Peptid ve Protein miktar kullanarak otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI)

Bu otomatik immüno-MALDI testinin genel amacı, karmaşık biyolojik sıvılardaki peptitleri ve bozulmamış proteinleri doğru ve hassas bir şekilde ölçmektir. Bu yöntem, teşhis için protein seviyelerinin ölçülmesi veya bir hastanın tedaviye yanıtının izlenmesi gibi kantitatif proteomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin en önemli avantajı, karmaşık numunelerden protein seviyelerini çok hassas ve doğru bir şekilde ölçebilmesidir.

Bu teknik, hastalıkların erken bir aşamada teşhisine izin verir, çünkü testin immüno-zenginleştirme adımı, düşük miktarda protein ve peptit biyobelirteçlerinin kantitasyonuna izin verir. Bu yöntem plazma renin aktivitesi hakkında bilgi sağlayabilse de, prognoz, tanı ve tedavi yönetimi için kanserle ilişkili proteinlerin miktarının belirlenmesi gibi hastalıkla ilgili diğer çalışmalara da uygulanabilir. Bu işleme başlamak için, insan plazma örneklerini oda sıcaklığındaki bir su banyosunda beş dakika boyunca çözdürün.

Ardından, numuneleri tamamen çözülene kadar buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, her bir plazma örneğinin 200 mikrolitresini 1.1 mililitre derinliğinde bir kuyu plakasının ayrı oyuklarına manuel olarak aktarın. Plakayı iki santigrat derece ve 3.000 rpm'de 10 dakika santrifüjleyin.

Ardından, tavuk yumurtası akı albümini ile altı kalibratör çözeltisi hazırlamak için mikrolitre Ang-500 NAT standart çözeltisi başına 1 femtomol'ü seri olarak seyreltmek için Bravo'yu kullanın. Santrifüjlemeyi takiben, her bir kalibratörden 200 mikrolitreyi bir kuyuya ve 125 mikrolitre üretim tamponunu numune plakasına pipetleyin. Otomatik bir sıvı işleme sistemi kullanarak, 125 mikrolitre plazma süpernatanı veya 125 mikrolitre tavuk yumurtası akı albümin çözeltisini 25 mikrolitre anjiyotensin I nesil tamponu ile yeni bir 1.1 mililitre derin kuyu plakasında karıştırın.

Şimdi, çözeltileri, çözelti başına üç kopya ve oyuk başına 34 mikrolitre çözelti içeren 96 oyuklu bir plakaya otomatik olarak aktarın. Ardından, plakayı üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Antikorun protein G boncukları ile konjugasyonu için, önce 78 mikrolitre önceden hazırlanmış boncuk bulamacını 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Boncukları PBSC'de bir mililitre %25 asetonitril ile yedi kez ve bir mililitre PBSC ile üç kez yıkayın, her yıkama arasında boncukları peletlemek için manyetik bir stand kullanın. Boncukları yıkadıktan sonra, 110 mikrolitre PBSC içinde tekrar süspanse edin ve 110 mikrolitre anti-anjiyotensin I antikoru ekleyin. Boncukları ve çözeltiyi pipetleyerek karıştırın.

Ardından, boncukları sekiz rpm'de döndürürken oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bunu takiben, boncukları bir mililitre PBSC ile üç kez yıkayın. Ardından, boncukları 1.100 mikrolitre PBSC'de tekrar süspanse edin.

Şimdi, boncuk çözeltisini manuel olarak 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Ardından, Bravo'nun boncukları aynı 96 oyuklu plakaya almasını sağlayın. Üç saatlik anjiyotensin I üretim periyodundan sonra, anjiyotensin I oluşumunu sonlandırmak için inkübasyon plakasını 10 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.

Ayrıca, kararlı izotop standart peptit seyreltmesini 96 oyuklu bir PCR plakasına otomatik olarak alikotlayın. Seyreltilmiş peptit çözeltisinin 10 mikrolitresini inkübasyon plakasının her bir oyuğuna aktarın. Seyreltilmiş peptit çözeltisini plazma örnekleri veya tavuk yumurtası akı albümin çözeltisi ile karıştırın.

Boncuk çözeltilerine numune veya standart çözeltileri otomatik olarak inkübasyon plakasına ekleyin ve karıştırın. Bir saat inkübe edildikten sonra, boncukları otomatik olarak üç kez beş milimolar amonyum bikarbonat çözeltisi ile yıkayın. Her yıkamadan sonra boncukları dibe çekmek için bir mıknatıs kullanın.

Son yıkamadan sonra, boncukları yeniden süspanse etmek için her bir oyuğa 10 mikrolitre amonyum bikarbonat çözeltisi ekleyin. Boncuk bulamacının yedi mikrolitresini otomatik olarak 2.600 mikrometre spot boyutuna sahip bir MALDI hedef plakasına aktarın. Boncuklar kuruduktan sonra, matris kuyucuğundan önceden hazırlanmış iki mikrolitre HCCA matris çözeltisini hedef plakadaki her bir numune noktasına otomatik olarak ekleyin.

Bunu takiben, pozitif reflektör modunu kullanarak bir MALDI-TOF cihazı ile numune noktalarını analiz edin. Satıcıya özel yazılımla dahili kalibrasyon, veri yumuşatma ve temel çıkarma işlemleri gerçekleştirin. Anjiyotensin I'i ölçmek için otomatik iMALDI prosedürü, gün içi varyasyon katsayısı %10'un altında olan çok sayıda numunenin yüksek verimli analizine izin verir. İnsan plazma numunelerinde anjiyotensin I'in ölçülmesiyle elde edilen temsili spektrumlar burada gösterilmektedir.

Otomatik iMALDI testi ile elde edilen 188 hasta örneğinden alınan PRA değerlerinin klinik LC-MS/MS prosedürü kullanılarak elde edilen PRA değerleri ile korelasyonu burada gösterilmektedir. İki yöntemin korelasyon katsayısı 0.98'dir ve eğimler arasındaki fark, farklı iç standartların veya farklı antikorların kullanılmasından kaynaklanıyor olabilir. Testin doğrusal aralığı ve tahlil hassasiyeti burada görüntülenir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık beş saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, uç başını ve sıvı işleme hızını uygun şekilde ayarlamayı unutmayın. Bu prosedürden sonra, oral tuz yüklemesi veya salin infüzyon testleri dahil olmak üzere hastalarda primer aldosteronizmi doğrulamak için ek yöntemler kullanılabilir.

Otomatik iMALDI tekniği, hastalıkla ilgili proteinler veya peptitler için hasta numuneleri de dahil olmak üzere biyolojik numunelerin spesifik ve doğru bir şekilde yüksek kantitatif taramasına olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometresi tabanlı protein ve peptit miktar tayini için otomatik bir iMALDI testinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. İnsan plazması gibi biyolojik numunelerle çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu ve prosedürü gerçekleştirirken her zaman gerekli güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın.