Name: Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Öğrenin Arabidopsis thaliana fidanlarının kök morfolojisini iki katlı mikroakışkan platformda yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemi. Bu teknik bitki biyolojisinde kök büyümesi dinamiklerini incelemek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu el yazması UT-Battelle, LLC altında Sözleşme No tarafından kaleme ABD Enerji Bakanlığı ile DE-AC05-00OR22725. Amerika Birleşik Devletleri hükümeti korur ve Yayımcı, yayın, makale kabul ederek Amerika Birleşik Devletleri hükümeti yayımlamak veya yayımlanmış form üretmek için münhasır olmayan, Odenmis, geri alınamaz, dünya çapında lisans korur onaylar Bu makale, veya bunu, Amerika Birleşik Devletleri hükümeti amaçlar için başkalarına izin verme. Enerji Bakanlığı'nın araştırma Federal projeleri DOE kamu erişim planı (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) uygun olarak bu sonuçları kamu erişim sağlayacak.
Bu eser kısmen genomik bilim programı, ABD Enerji Bakanlığı, Office bilim, biyolojik ve çevresel araştırma, bitki mikrop arabirimleri bilimsel odak alanını (http://pmi.ornl.gov) bir parçası olarak tarafından desteklenmiştir. Mikrosıvısal platformlar imalatı Nanofabrication araştırma laboratuvarında Merkezi Nanophase malzeme bilimleri için bir DOE ofis, bilim kullanıcı tesis olan gerçekleştirilmiştir. JAA bir NSF yüksek lisans araştırma bursu DGE-1452154 tarafından desteklenmektedir

1. iki katlı Platform imalat
<ol>
	<li>Çok katmanlı masters imalatı
	<ol>
		<li>Spin kat epoksi esaslı negatif fotorezist (~63.45% katı, 1250 cSt) üreticinin belirtimlerine göre (2000 rpm için 45 s) üzerine 20 µm ilk tasarım katman için istediğiniz yüksekliği elde etmek için 4 inç çapında silikon gofret.</li>
		<li>Yumuşak-resist kaplı gofret için 95 ° C'de 4 dk pişir Gofret 5 dk. ortaya çıkarmak için UV ışık için 15 için gofret soğutmak izin s (~ 150 mJ/cm2 365 nm) aligner alt tabaka geometrisini tanımlamak için bir UV bir photomask aracılığıyla ulaşın.</li>
		<li>Sonrası pozlama fırında 95 ° C'de 5 min için gofret Geliştirme olmadan, gofret spin coater ve spin için negatif fotorezist epoksi esaslı ikinci bir katman üzerinde dönmek (~76.75% katı, 80.000 cSt) 150-200 µm ikinci katman yüksekliği elde etmek için 3000 devirde.</li>
		<li>Gofret için 5 dk 45 dk için 95 ° C Pinar aktarmadan önce dinlenmek izin verir. Ocağın üzerinde pişirme sonra gofret kaldırmak ve serin ve düz yüzeyin üzerinde başka bir 5 min için oda sıcaklığında sertleşmesine resist sağlar. Hizalayın ve gofret için 30 ikinci katman photomask maruz bir UV kişi aligner (yaklaşık 300 mJ/cm2doz) s.</li>
		<li>Sonrası pozlama fırında yanında duvar ilanı gofret 95 ° C'de 15 dakika bir ocağın üzerinde gerçekleştirmek ve gofret düz yüzeyin 5 min için üzerinde geliştirme önce soğumasını bekleyin.</li>
		<li>Her iki resist katmanı aynı anda gofret bir plastik tabak içine yerleştirip uygun geliştirici gofret batış geliştirmek ( Malzeme tabloyabakın). Yavaşça zaman zaman taze geliştirici üzerinde gofret yıkamak için çanak rock.</li>
		<li>17 dk sonra gofret isopropanol (IPA) ile yıkayın. Beyaz bir film filmin kaybolana kadar gofret geliştirici ve IPA ile durulama arasında yinelemek görünürse. Desenli silikon gofret azot ile kuru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polydimethylsiloxane yumuşak-litografi
	<ol>
		<li>Bir hava plazma 30 için silikon gofret maruz yüksek üzerinde küme s bir plazma temizleyici (temizlemek için malzemeler tablo bkz:). Silanize ile trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfloro-n-Oktil) silane 2 h için silane (85 ° C) parlama noktası aşağıda bir ocağın üzerinde kimyasal başlıklı gofret.</li>
		<li>Polydimethylsiloxane (PDMS) 10:1 oranında kür Ajan silicon ana gofret üzerine dökün. Bir vakum odasında karışık PDMS degas ve polimer bir 70 ° C fırında PDMS tamamen tedavi kadar veya 1 h için tedavi.</li>
		<li>Bir neşter kullanarak PDMS aygıtlar kesmek ve onları silikon ana gofret soyma. 1.5 mm biyopsi yumruk tohum giriş ana kanal içine kök büyümesini teşvik için bir 45 ° açıyla Delme tohum ve tedavi girişleri oluşturmak için kullanın.</li>
		<li>Açık yapışkan bant kullanmak enkaz PDMS aygıttan kaldırmak ve aygıt tasarım yan cam coverslip yerleştirin. Otoklav monte cihazlar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. dikim aygıtları
<ol>
	<li>Arabidopsis thaliana tohum hazırlama
	<ol>
		<li>Yüzey A. thaliana tohum bir microfuge tüp bir çözüm de-iyonize su ve % 0.1 Triton X deterjan 7 dk. yıkama tohumları 4 kez steril su ile seyreltilmiş % 30 piyasada bulunan çamaşır suyu ile sterilize.</li>
		<li>Gecede veya bir hafta 4 ° C'de microfuge tüp soğutucu tarafından tohum tabakalaşmak</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aygıt hazırlama
	<ol>
		<li>Bir vakum odası gaz havayı çıkarmak için gaz giderme sterilize cihazları yerleştirmek geçirgen PDMS ve sıvı kanallarını dolum kolaylığı geliştirmek için.</li>
		<li>Aygıtları vakum odası ve hemen sıvı ¼ güç bitki esaslı ortam pH 5.7 ile dolu bir petri aygıtlardan daldırın.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, sıvı cihazın doldurmak için giriş çek. Tarafından görsel denetim içinde kanalların hiçbir hava kabarcıkları kalır emin olun.</li>
		<li>Bireysel cihazlar için yeni kuru Petri yemekler aktarımı. Pour veya pipet sıcak agar agar düzeyi PDMS cihazın üst ile hemen hemen aynı hizada olana aygıt çevresinde. Agar kuvvetlendirmek izin. Not: Aygıtları artık tohum dikim için hazırsınız veya ihtiyaç kadar 4 ° C de saklanabilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cihazlar içinde tohum Ekim
	<ol>
		<li>Steril bir ortamda bir steril tohum küçük bir pipet kullanarak her aygıt koya aktarın.</li>
		<li>Kapak balmumu ile Petri kabına ( Malzeme tabloyabakın) film ve açık/koyu Bisiklete binme büyüme odası veya pencere oda sıcaklığında yerleştirin. Petri kabına dikey aygıtlardır ve yerçekimi kökleri kanalı ile büyümeye teşvik edecek gelecek şekilde yönlendirin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. tedavi
<ol>
	<li>Deneysel tedaviler
	<ol>
		<li>Fide'nın gelişiminde istediðiniz saatte deneysel tedavi fide için tedavi reçete miktarı her pipet ile 8 yan bağlantı noktaları ekleyerek.</li>
		<li>Petri kabına yeniden mühürlemek ve büyüme odası veya pencere geri dönün.</li>
		<li>Bireysel zaman noktaları yakalamak veya zaman atlamalı görüntüleme başlamak için istediğiniz saatte örnekleri Imaging ile devam edin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. optik görüntüleme
<ol>
	<li>Düşük çözünürlük (4-20 X) görüntüleme
	<ol>
		<li>Aygıt ve daha düşük çözünürlük (4-20 X) parlak alan veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme için bir ters parlak alan mikroskop altında fide içeren tüm Petri kabına yerleştirin. Pozlama süreleri, lamba parlaklık, diyafram ve ışık polarizasyonu ayarlayarak ilgi Morfolojik özellikleri aydınlatmak için ışık koşulları en iyi duruma getirme. Sahne alanı için kök ve odak alanı istenen sürücü kök veya ilgi root hair(s) üzerinde.</li>
		<li>Bir seferinde noktası veya bir zaman dizi resmi elde etmek. Kök saç büyüme görselleştirmek için en az bir kez başına büyüyen kök tüyleri görüntü. Ana kök gelişimini görselleştirmek için görüntüleme tamamlandıktan sonra bir görüntü her 30 dk. dönüş Petri kabına ve büyüme odası veya pencere dikey pozisyonda fidan elde.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Daha yüksek çözünürlük (20-63 X) görüntüleme
	<ol>
		<li>Fide istenen vakit geçirmek için büyüdü sonra forseps coverslip ve aygıt agar kaldırmak için kullanabilirsiniz. Bir ıslak etanol laboratuvar doku kullanarak coverslip alt temiz.</li>
		<li>Önerilen daldırma medya hedef mikroskop objektif üreticisi tarafından önerilen olarak uygulanır. Coverslip mikroskop Sahne Alanı'nda yerleştirin ve amaç üzerinde daldırma medya iletişim aşaması yükseltmek. Aydınlatma koşulları pozlama süreleri, lamba parlaklık, diyafram ve ışık polarizasyonu ayarlayarak en iyi duruma getirme. Sahne alanı üzerinde ilgi root hair(s) istenilen bölgeye ve odak için sürücü. Not: DIC sitoplazmik akış görselleştirmek için gereklidir ve floresan işaretleri organel hareket görselleştirmek için ihtiyaç vardır.</li>
		<li>Kök tüylerin zamanla ölçmek için min başına bir görüntü elde etmek. Organel hareket görselleştirmek için organelleri tanımlanabilir Floresans sinyalini koruyarak Floresans maruz kalma süresini en aza indirmek. Organelleri görüntülerini hızlı çekim hızı sağlar elde etmek. Artık bu zaman hata görüntüleme için ortam sıcaklığı ve nem korumak için bir canlı hücre görüntüleme sahne kuluçka makinesi kullanın. Not: 63 X Petrol amaç görüntüleme kök saç organelleri için önerilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. sigara-optik görüntüleme
<ol>
	<li>Aygıt hazırlama
	<ol>
		<li>Bir kez fide için istediğiniz zaman büyüdü,</li></ol></li></ol>aygıt ve coverslip Petri kabına kaldırın.
		<li>Aygıt ters çevirin ve kök PDMS kanal içinde kalır ki soyma yavaşça uzakta coverslip.</li>
		<li>İçin daha yüksek çözünürlük Atomik kuvvet veya tarama elektron mikroskobu kökünden bir substrat PDMS aygıtı kullanmaya devam edin.</li>
	
	
	<li>Elektron mikroskobu tarama
	<ol>
		<li>İnce bir depozito (~ 20 nm) kök ve bir çift silah elektron ışını buharlaşma odası kullanarak PDMS çevreleyen krom tabakasının.</li>
		<li>Kök ve PDMS aygıt bir Taramalı elektron mikroskobu odasına aktar. Not: Görüntüleme koşulları, Yani gerilim, geçerli ve çalışma mesafe belirli bir uygulama için istediğiniz çözünürlüğü elde etmek için optimize edilmiş olması gerekir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM)
	<ol>
		<li>Bir AFM numune sahibi PDMS aygıt kök yan binin. Kamera kontrastı arttırmak ve kök PDMS daha kolay ayırt etmek için AFM numune tutucu üzerinde cihaz montaj önce düz yansıtıcı yüzey (örneğin Mika altın kaplı) PDMS aygıtta yerleştirin.</li>
		<li>Bir sıvı iyi eki PDMS aygıt üstünde güvenli ve görüntüleme sırasında sulu kökleri tutmak için su ile doldurun.</li>
		<li>Numune tutucu AFM yükleyin. Z-Denetim için PDMS cihazın kalınlığını ayarlamak ve konsol rehberlik için bir kamera ile kök faiz bölgeye sür.</li>
		<li>Lazer konsol ucu ile hizalayın. En iyi sonuçları elde etmek için kişi modunu görüntüleme, tarama sırasında kök en az kuvvet sarfetmek 0.01 veya 0,03 N/m bahar sabitleriyle cantilevers kullanın.</li>
		<li>Yavaşça indirin tarama mekanizması kadar konsol sadece örnek ile temas. İstenen bölge için tarama boyutu ayarlamak ve 1 satır/s her satıra 256 gerilim puanla tarama hızını seçin. Tarama elde etmek.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Pritchard, S. G. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Seth_Pritchard/publication/229773581_Soil_organisms_and_global_climate_change/links/53ee8d000cf26b9b7dccbff1.pdf">Soil organisms and global climate change.</a> Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).</li>
<li>Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-root+production+dominates+response+of+a+deciduous+forest+to+atmospheric+CO2+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natll.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment.</a> Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).</li>
<li>McCormack, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+fine+roots+improves+understanding+of+below-ground+contributions+to+terrestrial+biosphere+processes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes.</a> New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).</li>
<li>Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+regulation+of+polar-growth+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">ROS regulation of polar-growth in plant cells.</a> Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).</li>
<li>Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-540-79405-9_8">Root Hairs</a>. , 211-232 (2009).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+an+integrated+microfluidic+chip+for+plant+science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+fluorescence+imaging+of+Arabidopsis+root+growth+with+rapid+manipulation+of+the+root+environment+using+the+RootChip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
<li>Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+chip+for+high-throughput+phenotyping+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis.</a> Lab Chip. 14 (7), 1281(2014).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat. Methods. 9 (11), (2012).</li>
<li>Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+Root+using+Multi-Laminar+Flow+on+a+Microfluidic+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip.</a> Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).</li>
<li>Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7051054/">Early characterization method of plant root adaptability to soil environments.</a> Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).</li>
<li>Sanati Nezhad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platforms+for+plant+cells+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platforms for plant cells studies.</a> Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3604788">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).</li>
<li>Rigas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+gravitropism+and+root+hair+development+constitute+coupled+developmental+responses+regulated+by+auxin+homeostasis+in+the+Arabidopsis+root+apex%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytolol%22%5BJournal%5D)">Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex.</a> New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).</li>
<li>Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+elongation%2C+water+stress%2C+and+mechanical+impedance%3A+A+review+of+limiting+stresses+and+beneficial+root+tip+traits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits.</a> J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).</li>
<li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+in+poly%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophor%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li>
<li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li>
<li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).</li>
<li>Talbot, M. J., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+and+cell+outline+imaging+in+plant+tissues+using+the+backscattered+electron+detector+in+a+variable+pressure+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope.</a> Plant Methods. 9 (1), 40(2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

İki katmanlı tasarım sınırları tek bir görüntüleme uçağı ve platform için kök tüyleri deconstructed ve yüksek çözünürlüklü olmayan optik görüntüleme için bir substrat kullanılan bir bitki-on-a-chip platformu oluşturmak için bu makalede açıklanan yöntemi benzersizdir . Yüksek çözünürlüklü optik Imaging'i kullanma optik görüntüleme üzerinden tek başına elde edilemedi bitki doku hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Örneğin, AFM görüntüleme geliştirme sırasında veya belirli bir kimyasal veya biyolojik tedavi sonrasında kö...

İyi kök özellikleri su ve besin alımı için yeni toprak alanlarda keşfetmek ve toplam kök yüzey alanı artan tesisi, artış. Bu iyi kök özellikler ciro yeraltı gıda zinciri1 uyarıcı bir önemli rol oynar ve iyi bazı bitki türleri kökleri beklenen yüksek atmosferik karbon dioksit altında çift2sayısıdır. Her ne kadar iyi kökleri onların işlevi3tarafından karakterize için yeni tanımları savunucusu iyi kökleri genellikle olanlar kadar 2 mm çapında, daha küçük tanımlanır. Gibi pek çok iyi kökleri, kök tüyleri alımı ve emme işlevi sağlar, ancak mikron sırasına fan çapı daha küçük bir yer işgal. Kendi küçük boyutu nedeniyle kök kılları için görüntü içinde situ zordur ve genellikle alan ölçekli deneyler ve modelleri genel kök mimarisinde bir parçası olarak gözden.
Terra ex kök saç çalışmalar, böyle Ağar kaplamalar üzerinde yetiştirilen Fideler itibaren bilimsel topluluk ile hücresel büyüme ve taşıma4,5değerli bilgiler sağladı. Ağar kaplamalar kök sistemleri dönüşlü ve gerçek zamanlı olarak yansıması için izin verirken, besin, bitki hormonları veya bakteri gibi deneysel tedaviler eklenmesi için yüksek çevre denetim sunmuyoruz. Ayrıca dinamik çevre denetim saglayan sırasında yüksek kararlılık düşsel kolaylaştırmak için gelişmekte olan bir çözüm mikrosıvısal platformlar bitki araştırmaları gelişiyle oldu. Bu platformlar tahribatsız büyüme ve yüksek işlem hacmi fenotipleme6,7,8,9, izole kimyasal tedaviler için birkaç bitki türlerinin görselleştirme etkinleştirdikten 10, kuvvet ölçümleri11,12ve mikroorganizmaların13eklenmesi. Mikrosıvısal platformu tasarımlar tek açık alan sıvı katmanlar içinde kökleri, büyüme veya tedavi sırasında içinde ve dışında optik odak kayması için kılı kök erişimine izin verme yaymak kullanımı odaklı olması.
Burada ana root olarak aynı görüntüleme uçağa fide kök tüyleri hapsetmesi tarafından önceki bitki-on-a-chip tasarımlar inşa fotoğraf ve yumuşak Taş baskı yöntemlerini kullanarak bir iki katlı mikrosıvısal platform geliştirmek için bir yordam mevcut. Bu kök saç geliştirme gerçek zamanlı, yüksek çözünürlükte ve deneysel bir tedavi süreci boyunca izlemek için bize izin verir. Bizim kodlamayla yöntemler içinde belgili tanımlık peron ve kültürlü için şırınga pompa ekipman kullanımı gerektirmez sulu ve steril bir ortamda bir haftaya kadar tohumdan germinated Arabidopsis thaliana fidan olanak sağlar. Bir kez sahip olduğu zaman hata görüntüleme deneyi, burada sunulan platformu ince kök özellikleri konumunu bozmadan açılabilir. Bu diğer yüksek çözünürlükte görüntüleme yöntemlerinin kullanımı sağlar. Burada biz temsilcisi sonuçları miktar ve kök saç Morfoloji bu platformda görselleştirme için optik, tarama elektron mikroskobu (SEM) ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) teknikleri sağlar.

