Name: Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Öğrenin biyomoleküler katlanma ve bağlanma etkileşimlerini DSC ile karakterize etmeyi. Termolabil ligandlar kullanarak termodinamik parametreleri hızlıca çıkarın ve ilaç tasarımına katkı sağlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R. W. H. V McGill Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) eğitim programı içinde Bionanomachines tarafından desteklenmiştir. A. K. M., s. E. J. NSERC hibe 327028-09 (A. K. M) ve 238562 (s. E. J.) tarafından desteklenmiştir.

1. numune hazırlama
<ol><li>İstenen biomolecule13arındırmak. Not: 2 M NaCl üç kez deiyonize su 3 kDa molekül ağırlığı kesme membran ile santrifüj filtre kullanarak üç tur ardından karşı değiş tokuş sonra bu protokolü kullanır satın kokain bağlama DNA aptamer MN4.</li>
	<li>Sentez ve arındırmak veya istenen thermolabile ligand13satın alın. Not: MN4 thermolabile ligand kokain bağlar. MN4 da bir negatif kontrol ligand thermolability deneysel bu sıcaklıklarda kullanılır kinin bağlar.</li>
	<li>Arabellekleri arıtılmış biomolecule diyaliz ve ligandlar (20 mM sodyum fosfat ve 140 mM NaCl tampon, pH 7.4, MN4 ve burada kullanılan ligandlar) dağılması hazırlayın.</li>
	<li>Biomolecule diyaliz boru kullanarak arabellek en az 2 litre karşı diyaliz ile 0,5 - 1,0 kDa kesme.</li>
	<li>(Çalışma arabellek adlandırılır) son arabellek iyice ile tampon equilibrated 0.2 µm filtre ile filtre.</li>
	<li>Ligandlar istenen kitlelerin tartmak ve onları süzülmüş çalışma arabellekte geçiyoruz. İstenen ligand konsantrasyonu doğru tartmak için çok küçük kitlelerin gerektiriyorsa, bir konsantre ligand hisse senedi çözüm (örneğin 10 x) olun. Not: Tüm DSC deneyler için örnek aynı çalışma tampon kullanmak ve ligand, Yani, hiç bir deney bu arabellek neden olur nerede ligand çalışma arabelleği biomolecule daha farklı bir toplu iş çözülür gerçekleştirmek önemlidir veri aktarımında uyuşmazlığı.</li>
	<li>Biomolecule hisse senedi çözüm iyice çalışma arabellek ile equilibrated 0.2 µm filtre ile filtre.</li>
	<li>Absorbans ölçümleri tarafından biomolecule konsantrasyonu belirlemek (260 nm için nükleik asitler gibi MN4 ve 280 nm proteinler için).</li>
	<li>Hazır biomolecule ve ligand 4 ° C buzdolabı (MN4 ve burada kullanılan ligandlar için uygun), ya da -20 depolamak veya-80 ° biomolecule ve ligandlar donma ve uzun vadeli depolama hoş görürsen C gereklidir. Degas degasser DSC yükleme önce bir masa üstü arabellek, biomolecule ve ligand çözümlerinde ( Tablo malzemelerigörmek). Not: Gaz Giderme daha yüksek sıcaklıklarda DSC kabarcık oluşumu önlemeye yardımcı olur. Kabarcıklar DSC tepe şekil ve taban çizgisi belirsiz sinyal eserler neden.</li>
</ol>2. DSC hazırlık
<ol><li>DSC'den gelen basınç kolu sökün ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Silikon tüp çalışma arabelleğinden çalıştırın ve başvuru kılcal ön flanş (metal açılış) ekleyin.</li>
	<li>Arka başvuru flanş açık örnek flanş bağlanarak başvuru ve örnek kılcal damarlar arasında bir köprü oluşturun.</li>
	<li>Silikon tüp bir parça bir atık şişesi vakum çizgi eklenmiş ile çalışan arka örnek flanş iliştirin.</li>
	<li>DSC ile çalışma arabellek 200 mL sifonu çekmeyi vakum hattı açın.</li>
	<li>DSC çalışma arabellek ile başvuru kılcal yükleyin. Yaklaşık 3-5 cm silikon tüp bölümlerini başvuru kapiller flanşlar iliştirin.</li>
	<li>1 mL pipet ucu arka flanş'ın silikon tüp içine yerleştirin. Çalışma arabelleği bir pipet ile 0.8 mL çizmek ve pipet ucu ile tampon ön başvuru flanş'ın silikon tüp içine yerleştirin.</li>
	<li>Pipet pompası pass açık silikon tüp yoluyla çalışma arabellek içine referans kılcal aşağı hafifçe bastırın ve pipet ucu yukarı arka flanş'ın içine eklenir. Çalışma arabellek düzeyi sadece yukarıda açık silikon tüp ulaşana kadar pipet pistonu tuşuna basın, daha sonra çalışma arabellek düzeyi sadece yukarıda arka silikon tüp ulaşana kadar pipet pompası bırakın.<ol>
<li>İleri geri baloncuklar başvuru kılcal hacmindeki temizlemek için çalışma arabellek geçen yineleyin. Not: Genellikle, çözüm ileri geri, 10 geçişleri herhangi bir kabarcıklar temizlemek yeterlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arka pipet ucu başparmak ile kap ve arka pipet ucu ve onlara bağlı silikon tüp ile başvuru flanşlar kaldırmak için açık pipet yavaşça çekin.</li>
	<li>Örnek kılcal çalışma arabellek olduğu gibi adımları 2.6-2,9 ile yükleyin. Siyah bir plastik kap üzerinde arka başvuru ve flanşlar, örnek yer açık flanşlar bırakarak ortaya çıkardı.</li>
	<li>Basınç kolu takın.</li>
	<li>DSC yazılımını açın (bkz. Tablo reçetesi) ve bir kez güç okuma stabilize; yukarı ok arabirimin üstündeki kırmızı tıklatarak araç basınç DSC güç üst kutusunda belirtilen enstrüman sıcaklık ve basınç okuma ile birlikte arabiriminin değil. Not: Monitör DSC okuma güç su geçirmezlik maddeler. Gücünü değişimler fazla ~ 10 µW eserler verilerde neden olabilir kılcal kabarcık oluşumu gösterir. Çözümler kaldırıldı ve degassed daha fazla devam etmeden önce.</li>
