNO - Matrix-Assisted lazer desorpsiyon/iyonlaşma (iMALDI) teknoloji proteinlerin ve peptidler biofluids içinde miktar için sunulan, IMMUNO-zenginleştirme boncuk üzerinde temel alan, maldı-MS ölçüm öncesinde elüsyon olmadan izledi. Anti-peptid antikorlar manyetik boncuklar functionalized ve örnekleri ile inkübe. Sonra yıkama, boncuk doğrudan bir maldı hedef tabağa aktarılır ve matris çözüm için boncuk uygulandıktan sonra sinyalleri tarafından uçuş (MALDI-TOF) enstrümanın bir maldı-zaman ölçülür. Diğer IMMUNO-MS deneyleri için karşılaştırıldığında örnek hazırlama prosedürü Basitleştirilmiş ve maldı ölçüm hızlıdır. Bütün numune hazırlama sistemi, geliştirilmiş tahlil tekrarlanabilirlik ve yüksek işlem hacmi ile işleme bir sıvı ile otomatik olarak gerçekleşir. Bu makalede, iMALDI tahlil peptid anjiyotensin belirlemek için kullanılır ben (Ang ben) konsantrasyon plazma, plazma renin aktivitesi okuma birincil aldosteronism (PA) tarama için klinik olarak kullanılır.

Ang ölçmek için bir otomatik iMALDI yordam ben şekil 1' de gösterilen. Hedef peptidler (endojen peptidler veya peptidler sindirilir proteinler üzerinden) Anti-peptid manyetik boncuklar zenginleştirilmiş ve sonra boncuk maldı ölçüm için bir hedef tabak aktarılır. Tüm prosedürü ek peptid elüsyon adım gerektiren diğer IMMUNO-MS teknolojileri ile karşılaştırıldığında basitleştirilmiştir. Otomasyon iMALDI tahlil örnekleri, çok sayıda varyasyon (CV) altında % 10 <s...

Otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI) teknolojisini kullanarak karmaşık biyolojik sıvı protein miktar için bir protokol sunulmuştur.