<table><tbody><tr><td>Silikon Gofret</td><td>WRS Malzemeleri</td><td>100mm çap, 500-550um kalınlık, Prime, 10-20 direnç, N / Fos< 100></td><td></td></tr><tr><td>Quintel Kontak Hizalayıcı</td><td>Neutronix Quintel Corp</td><td>NXQ 7500 Maske Hizalayıcı</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>laboratuvar dokusu</td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimwipe KIMTECH SCIENCE Marka, 34155</td><td></td></tr><tr><td>Negatif Fotorezist Epoksi</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000s serisi</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist geliştirici</td><td>Microchem</td><td>Su-8 geliştirici</td><td></td></tr><tr><td>trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfloro-oktil) silan</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>kimyasal başlıkta kullanım</td></tr><tr><td>Hava Plazma Temizleyici</td><td>Harrick Plazma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Silikon elastomer bazlı</td><td></td></tr><tr><td>PDMS kürleme maddesi</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Silikon elastomer kürleme maddesi</td><td></td></tr><tr><td>Dessicator</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-000</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>X-acto bıçak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyopsi Punch</td><td>Ted Pella</td><td>15110-15</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan bant</td><td>Zımba</td><td>Görünmez Bant Mikrofüj</td><td></td></tr><tr><td>tüpü</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>J.T.Baker XI98-07</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır Suyu Kloroks</td><td></td><td>Konsantre</td><td></td></tr><tr><td>Bitki Bazlı Medya</td><td>Fito Teknoloji Laboratuvarları</td><td>M524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Teknova</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Balmumu filmi</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>Atomik Kuvvet Mikroskobu</td><td>Keysight Technologies</td><td>5500 PicoPlus AFM</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taramalı Elektron Mikroskobu</td><td>JEOL</td><td>7400</td><td></td></tr><tr><td>Çift Tabancalı Elektron Işınlı Evaporatör</td><td>Termiyonik</td><td>Özel Çift Elektron Tabancası Buharlaştırma Sistemi</td><td></td></tr></tbody></table>

kök saç morfoloji arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Kök tüyleri daha iyi su alımı ve bitki besin emilimi için kök yüzey alanını artırır. Küçük boyutlu ve sık sık doğal çevreleri tarafından obscured oldukları için kök saç morfoloji ve işlev çalışmaya zor ve genellikle bitki araştırmaları dışında. Son yıllarda mikrosıvısal platformlar kök sistemleri yüksek çözünürlükte görüntüleme sistemine aktarımı sırasında kökleri bozmadan görselleştirmek için bir yol teklifinde bulundular. Önceki bitki-on-a-chip araştırma burada sunulan yapılar Arabidopsis thaliana ana kök kök tüyleri olarak aynı optik uçağa sınırlamak için bir iki katlı aygıt dahil ederek mikrosıvısal platformu. Bu tasarım bir cep üzerinde kök tüyler miktar etkinleştirir ve organel düzeyde ve aynı zamanda deneysel tedaviler eklenmesi sırasında sürüklenen z ekseni engeller. Belgili tanımlık aygıt ezelî belgili tanımlık lüzum için Akışkan pompalar, fide için bir gnotobiotic ortamı korurken bir içerilen ve sulu ortamda saklamak açıklanmıştır. Optik görüntüleme deneyden sonra aygıtın demonte ve Atomik kuvvet veya elektron mikroskobu tarama iyi kök yapıları olduğu gibi tutmak için bir substrat kullanılır.