	<li>Çalışma arabellek ile DSC ileriye ve geriye doğru tarama yaparak equilibrate. Ekranın sol tarafında "Deneysel yöntemi" sekmesinde, "Tarama" seçeneği DSC sıcaklık tarama modunda çalıştırmak için seçili olduğundan emin olun. Not: Tarama aralığı, tarama hızı, düşük ve yüksek sıcaklık denge zaman ve taramaları sayısı sıcaklık deneysel parametreleridir.<ol>
<li>"Deneysel yöntem" sekmesi altında "Sıcaklık parametreleri" ilave "Isıtma için" düğmesini tıklatın. Alt ve üst deneysel sıcaklıkları, 1 ° C/dk'ya tarama hızı ve 60 için 1 ile 100 ° C girin denge dönemin s.</li>
		<li>Denge süre altında giriş "Serisi Ekle" düğmesini tıklatın. (Bir Isıtma ve soğutma bir inceden inceye gözden geçirmek için) 2 halk pencere "eklemek için adımları" alanına girin ve "alternatif Isıtma/soğutma" kutusunu işaretleyin. Tıkırtı "OK"; eklenen tarama arabirimi alt kısmında görünür. Her tarama olarak parametreleridir onay istenen.</li>
		<li>Deneme arabirimin üstündeki yeşil "Oynat" düğmesini tıklatarak başlatın. İstediğiniz klasöre gidin ve deneme popup penceresinde kaydetmek için bir dosya adı girin. Deney devam eden "Veri" sekmesi "Deney yöntemi" sekmesini sağ tıklatarak görüntüleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Thermolabile Ligand DSC veri toplama
Not: En az prosedür beş deney oluşur: arabellek başvuru deneyler ve ligand olmadan (temel çıkarma için kullanılan, konuyabakın), örnek ücretsiz biomolecule ligand bağlı biomolecule ile deneyler ve daha uzun bir yüksek sıcaklık denge süre ile ligand bağlı biomolecule.
<ol><li>Başvuru deneyler temel çıkarma örnek verileri için çalıştırın. Her iki kılcal çalışma arabelleği ile DSC yeniden ve 1 ° C min-1 bir üst (yüksek sıcaklık) ile uygun sıcaklık aralığında birden fazla ileriye ve geriye doğru inceden inceye gözden geçirmek toplamak denge zaman 120 s.<ol>
<li>Önceki arabellek denge inceden inceye gözden geçirmek arabirimin alt kısmından her ayrı ayrı vurgulama ve arabirimin tam ortasında kırmızı X tıklayarak silin. Yeni taramaları "Serisi Ekle" düğmesini tıklayarak "eklemek için adımları" için alanı 20 girmek ve "alternatif Isıtma/soğutma" kutusu denetimi ekleyin. Tamam'ı tıklatın ve yukarıdaki gibi yeşil play butonuna tıklayarak deneme çalıştırın.</li>
		<li>3.1 - adımları yineleyin 3.1.1 ligand başvuru elde etmek için her iki kılcal damarlar içinde istenen konsantrasyonu içeren çalışma arabellek ile deneyler için ligand (120 kullanarak iki ayrı deney toplamak s ve 600 s yüksek sıcaklık denge kez sırasıyla, thermolabile ligand dönüşüm oranı sabit edinme kullanılmak üzere). Not: Burada kullanılan tarama hızı biomolecule sonraki deneylerde, ileriye ve geriye doğru taramaları ( konuyabakın) termal denge sağlanır. Oranları < 0,1 0,2 ° C min-1 için gürültülü yerlerde yol ve DSC deneylerde uygun değildir-inceden inceye gözden geçirmek. Sıcaklıklar ligand doymuş biomolecule erime sıcaklığı iyi ücretsiz biomolecule erime sıcaklığı aşağıda kuyudan genişletmek (~ MN4 için 20-80 ° C). (Örneğin, 10 ileri ve 20 toplam 10 ters taramalar için yeterli) tarama tekrarlanabilirlik doğrulayın.</li>
		<li>(Örneğin, kokain ve kinin) birden fazla ligandlar kullanıyorsanız, DSC ile çalışma (2.5 adımından tekrar) arabelleği ligand kılcal damarlar kaldırmak ve Çapraz bulaşma engellemek için çalıştırma arasında 200 mL sifonu çek. Not: Çoğalt bir deney üzerinde ücretsiz biomolecule ligand bağlı çalıştırdıktan sonra önceki ligand şiddetle kapiller duvarları adsorbs ve yeterli arabellek kızarma ile kaldırılmaz kontrol için gerçekleştirmek yararlıdır. Ücretsiz biomolecule için yerlerde ligand bağlı deneme sonra bir daha büyük büyüklük ve daha yüksek denatürasyon sıcaklık kaydırılır görünüyorsa, büyük olasılıkla önceki ligand kızarma sonra Kalorimetresi hala mevcut olduğunu. % 20 ile kılcal kuluçka tarafından adsorbed ligand kaldırmak Contrad-70 plastik kapaklar ve basınç kolu kapalı 60 ° C'de 1 h için. DSC yazılım, denge süre girilen sıfır ile "İzotermal" süresi ve 60 ° C izotermal ısı için deneysel yöntem sekmesini seçin 3.600 s altında için deneysel modunu değiştirmek. "Deneysel yöntem Ekle" seçeneğini tıklatın. İzotermal deney ekranın alt bölümünde görünür. Tamamlanma sonra araç 2 litre deiyonize su ile Temizleme ve 2.5 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek deneyler DSC başvuru taranan gibi yükleme yordamı ve deneysel parametreleri kullanarak çalıştırın. Ücretsiz biomolecule veri kümesi için örnek kılcal çalışma arabellek istenen konsantrasyon, ücretsiz biomolecule içerirken, başvuru kılcal çalışma arabellek içerdiğinden emin olun.<ol>
