Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin
28 Şubat 2019
Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.
Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi, tek molekülleri kuvvetle manipüle etmemize izin vererek atomik ölçekte moleküler biyoloji hakkında muazzam bilgiler sağlayabilir. Burada, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sabit bir hız ölçümü gösteriyoruz. Sonuçta protein kararlılığını belirlemek için verileri kullanabilirsiniz, açılma hızı, ve açılma yolu.
Yordamı başlatmak için, 15 milimetre genişliğindeki temiz bir demir diske iletken olmayan bir yapışkan sekmesi takın. Kapak sayfasını çıkarın ve açıkta kalan yapıştırıcının üzerine temiz, kaplamasız veya altın kaplı cam bir kaydırağa sıkıca basın. Kaydırağı temiz, kapalı bir Petri kabında saklayın.
Daha sonra, arınmış poliproteini bir santrifüj süzgeçte yoğunlaştırın, ardından kolontersine çevirin ve deneyde kullanılmak üzere proteini tampona dönüştürün. 280 nanometredeki absorbansa göre uygun protein konsantrasyonu belirleyin ve sonra proteinin mililitre çözeltisi başına 100 mikrogram 100 mikrolitre hazırlayın. Protein çözeltisinin 60 mikrolitrelik damlasını slaytın ortasına uygulayın.
Bu, deney sırasında kontrolsüz numune hareketlerine yol açacağından, sıvının slayt ve demir disk arasında kaymasına izin vermemeye dikkat edin. Numune nin oda sıcaklığında en az 10 dakika oturmasını bekleyin. İlk olarak, dikkatlice sonuna kadar kantilever almak ve sonda tutma hücresine yerleştirin.
Kantilin sıkıca oturduğundan emin olun. Ardından tutucu hücreyi AFM kafasına yerleştirin. Başı ters bir mikroskop aşamasına ayarlayın ve lazere güç sağlamak için bir pil takımını AFM kafasına bağlayın.
Bir monitör veya TV ekranında lazer ışığını görselleştirmek için mikroskop dedektörü için bir kamera ayarlayın. Mikroskop tarafından yönlendirilen lazer, kantilever ucuna yönlendirilen şekilde konumlandırın. Numune hazır olduğunda, deney tamponunun 10 mikrolitresini sonda tutan hücrenin her bir noktasına boşaltın.
Örnek slayttan yaklaşık 40 mikrolitre sıvı çıkarve 40 mikrolitre arabellek ekleyin. Bu arada, ölçüm için atomik kuvvet mikroskobu hazırlamaya başlayın. İlk olarak, piezo motor üzerinde mıknatıs üzerinde slayt yerleştirin.
AFM aşamasının yüksek konumda olduğunu doğrulayın ve afm kafasını örnek damlacıkların üzerinde kantilever ile sahneye yerleştirin. Ardından, AFM fotodiyotunun önüne küçük bir kağıt parçası yerleştirin. Kağıt üzerindeki nokta parlak ve odaklanmış olana kadar lazeri ayarlayın ve sonra kağıdı çıkarın.
Fotodiyottan gelen sinyali görüntülemek için AFM yazılımını başlatın. AFM kafa aynasını lazer sinyalinin dört fotodiyot çeyreğinde de maksimize edilebis ve üst ve alt dörtlü çiftleri arasında farklı bir sinyal sıfır olacak şekilde ayarlayın. AFM'yi kalibre etmeye başlamak için, AFM kafa sinyali için filtre ayarını tam bant genişliğine çevirin ve piezo'nun kapalı olduğundan emin olun.
AFM yazılımında, hesaplama başına 1,024 veri puanı yla güç spektrumunun ortalama 512 hesaplamasını ölçün. Güç spektral yoğunluğunu ilk tepeye entegre edin, bu da kantilin ana titreşim moduna karşılık gelir. Ardından, piezo denetleyicisini açın ve filtreyi 500 Hertz'e ayarlayın.
Farklı sinyali izlerken AFM kafasını birkaç yüz mikrometre aşağı doğru hızla hareket ettirin. Farklı sinyal tutarlı atlar izlerken bir seferde birkaç yüz mikrometre aşağı baş hareket devam edin. Sinyal atlayışları yüksekliği artmaya başladığında, uç örnek yüzeye çok yakındır.
Sapma sinyali yüzeyle uç teması nda doygunlaştığında, başı hafifçe kaldırın, ardından örnek yüzeyi bulmak için AFM kafasını 100 ila 5 000 nanometre yukarı veya aşağı hareket ettirecek piezo gerilimini ayarlayın. Bundan sonra, uç yüzey, ya da piezo motor seyahat yaklaşık 100 nanometre temas böylece yaklaşık 500 nanometre bir tarayın bir çekme deneyi yapın. Yay sabitini ve hassasiyetini hesaplamak için sonuçları kullanın.
Yazılımda, tbmm boyutunu ortaya çıkan poliproteinin toplam teorik boyutundan %40 daha büyük olarak ayarlayın. Kantili, tazyim boyutunun %80'ini yüzeyden uzakta olacak şekilde yerleştirin. Tarayın hızını saniyede 300 nanometreye ayarlayın.