Burada açıklanan iki katlı PDMS mikrosıvısal cihazları ana Arabidopsis kök ve yanal büyüyen kök tüyleri (şekil 1A) sınırlamak için bir 20 µm yüksek odası için 200 µm yüksek kanal var. Bu tasarım için bitki türleri benzer kök çapı Arabidopsis thaliana kullanılabilir ve kolayca türler farklı boyutlarda. içerecek şekilde değişiklik Tasarım bir giriş bitki için yanı sıra istenen herhangi bir kimyasal veya biyolojik tedavi için 8 yan alı...

Bu makalede, ana kök ve kök tüyleri tek bir optik uçağı için confines bir iki katlı mikrosıvısal platformda Arabidopsis thaliana fidan kültür gösterilmiştir. Bu platform iyi kök morfolojisi de yüksek çözünürlüklü görüntüleme gelince gerçek zamanlı optik görüntüleme için başka araçlar tarafından kullanılabilir.

Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Bu mikroakışkan aralıklı kültür yönteminin genel amacı, bitkileri doğrudan tohumdan, aynı zamanda fidelerin köklerinin kontrollü tedavisi ve yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için de kullanılabilen yapılandırılmış bir ortamda yetiştirmektir. Bu yöntem, bitki kök büyümesinin birden fazla uzunluk ölçeğindeki fiziksel ve kimyasal sinyallere nasıl yanıt verdiği gibi, bitki biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu platformun temel avantajı, köklerin tek bir düzlemle sınırlandırılmış olmasıdır; bu da optik odak kaybı yaşamadan onları tedavi etmeyi ve görüntülemeyi mümkün kılar.Bugün bana University of Tennessee'de araştırma doçenti olan Dr. Sahar Hasim yardımcı olacak. Başlamak için, 10:1 oranında PDMS ve kürleme ajanını önceden hazırlanmış ve selenize edilmiş bir ana gofre (master wafer) üzerine dökün. PDMS'i bir vakum odasında gazdan arındırın ve ardından polimeri bir fırında 70 °C'de bir saat boyunca kürleyin.Ardından, PDMS cihazlarını kesmek için bir neşter kullanın ve onları kalıptan soyun. Daha sonra, köklerin ana kanala doğru büyümesini teşvik etmek için, 1,5 mililitrelik bir biyopsi pensini 45 derecelik bir açıyla kullanarak tohum girişini delin. Ayrıca, işlem girişlerini temizlemek için aynı pensi kullanın.Cihazdaki tüm kalıntıları temizlemek için yapışkan bant kullanın ve cihazı tasarım yüzeyi aşağı bakacak şekilde bir lam üzerine yerleştirin. Montaj tamamlandıktan sonra cihazları otoklavlayın. Arabidopsis thaliana tohumlarını bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve tohumları sterilize etmek için çamaşır suyu ve deterjan karışımı ekleyin.Ardından, tohumları steril su ile dört kez yıkayın. Sonrasında, tohumları mikro santrifüj tüpü içerisinde gece boyunca buzdolabında bekleterek stratifiye edin veya dört degrees celsius sıcaklıkta bir haftaya kadar saklayın. Steril cihazları kullanmadan önce, gaz geçirgen PDMS'den ve akışkan kanallardan havayı uzaklaştırmak için onları bir vakumlu gaz giderme odasına yerleştirin.Bu işlem, cihazların sonraki doldurma aşamasını iyileştirecektir. Cihazları vakum odasından çıkarın ve derhal pH değeri 5.7 olan, dörtte bir konsantrasyonda bitki tabanlı besiyeri ile dolu bir petri kabına daldırın. Bir pipet kullanarak, cihazı doldurmak için girişlerden sıvı çekin.Cihazları ayrı, taze ve kuru petri kaplarına aktarmadan önce, kanallar içinde hava kabarcığı kalmadığını görsel olarak kontrol edin. Ardından, agar seviyesi cihazın üst kısmıyla neredeyse aynı hizaya gelene kadar cihazın etrafına sıcak agar dökün. Steril bir ortamda, küçük bir pipet kullanarak her bir cihazın girişine bir adet sterilize edilmiş tohum aktarın.Ardından, her bir petri kabını wax film ile kapatın ve oda sıcaklığındaki ışık-karanlık döngülü bir büyüme odasına yerleştirin. Yerçekiminin köklerin kanal boyunca büyümesini teşvik etmesi için petri kabını büyüme odasında oda sıcaklığında dikey olarak konumlandırın. İstenen zamanda ve fidelerin gelişmişlik düzeyine göre, bir pipet kullanarak cihazların sekiz yan portunun her birine belirlenen miktarda deneysel işlem uygulayın.