<li>Ligand bağlı deneyler için başvuru kılcal çalışma arabellekte ligand mevcuttur ve biomolecule artı ligand örnek kılcal arabellekte çalışma vardır emin olun. Adım 2,5 olduğu gibi farklı ligandlar eklemeler arasında sistem floş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biomolecule ile ek deneme bağlı thermolabile ligand nerede yüksek sıcaklık denge dönemi için 600 artırılır gerçekleştirin s ve diğer tüm deneysel parametreleri olan adım 3.2.1 ile aynı. Not: Yüksek sıcaklık denge dönem için ikinci ligand bağlı deneme süresi sadece ligand kısa denge zaman deneme daha hızlı tükenmiş olması için seçilir. Eğer tarama sayısının bir fonksiyonu olarak yavaş yavaş çürüme ligand bağlı doruklarına ilk deneme (örneğin, birbirini izleyen en yüksek maxima farklılıkları vardır ≤ 0,5 ° C), tahmin etmek için yüksek sıcaklık denge dönemde 10 - için 20 - kat artar yeterince ligand ikinci deneme sırasında tüketmek. Ligand dönüşüm oranı sabit doğru hesaplama ikinci deneme ilk göre ligand swifter tükenmesi olmasını gerektirir. İki deney küresel analizinden elde ligand konsantrasyonu-ecek var olmak benzer ve ligand tükenmesi yeterince ikinci denemede hızlandırılmış değildir Eğer bu nedenle kullanılamaz.</li>
</ol>4. veri işleme
<ol><li>Açık DSC deneme DSC veri analiz yazılımı dosyalarında ( Tablo malzemelerigörmek) ve e-tablolar ham güç veri verme.</li>
	<li>Yazılım için uygun veri içine ham güç veri içeren tablolar içe aktarın.</li>
	<li>Temel örnek veriler arabellek güç veri--dan belgili tanımlık özgür ve ligand bağlı biomolecule deneyler çıkararak çıkarma. Not: thermolabile ligand deneme için her tarama ile ilk ligand konsantrasyonu azalıyor. Bu nedenle, örnek tarama 1 arabellek taramasından 1 çıkarmak idealdir. Kokain ile arabellek taramaları kayda değer olarak ligand dönüşüm devam eder ve bu nedenle bir tek thermolabile ligand arabellek tarama thermolabile ligand bağlı verilerin hepsini çıkarmak için kullanılabilir değiştirmeyin bulduk.</li>
	<li>Temel düşülen örnek güç veri ısı kapasitesi için dönüştürün. Not: Tahmini14,15,16-ebilmek var olmak biomolecule'nın kısmi belirli birim dönüştürme gerektirir. Güç ısı kapasitesi için dönüştürmek için denklem oldu daha önce açıklanan17.</li>
</ol>5. veri analizi
<ol><li>Genel olarak kısa denge zaman thermolabile ligand bağlı ısı kapasitesi dataset temel, ligand konsantrasyonu, katlama ve4daha önce açıklandığı gibi parametreleri bağlama ligand tek bir dizi uygun.</li>
	<li>Global uzun denge zaman veri kümesi için uygun4daha önce açıklandığı gibi thermolabile ligand dönüşüm oranı sabit hesaplamak için yineleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+in+life+science%3A+thermodynamics%2C+stability%2C+molecular+recognition+and+application+in+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li>
<li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Anatoliy_Dragan/publication/7002826_Microcalorimetry_of_biological_macromolecules/links/0912f507f62e09cd1b000000.pdf">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li>
<li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li>
<li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li>
<li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li>
<li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li>
<li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li>
<li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics-based+drug+design%3A+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li>
<li>Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2173508511000141">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li>
<li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2710.1978.tb00096.x/full">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li>
<li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12066569">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li>
<li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15025917">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li>
<li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li>
<li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li>
<li>Hinz, H. -J. Chapter 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDurchschlag%2C+H+%22Thermodynamic+Data+for+Biochemistry+and+Biotechnology%22">Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).</li>
<li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J+Biophy%22%5BJournal%5D)">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li>
<li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li>
<li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li>
<li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="https://web.stanford.edu/~kimth/www-mit/8.13/error_propagation.pdf">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li>
<li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Değişiklikler ve sorun giderme
Şekil 1 ve Şekil 2 kullanılan küresel uygun analiz ayrıntılarını olmuştur daha önce açıklanan4. Burada, performans ve thermolabile ligandlar ile DSC bağlama deneyler analiz pratik açılardan anahat. Yalnız thermolabile ligand ligand çıkarılır için DSC temel alınan Not + biomolecule dataset, etkili bir şekilde serbest veya termal dönüşüm tarafından absorbe ısı dışarı...