Peptid ve Protein miktar kullanarak otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Bu otomatik immüno-MALDI analizinin genel amacı, karmaşık biyolojik sıvılardaki peptitleri ve bozulmamış proteinleri doğru ve hassas bir şekilde nicelleştirmektir. Bu yöntem, tanı koymak veya bir hastanın tedaviye verdiği yanıtı izlemek için protein seviyelerini nicelleştirmek gibi, kantitatif proteomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, karmaşık örneklerdeki protein seviyelerini çok hassas ve doğru bir şekilde nicelleştirebilmesidir.Analizin immüno-zenginleştirme adımı düşük bolluktaki protein ve peptid biyobelirteçlerin miktar tayinine olanak tanıdığı için bu teknik, hastalıkların erken evrede teşhis edilmesini sağlar. Bu yöntem plazma renin aktivitesi hakkında bilgi sağlayabilse de, prognoz, teşhis ve tedavi yönetimi için kanserle ilişkili proteinlerin miktar tayini gibi hastalıkla ilgili diğer çalışmalara da uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, insan plazma örneklerini oda sıcaklığındaki bir su banyosunda beş dakika boyunca çözdürün.Ardından, numuneleri tamamen çözülene kadar buz üzerinde bekletin. Sonrasında, her bir plazma numunesinin 200 µL'sini 1,1 mL'lik derin kuyucuklu bir plakadaki ayrı kuyucuklara manuel olarak aktarın. Plakayı 2 °C'de 3.000 rpm'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, tavuk yumurtası beyazı albümini ile altı kalibratör çözelti hazırlamak için Bravo'yu kullanarak 500 femtomole per microliter Ang-1 NAT standart çözeltisini seri olarak dilüye edin. Santrifüjasyonun ardından, her bir kalibratörden 200 microliters'ı bir kuyucuğa ve 125 microliters jenerasyon tamponunu örnek plakasına pipetleyin. Otomatik bir sıvı taşıma sistemi kullanarak, yeni bir 1.1 milliliter derin kuyucuk plakasında 125 microliters plazma süpernatanını veya 125 microliters tavuk yumurtası beyazı albümin çözeltisini 25 microliters angiotensin I jenerasyon tamponu ile karıştırın.Şimdi, çözeltileri her çözeltiden üç tekrar olacak şekilde ve kuyuk başına 34 µL çözelti gelecek şekilde otomatik olarak 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Ardından, plağı 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Antikorun protein G boncuklarıyla konjugasyonu için, önceden hazırlanmış boncuk süspansiyonundan 78 µL'yi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.Boncukları, her yıkama arasında boncukları çöktürmek için bir manyetik stant kullanarak, PBSC içinde %25 asetonitril ile yedi kez bir mililitre ile ve üç kez bir mililitre PBSC ile yıkayın. Boncukları yıkadıktan sonra, onları 110 mikrolitre PBSC içinde yeniden süspande edin ve 110 mikrolitre anti-anjiyotensin I antikoru ekleyin. Boncukları ve çözeltiyi pipetleyerek karıştırın.Ardından, boncukları oda sıcaklığında, sekiz rpm hızında döndürerek bir saat boyunca inkübe edin. Bunun ardından, boncukları üç kez bir mililitre PBSC ile yıkayın. Daha sonra, boncukları 1.100 mikrolitre PBSC içinde yeniden süspande edin.Şimdi, boncuk çözeltisini manuel olarak 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Ardından, Bravo'ya boncukları aynı 96 kuyucuklu plakaya paylaştırtın. Üç saatlik anjiyotensin I üretim süresinden sonra, anjiyotensin I üretimini sonlandırmak için inkübasyon plakasını 10 dakika boyunca buza yerleştirin. Kararlı izotop standartları peptit stok çözeltisini PBS tamponu ile otomatik olarak 100 kat seyreltin.Ardından, stabil izotop standart peptid seyreltisini otomatik olarak 96 kuyucuklu bir PCR plakasına paylaştırın. Seyreltilmiş peptid çözeltisinden 10 µL'yi inkübasyon plakasının her bir kuyucuğuna aktarın. Seyreltilmiş peptid çözeltisini plazma örnekleri veya tavuk yumurtası akı albümin çözeltisi ile karıştırın.Numune veya standart çözeltilerini otomatik olarak boncuk çözeltileriyle birlikte inkübasyon plakasına ekleyin ve karıştırın. Bir saatlik inkübasyonun ardından, boncukları beş milimolar amonyum bikarbonat çözeltisi ile otomatik olarak üç kez yıkayın. Her yıkamanın ardından boncukları tabana çekmek için bir mıknatıs kullanın.Son yıkamadan sonra, boncukları yeniden süspanse etmek için her bir kuyuya 10 µL amonyum bikarbonat çözeltisi ekleyin. Boncuk süspansiyonunun 7 µL'sini, 2.600 µm spot boyutuna sahip bir MALDI hedef plakasına otomatik olarak aktarın. Boncuklar kuruduğunda, matris kuyusundan önceden hazırlanmış 2 µL HCCA matris çözeltisini hedef plaka üzerindeki her bir örnek noktasına otomatik olarak ekleyin.Bunun ardından, örnek noktalarını pozitif reflektör modunda bir MALDI-TOF cihazı ile analiz edin. Satıcıya özel yazılımı kullanarak dahili kalibrasyon, veri düzleştirme ve taban çizgisi çıkarma işlemlerini gerçekleştirin. Angiotensin I ölçümü için kullanılan otomatik iMALDI prosedürü, %10'un altında bir gün içi varyasyon katsayısı ile çok sayıda örneğin yüksek kapasiteli analizine olanak tanır. İnsan plazma örneklerinde angiotensin I ölçümü ile elde edilen temsili spektrumlar burada gösterilmektedir.Otomatik iMALDI analizi ile elde edilen 188 hasta örneğine ait PRA değerleri ile klinik bir LC-MS/MS prosedürü kullanılarak elde edilen PRA değerlerinin korelasyonu burada gösterilmektedir. İki yöntemin korelasyon katsayısı 0,98'dir ve eğimler arasındaki fark, farklı internal standartların veya farklı antikorların kullanımından kaynaklanıyor olabilir. Analizin doğrusal aralığı ve analiz hassasiyeti burada sunulmuştur.Bu teknik uzmanlaşıldığında, yaklaşık beş saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, uç başlığının ve sıvı aktarım hızının uygun şekilde ayarlandığından emin olun. Bu prosedürün ardından, oral tuz yüklemesi veya salin infüzyon testleri dahil olmak üzere, hastalarda primer aldosteronizmi doğrulamak için ek yöntemler kullanılabilir.Otomatik iMALDI tekniği, hasta örnekleri dahil olmak üzere biyolojik örneklerin hastalıkla ilişkili proteinler veya peptitler için spesifik ve doğru yüksek kapasiteli kantitatif taramasını sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometrisi tabanlı protein ve peptit kantifikasyonu için otomatik bir iMALDI deneyi nasıl gerçekleştirilir konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İnsan plazması gibi biyolojik örneklerle çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu ve prosedür gerçekleştirilirken gerekli güvenlik önlemlerinin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