İşlem tamamlandığında, petri kaplarını balmumu film ile yeniden mühürleyin. Ardından, kapları büyüme odasına geri yerleştirin. Ters aydınlık alan mikroskobunun büyütmesini 4x ile 20x arasına ayarlayın.Cihazı ve fideyi içeren petri kabının tamamını, parlak alan veya diferansiyel girişim kontrastlı görüntüleme için mikroskobun altına yerleştirin. İlgilenilen morfolojik özellikleri belirginleştirmek için pozlama sürelerini, lamba parlaklığını, apertürü ve ışığın polaritesini ayarlayarak aydınlatma koşullarını optimize edin. Ardından, tablasını kökün istenen bölgesine sürün ve ilgili köke veya kök tüyüne odaklanın.Kök tüylerinin büyümesini görselleştirmek için tek bir zaman noktası veya bir zaman serisi görüntü alımı gerçekleştirin. Zaman serisi için, büyüyen kök tüylerini dakikada bir görüntüleyin. Ana kökün büyümesini görselleştirmek için her 30 dakikada bir görüntü alın.İşlem tamamlandığında, petri kabını ve fideleri dikey konumda büyüme odasına geri yerleştirin. Fideler istenen süre boyunca büyüdükten sonra, lamel ve düzeneği agardan çıkarmak için bir pens kullanın. Ardından, bir laboratuvar mendilini etanol ile ıslatın ve bunu lamelin alt kısmını temizlemek için kullanın.63x yağ daldırma objektifine uygun yağı uygulayın ve lameli mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, tabloyu objektifteki daldırma ortamıyla temas edecek şekilde yükseltin. Pozlama sürelerini, lamba parlaklığını, diyaframı ve ışığın polaritesini ayarlayarak aydınlatma koşullarını optimize edin.Ardından, sahneyi kökün istenen bölgesine sürün ve ilgilenilen kök tüylerine odaklanın. Kök tüyü büyümesini zaman içinde nicelleştirmek için yazılımı, ilgili konumda dakikada bir görüntü alacak şekilde ayarlayın. Bitki otofloresansını veya floresan işaretleyicilerini görüntülemek için, tanımlanabilir bir floresan sinyalini korurken floresans pozlama süresini minimize edin.Organellerin görüntülerini, pozlama süresinin izin verdiği en hızlı şekilde edinin. Fideler istenen süre boyunca büyüdüğünde, cihazı ve lamelli petri kabından çıkarın. Cihazı ters çevirin ve kökün PDMS kanalı içinde kalmasını sağlayacak şekilde lamelli nazikçe soyarak ayırın.PDMS cihazını, altınla mikro kaplanmış gibi düz ve yansıtıcı bir alt tabaka üzerine yerleştirin ve ardından cihazı, kök tarafı yukarı gelecek şekilde AFM numune tutucusuna monte edin. PDMS cihazının üzerine bir sıvı kuyusu aparatı sabitledikten sonra, görüntüleme sırasında köklerin nemli kalmasını sağlamak için içini suyla doldurun. Numune AFM'ye yüklendikten sonra, PDMS cihazının kalınlığına göre z kontrolünü ayarlayın ve kantileveri kök üzerindeki ilgi bölgesine yönlendirin.Yönlendirme için bir kamera kullanarak lazeri konsolun ucuna hizalayın ve tarama sırasında köke minimum kuvvet uygulamak için temas modu görüntüleme kullanın. Konsol numuneye temas edene kadar tarama mekanizmasını yavaşça indirin. Ardından, istenen bölge için tarama boyutunu ayarlayın ve hat başına 256 voltaj noktası ile saniyede bir hat şeklinde bir tarama hızı seçin.Son olarak, taramayı gerçekleştirin. Burada açıklanan iki katmanlı PDMS mikroakışkan cihazlar, ana Arabidopsis kökü için 200 µm yüksekliğinde bir merkez kanala ve yanal olarak büyüyen kök tüylerini sınırlamak için iki adet 20 µm yüksekliğinde yan hazneye sahiptir. Bu, kök tüylerinin ana kök ile aynı görüntüleme düzleminde olmasını sağlar.Mikroakışkan platform içerisinde, kök tüyleri; uzunlukları, yoğunlukları ve kökten büyüme açılarının hücresel düzeyde nicelendirilmesi mümkündür. Mikroakışkan platform kullanmanın en büyük avantajlarından biri, organizmalara hassas konsantrasyonlarda kimyasal uygulamaların homojen bir şekilde ekleme kapasitesidir. Burada, bir fide, floresan işaretli karboksile polistiren boncukların eklenmesinden önce ve sonra görüntülenmiştir.Bu abiyotik işlemin eklenmesi, fidelerin kök tüylerinin optik odak yönelimini bozmamıştır. Floresan işaretleyiciler kullanılarak, bir kök tüyündeki sitoplazmik akış görülebilmektedir. Bu üç organelin hareketi, bu kümülatif dağılım grafiğinde yakalanmıştır.Optik görüntülemenin yanı sıra bu platform, köke zarar vermeden demonte edilebilme özelliği sayesinde AFM ve SEM görüntülemeye de olanak tanır. Bu prosedürü takiben, kök çevresindeki kimyasal profillerin nasıl göründüğü gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla kimyasal görüntüleme dahil diğer yöntemler uygulanabilir.