Diferansiyel kalorimetre tarama (DSC) quantitating biyomoleküler bağlama ve katlama etkileşimleri1,2,3için güçlü bir yöntem olduğunu. DSC gücü onun yetenek bağlama ve mekanizmaları katlama aydınlatmak ve karşılık gelen termodinamik parametreler2,3verim için içerir. Ayrıca, DSC çözüm fizyolojik koşullar altında gerçekleştirilebilir ve etiketleme biomolecule veya ligand, örneğin, fluorophores, spin-etiketleri veya nükleer izotoplar4gerektirmez. Araç biomolecule ligand de denatüre için gereken ısı miktarı ölçüm sıcaklığı, inceden inceye gözden geçirmek. Elde edilen yerlerde ligand bağlayıcı ve süreçleri katlama yöneten termodinamik parametreler ayıklamak için kullanılır. DSC veya diğer termodinamik teknikleri tarafından sağlanan bilgi uyuşturucu biomolecules1,5,6,7,8hedefleme tasarımını rehberlik için önemlidir. Ancak, tekrarlanan yüksek sıcaklıklara tarama (~ 60-100 ° C) sorunlu olabilir. Örneğin, birçok pharmaceutically önemli bileşikler düzenlenmesi veya yüksek sıcaklık9,10,11, Yanisürekli maruz üzerine ayrışma geçmesi, onlar thermolabile. Etkileşimleri DSC tarafından genellikle bağlama muayene thermogram termodinamik analizler12tekrarlanabilirlik doğrulamak için birden fazla ileriye ve geriye doğru inceden inceye gözden geçirmek gerekir. İlk bir ligand termal dönüşümü değişmiş bağlama özellikleri ile ikincil bir forma yol açar şekil ve art arda gelen yerlerde, konumunu telaffuz farklılıkları sırasında her tarama ile ilk ligand konsantrasyonu azalır bu yana Termal dönüşümü ürünleri birikir. Bu veri kümeleri için geleneksel analizleri mükellef değildir.
Biz son zamanlarda biyomoleküler katlama yöneten ve bağlama etkileşimleri için başvurulan tek bir ligand bağlı deneme termodinamik parametreler komple set verir thermolabile ligand DSC veri kümeleri için küresel uygun yöntem geliştirdik 4ücretsiz biomolecule için gerekli thermogram. Analiz örnek gerektirdiği ve deneysel zamanı azaltır ~ 10 kat standart DSC yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında. Biz muhasebesi ligand için bu varsayarak tarafından termal dönüşümü sırasında her tarama nereye thermogram bağlı değildir ligand konsantrasyonu yüksek sıcaklık bölümü olur. Bu nedenle, ligand konsantrasyonu termodinamik parametreler ayıklamak için kullanılan thermogram bölümünü içinde bir sabittir. Nasıl oranı sabit ligand termal dönüşümü için daha uzun bir yüksek sıcaklık denge süre ile bir ek deneme yaparak elde edilebilir Ayrıca gösterdi. Ligand termal dönüşümü daha az sıcaklık bağımlı nerede sistemleri için (Yani, kayda değer bütün sıcaklıklarda meydana gelen), analiz değişken ligand konsantrasyonu içerecek şekilde değiştirilmiş. Burada biz hızla benzoylecgonine yüksek sıcaklıklarda dönüştürür thermolabile ligand kokain huzurunda DNA aptamer MN4 için bu yordamı göstermek (> 60 ° C). Kinin dönüşüm deneysel bu sıcaklıklarda geçmesi değil ve ayrıca MN4 için bağlar ligand thermolability için bir negatif kontrol kullanılır. Biz thermolabile ligand DSC veri kümeleri ve termodinamik ve Kinetik parametreleri katlama, bağlama ve ligand dönüştürme işlemleri verimli onların analiz edinimi tanımlamak.