Bir çekme deneyi gerçekleştirin ve elde edilen piezo konumunu ve fotodiyot sinyalini ölçün. Numunenin kurumasını engellemek için ölçüm boyunca sıvı hücresine saat başı deney arabelleği ekleyin. Bir I91 poliproteininin ve üç I91 etki alanının her iki taraftaki NI10C molekülünü kuşattığı bir poliproteinin kayıtlarında ortaya çıkan olaylar, solucan benzeri bir zincir modeliyle donatılmıştır.
Her iki kayıt da I91'in karakteristik kuvvetini ve kontur uzunluğu artışlarını göstererek AFM kalibrasyonunun başarılı olduğunu gösterir. N110C molekülünü içeren poliproteinkayıtları, yeni olayların ortaya çıkan ilgi proteininden geldiğini doğrulayacak kadar I91 olayı gösterdi. Ankyrin tekrarı için ortalama kontur uzunluğu yaklaşık 10.5 nanometre, ve açılma kuvvetleri sekiz ila 25 pikonewton arasındaydı.
Bir poliprotein kullanmak çok önemlidir çünkü yan proteinlerin gelişen olayları tek molekül olayını parmak izi için pozitif bir kontrol sağlar. Bu olmadan, veriler yanlış yorumlamaya karşı sorumludur.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak tek protein moleküllerinin mekanik özelliklerinin ve açılma yollarının ölçülmesi prosedürlerini detaylandırmaktadır. Tek molekül kuvvet spektroskopisi aracılığıyla protein stabilitesi ve açılma hızları hakkında bilgiler sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyofizik
- Moleküler Biyoloji
- Tek Molekül Teknikleri
Arka Plan
- Tek molekül kuvvet spektroskopisi, bireysel moleküllerin manipülasyonunu sağlar.
- Atomik kuvvet mikroskobu, bu ölçümler için önemli bir araçtır.
- Protein mekaniğini anlamak, biyolojik süreçler hakkında bilgiler edinmek için kritik öneme sahiptir.
- Elde edilen veriler, protein stabilitesi ve açılma mekanizmaları hakkında bilgi sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Proteinlerin mekanik özelliklerinin ölçülmesini göstermek.
- Tek protein moleküllerinin açılma yollarını göstermek.
- İyi tek protein kayıtları için bir referans sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak sabit hız ölçümleri.
- Yapışkan sekme ve cam slaytlar kullanarak numunelerin hazırlanması.
- Hazırlanan slaytların temiz koşullarda saklanması.
- Protein stabilitesi ve açılma hızlarını belirlemek için verilerin analizi.
Ana Sonuçlar
- Tek protein molekülü mekaniğinin başarılı ölçümü.
- Açılma yollarının ve oranlarının tanımlanması.
- Metodolojik doğrulama için temsili sonuçlar sağlanmıştır.
- Moleküler seviyede proteinlerin stabilitesi hakkında bilgiler sağlanmıştır.
Sonuçlar
- Atomik kuvvet mikroskobu, tek protein mekaniğini incelemek için etkilidir.
- Veriler, protein davranışı hakkındaki anlamayı önemli ölçüde geliştirebilir.
- Metodoloji, gelecekteki tek moleküllü çalışmalar için bir rehber görevi görmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Single-molecule force spectroscopy using atomic force microscopy (AFM) enables direct quantification of protein mechanical stability and unfolding pathways, providing mechanistic insight not accessible through bulk assays. This capability is critical for de-risking early-stage target validation and informing predictive models of protein behavior under physiological stress. Integrating AFM-based measurements into discovery workflows enhances confidence in target selection and supports risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Directly quantifies protein stability and unfolding rates at the single-molecule level.
- Enables mechanistic de-risking by revealing high-energy conformational states.
- Supports functional target validation through precise measurement of unfolding events.
- Improves predictive confidence in target selection by clarifying folding pathways.
Screening & Assay Development
- Establishes validated mechanical fingerprints for protein constructs used in downstream assays.
- Facilitates reproducible, quantitative readouts for assay standardization.
- Enables robust comparison of protein variants or engineered constructs.
- Supports screening readiness by confirming assay system integrity at the molecular level.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biophysical measurements with disease-relevant protein misfolding or instability.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by linking molecular mechanics to functional outcomes.
- De-risks translational advancement by confirming mechanistic hypotheses in physiologically relevant conditions.
Pipeline & Workflow Integration
AFM-based force spectroscopy fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational data for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on protein folding and stability mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative mechanical readouts for assay qualification.
- Analytics: Provides force-extension curves and contour length measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges molecular biophysics with preclinical model selection when protein misfolding is implicated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing diverse protein targets across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-molecule measurements for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of protein-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and single-molecule data analysis.
- Demands specialized instrumentation and calibration protocols.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for data comparability.
- Adaptation may be needed for different protein constructs or buffer conditions.
- Interpretation depends on robust positive controls to avoid data misattribution.