imaging-root-hair-morphology-arabidopsis-seedlings-two-layer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz perfluorodecalin infiltratif montaj aracı olarak kullanımı açıklanmaktadır. Bu görüntüleme derinliğini artırmak için basit bir yöntem.

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

Bu makale RootChip içinde Arabidopsis fide ekimi için bir protokol, mikroskobik kök izleme ve hücre içi metabolit düzeylerinin FRET tabanlı ölçümü ile büyüme koşullarını otomatik kontrol birleştiren bir mikroakışkan görüntüleme platform sağlar.

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen düz yataklı tarayıcı kullanılarak bir yerçekimi uyarana yanıt Arabidopsis fide görüntülerin hızla toplanması için bir işlemi tarif etmektedir. Yöntem aşağı analiz algoritmaları için mükellef yüksek çözünürlüklü görüntüleri, ucuz, yüksek hacimli yakalamak için izin verir.

Arabidopsis Kök Gravitropic Müdahale Yüksek çözünürlüklü Zaman lapsed Resim Toplama Masaüstü Tarayıcılar kullanma

Ca 2 + sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda 2+ sinyaller.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca 2+ Sinyalleri

Bu protokol, ışık tabakası mikroskobu için bir bitki örneği hazırlama yöntemini gösterir. Kurulum, bitkinin bir jelin yüzeyine dikey olarak monte edilmesi ve kontrollü parlak koşullarda büyümesine izin verilmesiyle karakterize edilir. Bu, standartlaştırılmış koşullarda bitki organ gelişiminin uzun süreli gözlemlenmesini sağlar.

Bir Gel Yüzeyinde Büyüyen Bitki kökleri Işık Sac Flüoresan Mikroskopi

Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

Burada, yüksek numerik diyafram açıklığı hedefleri ve daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılarak 3 güne kadar kök ve hipokotil gelişiminin yüksek çözünürlüklü konfokal zaman atlamalı görüntülemesi için basit bir teknik sunulmuştur.

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

İpucu büyüyen bitki hücreleri polen tüpler, kök tüyleri, dahil olmak üzere, kapasitesini araştırmak ve protonemata son derece dar geçitlerden (~ 1 µm) uzamış, bir mikrosıvısal cihazda moss bir yöntem açıklanmaktadır.

İpucu büyüyen bitki hücreleri son derece küçük alanlarda uzama yeteneğini çalışmaya mikrosıvısal cihazların geliştirme

Burada, bir mikroakışkan çip ve neovaskülarizasyonun ilk mikroçevresini yeniden sağlayan, endotel hücrelerinin (VC' ler) yüksek luminal kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve çeşitli vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) dağılımı ile aynı anda uyarılmasını sağlayan otomatik olarak kontrol edilen, yüksek verimli bir sirkülasyon mikroakışkan sistemi sağlıyoruz.

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Atomik kuvvet mikroskobu girinti protokolü, normal veya kısıtlı büyüme sırasında (yani su açığı altında) bir doku veya organın belirli bir hücresinin hücre duvarının fiziksel özelliklerinin rolünü inceleme imkanı sunar.

Canlı Arabidopsis Köklerinin Epidermal Hücrelerinin Fiziksel Özelliklerini İncelemek için Atomik Kuvvet Mikroskobu

Öğrenin Arabidopsis thaliana fidanlarının kök morfolojisini iki katlı mikroakışkan platformda yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemi. Bu teknik bitki biyolojisinde kök büyümesi dinamiklerini incelemek için değerli bir araçtır.

Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Daha fazla video keşfet