<table><tbody><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Kimyasal Impex</td> <td># 00829</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji için deiyonize su</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mikron steril şırınga filtreleri</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa santrifüj filtreler</td><td>Millipore UFC900324</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü 0.5-1.0 kDa kesme</td><td>Spektrum Laboratuvarları</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Silikon boru</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Plastik DSC flanş kapakları</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNA aptamer MN4</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Kokain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Kinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III mikrokalorimetre</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr> <tr><td>DSCRun yazılımı</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyze yazılımı</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr> <tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

biyomoleküler dsc profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için thermolabile ligandlar ölçme

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Diferansiyel kalorimetre tarama (DSC) miktarının biyomoleküler katlama ve bağlama etkileşimleri yöneten termodinamik parametreler için bir güçlü bir tekniktir. Bu bilgiler yeni ilaç bileşikler tasarımda önemlidir. Ancak, birçok pharmaceutically ilgili ligandlar DSC analizleri içinde kullanılan yüksek sıcaklıklarda kimyasal olarak kararsız vardır. Ligandlar ve termal olarak dönüştürülür ürünleri konsantrasyonları Kalorimetresi hücre içinde sürekli değişiyor çünkü böylece, bağlama etkileşimleri ölçme meydan okuyor. Burada, thermolabile ligandlar ve DSC dönüştürme işlemleri hızla katlama, bağlama ve ligand termodinamik ve Kinetik bilgi almak için bir iletişim kuralı'nı mevcut. DNA aptamer thermolabile ligand kokain bağlar MN4 için bizim yöntem uygulamış. Thermolabile ligand dönüştürme için hesapları yeni bir küresel uygun analiz kullanarak, tam bir katlama ve bağlama parametreler kümesi elde DSC deneyler bir çifti. Buna ek olarak, gösterdiğimiz oranı sabit thermolabile ligand dönüşüm için yalnızca bir ek DSC veri kümesi ile temin edilebilir. Biomolecule, yavaş katlanır, yavaş bağlama ve thermolabile ligand hızlı tükenmesi geri dönüşü olmayan toplama dahil olmak üzere belirlenmesi ve birkaç daha karmaşık senaryo verileri analiz etmek için yönergeler sunulmaktadır.