peptide-and-protein-quantification-using-automated-immuno-maldi-imaldi

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Kararlı İzotop Standartlar ve Anti-Peptid Antikorlar (SISCAPA) kendi proteinler için vekilleri olarak peptidler kantitatif ölçüm sağlamak için kararlı izotop dilüsyon kütle spektrometresi (MRM-MS) ile peptitler çiftler yakınlık zenginleştirme yakalayın. Burada kısmen otomatik bir biçimde manyetik parçacıklar kullanarak protokol açıklar.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

Bu, insan serumu ile düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptitler selektif geri kazanımı için gözenekli silis ince film dayanan bir teknoloji geliştirilmiştir. Bizim gözenekli cips fiziko-kimyasal özellikleri ince peptid zenginleştirme önemli kontrolü sağlamak ve sonuçta tanısal amaçlı serum proteom profil ayarlı edildi.

Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Bu protokol, seçilen reaksiyon izleme kullanılarak karmaşık biyolojik numuneler içindeki hedef proteinlerin mutlak miktar tayini testlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Fare makrofaj kemotaksisi sinyal yolunun proteinlerini doğru bir şekilde ölçmek için kullanıldı. Hedef peptit seçimi, tahlil geliştirme ve kalitatif ve kantitatif tahliller ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Burada, yüksek çözünürlüklü (~ 30.000) MS-algılama, peptid parçacıkları Monoklonal antikor çivili peptid standartları miktar için ardından peptid öncüleri iyon hareketlilik ayrılması ile birleştiğinde bir Kromatografik tahlil açıklamak Özet.

Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar

Nicel immunoblotting ayirt Histoloji formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi bir protein miktarının aracı olarak görüntü analizi ile birleştiğinde doğrulamak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bizim sonuçlar biyomarker proteinler rutin biyopsi örneklerinde göreli miktarı ascertaining için ayirt Histoloji yarar gösterilmektedir.

Hücre hatları nicel Immunoblotting ayirt rutin doku örneklerinde biyomarker protein miktarının için doğrulamak için standart olarak

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT), mevcut izobarik etiketlerle eş zamanlı olarak analiz edilebilen numune sayısını artırabilen gelişmiş bir numune çoklama stratejisidir. Robotik bir platformun dahil edilmesi deneysel iş bilgililiği, tekrarlanabilirliği ve nicel doğruluğu büyük ölçüde artırmıştır.

Kombine Öncül İzotopik Etiketleme ve İzobarik Etiketleme (cPILOT) kullanılarak Otomatik Numune Çoklama

Burada, MHC sınıf I ve sınıf II peptit komplekslerinin yüksek kaliteli immünopeptidomik veriler sağlayan fare ve insan hücre çizgilerinden arındırılması için bir protokol sunuyoruz. Protokol, piyasada bulunan antikorları kullanarak numune hazırlamaya odaklanır.

İmmünopeptidomik: Kütle Spektrometresi Analizi için Fare ve İnsan MHC Sınıfı I ve II İlişkili Peptitlerin İzolasyonu

Burada, çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyi proteomunun karakterizasyonu için bir proteomik iş akışını açıklıyoruz. Bu iş akışı, hücre yüzeyi proteini zenginleştirmeyi, müteakip numune hazırlamayı, bir LC-MS/MS platformu kullanarak analizi ve özel yazılımla veri işlemeyi içerir.

Hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için "hücre yüzeyi yakalama" iş akışı

Keşfedin, otomatik immuno-MALDI (iMALDI) teknolojisiyle karmaşık biyolojik sıvılarda peptid ve protein miktar tayini yapın. Bu hassas yöntem, erken teşhis ve tedavi takibi için düşük düzeyli biyobelirteçleri ölçmenizi sağlar.

Peptid ve Protein miktar kullanarak otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI)

Daha fazla video keşfet