Thermolabile ligand DSC için temsilcisi veri şekil 1' de gösterilir. Thermolabile ligand bağlı pik yüksekliği ve pozisyon gittikçe vardiya bu ilişkisiz biomolecule doğru thermolabile ligand her inceden inceye gözden geçirmek ile (Şekil 1a) tükenmiş gibi. Ücretsiz denatürasyon profil thermolabile ligand dönüşüm (Şekil 1b) son nokta için bir başvuru olarak kullanılır. Veri kinin için bağlı MN4 için bir...

Biz hızlı katlanır ve etkileşimleri ile thermolabile ligandlar diferansiyel tarama Kalorimetre kullanarak bağlama biyomoleküler karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut.

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Bu metodolojinin genel amacı, termolabil bir ligand kullanarak sadece iki deneyle, diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) aracılığıyla biyomoleküler katlanma ve bağlanma etkileşimlerini yöneten termodinamik parametreleri elde etmektir. Bu yöntem, biyokalorimetri ve ilaç tasarımı alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, biyomoleküller ve sıkı bağlanan inhibitörler arasındaki etkileşimleri yöneten termodinamik parametrelerin göreceli büyüklükleri nelerdir? Bu tekniğin temel avantajı, tek bir deneyde tam bir ligand titrasyonunun gerçekleştirilmesi ve böylece global uyum analizinden termodinamik parametrelerin hızlıca çıkarılmasına olanak tanımasıdır.Başlangıç olarak, saflaştırılmış biyomolekülün ligand çözeltisine diyalizi için tamponları hazırlayın. Biyomolekülü, 0,5 ila 1,7 kilodalton kesme sınırına sahip diyaliz tüpleri kullanarak en az bir litre tampona karşı diyalize edin. Yüksek kaliteli DSC verileri elde etmedeki en önemli adım, biyomolekül ligandının istenen tampona karşı diyaliz edilmesidir.Bu, DSC verilerinde tampon uyumsuzluğuna bağlı artefaktların oluşmamasını sağlar. Çalışma tamponu olarak adlandırılan nihai tamponu, tamponla tamamen dengelenmiş 0.2-mikronluk bir filtreden geçirin. Ligandların istenen kütlelerini tartın ve bunları filtrelenmiş çalışma tamponu içinde çözün.İstenen ligand konsantrasyonları için gereken kütleler hassas bir şekilde tartılamayacak kadar küçükse, konsantre bir ligand stok çözeltisi hazırlayın. Biyomolekül stok çözeltisini, çalışma tamponu ile tamamen dengelenmiş 0,2 mikronluk bir filtreden süzün. Ardından, absorbans ölçümleriyle biyomolekül konsantrasyonunu belirleyin.Hazırlanan biyomolekülü ve ligandı, biyomolekül ve ligandlar dondurmaya toleranslıysa ve uzun süreli saklama gerekiyorsa, 4 °C'lik bir buzdolabında veya -20 veya -80 °C'de saklayın. Diferansiyel taramalı kalorimetreye (DSC) yüklemeden önce tamponu, biyomolekül ve ligand çözeltilerini masaüstü bir gaz giderici ile gazdan arındırın. Basınç kolunu DSC'den sökün.Ardından, çalışma tamponundan bir silikon tüp çekin ve bunu referans kılcal borunun ön flanşına takın. Arka referans flanşını ön örnek flanşına bağlayarak referans ve örnek kılcal boruları arasında bir köprü oluşturun. Sonra, arka örnek flanşına, vakum hattı bağlı bir atık balonuna uzanan bir silikon tüp parçası takın.DSC'yi 200 mililitre çalışma tamponu ile yıkamak için vakum hattını açın. İlk olarak, referans kılcal boru flanşlarına yaklaşık üç ila beş santimetrelik silikon hortum parçaları takın. Ardından, arka flanşın silikon hortumuna bir mililitrelik pipet ucu yerleştirin.Bir pipet yardımıyla 0,8 mililitre çalışma tamponu çekin ve tampon dolu pipet ucunu ön referans flanşındaki silikon tüpe yerleştirin. Çalışma tamponunu ön silikon tüp aracılığıyla referans kılcal borusundan geçirip arka flanşa takılı olan pipet ucuna doğru iletmek için pipet pistonuna nazikçe bastırın. Çalışma tamponu seviyesi ön silikon tüpün hemen üzerine ulaşana kadar pipet pistonuna bastırın, ardından çalışma tamponu seviyesi arka silikon tüpün hemen üzerine ulaşana kadar pipet pistonunu serbest bırakın.Hava kabarcıklarını temizlemek için çalışma tamponunu referans kılcal boruda ileri geri geçirmeye devam edin. Ardından, arka pipet ucunu işaret parmağınızla kapatın ve silikon tüpler takılıyken referans flanşlardan çıkarmak için arka pipet ucunu ve ön pipeti nazikçe yukarı doğru çekin. Örnek kılcal borusunu daha önce olduğu gibi çalışma tamponu ile doldurun.Siyah plastik kapağı, ön flanşları açık bırakacak şekilde arka referans numune flanşlarının üzerine yerleştirin. Basınç kolunu DSC'ye takın, ardından DSC yazılımını açın ve güç okuması stabilize olduğunda arayüzün üst kısmındaki kırmızı yukarı okuna tıklayarak cihazı basınçlandırın. DSC gücü, cihaz sıcaklığı ve basınç okumasıyla birlikte arayüzün sağ üst köşesindeki bir kutucukta gösterilmektedir.Ekranın sol tarafındaki deneysel yöntem sekmesinde ileri ve geri tarama yaparak DSC'yi çalışma tamponu ile dengeleyin. DSC'yi çalıştırmak için tarama seçeneğinin ve sıcaklık tarama modunun seçili olduğundan emin olun. Deneysel yöntem sekmesi altındaki sıcaklık parametreleri ekinde, ısıtma düğmesine tıklayın.Alt ve üst deneysel sıcaklıklar için bir ve 100 °C, tarama hızı için dakikada bir °C ve dengeleme süresi için 60 saniye girin. Dengeleme süresi giriş alanının altındaki AddSeries düğmesine tıklayın. Açılan penceredeki steps to add alanına iki değerini girin ve Alternate Heating/Cooling kutucuğunu işaretleyin.Tamam'a tıklayın. Eklenen taramalar arayüzün alt kısmında görünür. Her bir tarama için parametrelerin istendiği gibi olduğunu kontrol edin. Arayüzün üst kısmındaki yeşil oynat düğmesine tıklayarak deneyi başlatın.İstenen pencereye gidin ve açılır pencereye deneyi kaydetmek için bir dosya adı girin. Deney yöntem sekmesinin sağındaki veri sekmesine tıklayarak deneyin ilerlemesini görüntüleyin. Her iki kılcal boruyla çalışma tamponunu yeniden yükleyerek, örnek verilerinin temel çizgi çıkarımı için referans deneyleri çalıştırın.Uygun bir sıcaklık aralığında, dakikada bir derece Celsius hızla ve 120 saniyelik bir üst dengeleme süresiyle birden fazla ileri ve geri tarama gerçekleştirin. Arayüzün alt kısmındaki önceki tampon dengeleme taramalarını, her birini ayrı ayrı vurgulayıp arayüzün orta sağındaki kırmızı X'e tıklayarak silin. AddSeries düğmesine tıklayıp eklenecek adımlar alanına 20 girerek ve Alternate Heating/Cooling kutusunu işaretleyerek yeni taramaları ekleyin.Ardından, Tamam'a tıklayın ve daha önce yaptığınız gibi yeşil oynat düğmesine tıklayarak deneyi çalıştırın. Ligand için referans deneyleri elde etmek amacıyla, her iki kapilerde de istenen konsantrasyonda ligand içeren çalışma tamponu ile bu adımları tekrarlayın. Termolabil dönüşüm için hız sabitini belirlemede kullanılmak üzere iki ayrı deney toplayın.Serbest biyomolekül veri seti için, referans kılcal borunun çalışma tamponu, numune kılcal borusunun ise çalışma tamponu içinde istenen konsantrasyondaki serbest biyomolekülü içerdiğinden emin olun. Ardından, referans taramalarda kullanılan DSC yükleme prosedürü ve deney parametrelerinin aynısını kullanarak numune deneylerini gerçekleştirin. Liganda bağlı deneyler için, referans kılcal boruda ligandın çalışma tamponu içinde, numune kılcal borusunda ise biyomolekül ve ligandın çalışma tamponu içinde olduğundan emin olun.Farklı ligand eklemeleri arasında sistemi daha önce yapıldığı gibi yıkayın. Yüksek sıcaklık dengeleme süresinin 600 saniyeye çıkarıldığı ve diğer tüm deneysel parametrelerin öncekiyle aynı olduğu, biyomolekülün termolabil ligandla bağlandığı ek bir deney gerçekleştirin. Metin protokolünde açıklanan veri işleme ve analiz aşamalarına geçin.Termolabil ligand bağlı pikin konumu ve yüksekliği, her taramada termolabil ligand tükenmeye başladıkça sırasıyla bağlı olmayan molekülünkine doğru aşağı kayar. 3D olgunlaşma profili, termolabil ligand dönüşümünün bitiş noktası için referans olarak kullanılır. Yüksek sıcaklık dengeleme süresinin artırılması, kısa dengeleme süreli veri setine kıyasla her taramada termolabil ligand konsantrasyonunda daha belirgin azalmalar sağlar.İki veri setinden elde edilen optimize edilmiş küresel uyum konsantrasyon parametreleri kullanılarak, yüksek dengeleme sıcaklığındaki ligand dönüşüm hız sabiti hesaplanabilir. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde 72 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, veri artefaktlarını önlemek için yükleme pipeti kullanılarak DSC kılcal borularındaki kabarcıkların tahliye edilmesi amacıyla biyomolekül ligandının da gazının alınması gerektiğini unutmamak önemlidir.Bu videoyu izledikten ve makaleyi okuduktan sonra, biyomoleküller üzerinde DSC deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği ve katlanma ile bağlanma etkileşimlerini yöneten termodinamik parametreleri hızla çıkarmak için küresel sığdırma analizlerinin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem, denge durumundaki katlanma-bağlanma etkileşimlerine dair içgörü sağlayabildiği gibi, yavaş katlanma ve/veya ligand-bağlanma kinetiği sergileyen biyomoleküller gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

measuring-biomolecular-dsc-profiles-with-thermolabile-ligands-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Izotermal titrasyon kalorimetri orta bağlanma afiniteleri ile biyolojik sistemler için bağlayıcı termodinamik izlemek için kullanmak için genel bir protokol sunulmuştur.

Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre

Bu video, bir biyomolekül ve bir ligand arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılan bir teknik olan diferansiyel taramalı kalorimetriyi göstermektedir. Bir DNA aptamer ve bir termolabil ligandın bağlanması, numuneye tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngüleri uygulanarak ve termodinamik analiz için taramalar elde edilerek incelenir.

DNA Aptamer-Terponabil Ligand Etkileşimini İncelemek için Diferansiyel Taramalı Kalorimetri

Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Diferansiyel taramalı florimetri, proteinlerle etkileşimler için küçük molekül kütüphanelerini taramak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Burada, küçük bir molekül ile protein ortağı arasındaki ayrışma sabitinin bir tahminini sağlamak için bu analizleri genişletmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Diferansiyel tarama kalorimetrisi, bir proteinin denatüre edilmesi gerekli ısı geçiş sıcaklığına (ler) ve toplam ısı enerjisini ölçer. elde edilen sonuçlar, aşı formülasyonlarında protein antijenlerinin termal stabilitesini değerlendirmek için kullanılır.

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Burada, üretim ve arıtma etiketlenir proteinlerin için bir protokol kararlı izotop ve protein-protein etkileşimleri nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve MicroScale kullanarak sonraki karakterizasyonu ile mevcut Thermophoresis (MST) deneyler.

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Mikro ölçekli termoforez, düşük malzeme maliyetiyle bağlanma sabitlerini hızlı bir şekilde elde eder. Etiketli veya etiketsiz mikro ölçekli termoforez ticari olarak temin edilebilir; Bununla birlikte, etiketsiz termoforez, floresan etiketler kullanılarak gerçekleştirilebilecek etkileşim ölçümlerinin çeşitliliğini sağlayamaz. Etiketli termoforez ölçümleri için bir protokol sağlıyoruz.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

Hedef proteinin erime sıcaklığındaki değişiklikleri izlemek(yani,termal kayma tahlili, TSA), birkaç yüz bileşik parça kütüphanelerini taramak için etkili bir yöntemdir. İç triptofan floresanını ve parça taraması için hafif geri saçılmaları izlemek için robotik destekli nano-Diferansiyel Tarama Florüreti (nano-DSF) uygulayan bir TSA protokolü sunuyoruz.

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Bu protokol, bileşikler ve protein molekülleri arasındaki bağlanmayı tespit etmek için benzersiz bir yöntemi tanımlar ve minimum protein numune kaybı ve yüksek veri doğruluğu avantajları sunar.

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

Burada, küçük moleküllerin ilgilenilen proteinlere bağlanmasını araştırmak için kullanılan yüksek verimli, floresan tabanlı bir teknik olan termal kayma testini sunuyoruz.

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Öğrenin biyomoleküler katlanma ve bağlanma etkileşimlerini DSC ile karakterize etmeyi. Termolabil ligandlar kullanarak termodinamik parametreleri hızlıca çıkarın ve ilaç tasarımına katkı sağlayın.

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme (Video) | JoVE Journal

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Daha fazla video keşfet