Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları

Bu adeno-ilişkili virüs vektör gen transferinin genel amacı, sıçanın beynini ve omuriliğini geniş bir ölçekte genetik olarak manipüle etmektir. Bu yöntem, gen transferi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Genleri in-vivo olarak tanıtmanın çok etkili bir yoludur ve bu nedenle çok güçlü, çok yönlü bir tekniktir.

Bu prosedür hem hızlı hem de yüksek oranda tekrarlanabilir. Bu geniş ölçekli gen transferi yaklaşımını, çeşitli yayınlarda sıçanların omuriliği boyunca amyotrofik lateral skleroz ile ilişkili bir proteini eksprese etmek için kullandık. Meslektaşım Robert Dayton prosedürü gösterecek.

Mychal Grames, Robert'a yardımcı olacak. İş istasyonunu hazırlayarak başlayın, önce yüzeyi %70 etanol ile temizleyin. Ardından çalışma alanına bir ısıtma yastığı yerleştirin ve 37 santigrat dereceye kadar ısınmaya ayarlayın.

Isıtma yastığının üzerine bir tezgah pedi yerleştirin. İşlem için yeterli oksijen ve izofluran olup olmadığını kontrol edin. İndüksiyon odasını ve anestezi maskesini %70 etanol ile temizleyin ve anestezi maskesini tezgah pedinin üzerine yerleştirin.

Aşağıdakilerin elinizde, hayvan başına yaklaşık 5 x 5 santimetrelik bir parafin film karesi, bir alkol hazırlama pedi ve hayvan başına iki veya üç gazlı bez, pipet uçları ve bir mikropipet olduğundan emin olun. Ardından, vektörü oda sıcaklığında çözün ve her hayvan için bir steril mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin. Gerekli hacimdeki AAV'yi uygun tüpe pipetleyin ve hacmi emzirilmiş zil çözeltisi veya salin ile istenen enjeksiyon hacmine getirin.

Numuneyi bir veya iki saniye vorteksleyin ve ardından numuneyi tüpün dibine getirmek için beş saniye boyunca santrifüj atın. Toplam enjeksiyon hacmini tüpten dışarı ve parafin filmin karesine pipetleyin. Ardından, bir mililitrelik bir şırıngaya 30 gauge bir iğne yerleştirin.

İğneyi, eğim aşağı bakacak şekilde parafin film üzerindeki vektöre yerleştirin. Tüm virüs iğne ve şırınganın içine girene kadar şırınga pistonunu geri çekin. Anestezi sistemini kullanarak fareyi uygun şekilde uyuşturun.

Bir ayak parmağı tutamına reaksiyon olmamasıyla yeterli bir anestezi düzlemi sağlayın. Ardından, fareyi yan tarafındaki çalışma alanına yerleştirin ve burun konisini kullanarak anesteziyi sürdürün. Sıçan yan yatarken, bir yan kuyruk damarı yukarı bakmalıdır.

Enjeksiyon, kuyruğun uzunluğunun üçte ikisi kadardır. Enjeksiyon bölgesini alkol hazırlama pedi ile silin. Kuyruğu enjeksiyon alanının biraz üzerinde sıkıca tutun, bir parmağınız doğrudan yanal kuyruk damarının üzerinde, bu damarı genişletecektir.

Eğim yukarı bakacak şekilde, iğneyi görünür kuyruk damarı ile aynı yönde hizalayın. Diğer elin kuyruğu tutmasını ve kuyruk damarına bastırmasını önlemek için büyük özen gösterirken cildi kuyruk damarının üzerinden delin. Normal kan akışına izin vermek için kuyruk damarındaki basıncı boşaltın.

Sonra iğneyi damarın içine sokun. İğnenin kuyruk damarını deldiğinden emin olmak için pistonu hafifçe geri çekin. İğne damar içindeyse, kan iğneye akacaktır.

Gerekirse iğneyi yeniden konumlandırdıktan sonra, şırınganın ucunu kuyruğa doğru tutarak iğneyi sabitleyin. Vektörü saniyede yaklaşık 20 mikrolitre hızla kuyruğa yavaşça enjekte edin. Kötü bir enjeksiyon durumunda, hayvan sadece kısmen transdüksiyona uğrayacak ve sonuçlar muhtemelen yararlı olmayacaktır.

Bununla birlikte, pratikte, iyi enjeksiyonlar çok tekrarlanabilir ve güvenilirdir. Vektör uygulanmışsa, iğneyi kuyruktan çıkarın ve kanamayı 30 ila 60 saniye boyunca durdurmaya yardımcı olmak için enjeksiyon bölgesine bir gazlı bez bastırın. İzofluran anestezisini ve oksijeni kapatın.

Sıçan bilincini geri kazanana kadar izleyin ve ardından kafesine geri koyun. AAV ile kontamine olabilecek malzemeleri uygun bir biyolojik tehlike kabına atın ve iş istasyonunu %70 etanol ile temizleyin. AAV enjekte edilmiş bir hayvanın sabit ve kriyo korumalı beyninden, dondurma aşamasına sahip kayan bir mikrotom kullanarak 50 mikron koronal kesitler elde edin.

GFP için immün boyamadan ve slaytlara monte edildikten sonra, bir mikroskop kullanarak düşük büyütmeli bir lens ile tanımlanan ilgi alanındaki her bölümü fotomikrografla fotoğraflayın. Analiz edilecek tüm örneklerde kamera ayarlarını aynı tutun ve verileri TIFF dosyaları olarak kaydedin. Fotomikrografı yaygın olarak bulunan Scion Image programında açın.

İki pencere açılacak, indeks rengi olarak gösterilen pencereyi kapatın. Seçenekler'i ve ardından yoğunluk dilimi'ni seçin. Arama tablosu penceresinde bir dizi renk tonu kırmızı renkle gösterilir.

Pencerede, imleci yalnızca belirli GFP etiketini doldurmak için kullanın ve görüntüde belirli olmayan arka plan alınmaya başladığında durdurun. Ardından, analiz et'i tıklayın ve ölçeği ayarlayın. Dördüncü satır, açılır listeden birimler demeli, pikselleri seçmeli ve ardından Tamam'ı tıklamalıdır.

Floresan alanı ölçmek için Çözümle'ye ve ardından ölç'e tıklayın. Ardından, analiz et ve sonuçları göster'i tıklayın. Bir sonuç penceresi açılacak ve floresan alan ölçümü, alan etiketli başlığın altında olacaktır.

Tüm ölçümler kaydedildikten sonra, hayvan başına üç ila altı bölüm arasındaki değerlerin ortalamasını alın. Gruplar arasında geçiş yapılan alanları karşılaştırmak için uygun bir istatistiksel test kullanın. Bu temsili görüntü, AAV 9 GFP'nin kuyruk veni enjeksiyonundan dört hafta sonra, sıçan serebellumunda GFP immünofloresansını göstermektedir.

Floresan alanı seçici olarak vurgulamak ve vurgulanan pikselleri ölçmek için görüntü analiz yazılımı kullanıldı. Bu, transdüksiyon yapılmamış bir hayvandan alınan GFP görüntüsüdür. GFP enjekte edilen hayvan için aynı parametreler kullanılarak bu görüntünün analizi, çok düşük bir arka plan sinyali seviyesi tespit eder.

Bir kez ustalaştıktan sonra, enjeksiyon sıçan başına yaklaşık beş dakika içinde yapılabilir. Sonuç olarak, bu teknik, genleri sıçan CNS'sine verimli bir şekilde tanıtmanın bir yolunu açıklar, bir kerelik bir gen iletimi, kalıcı ekspresyon ve uzun vadeli etkiler üretir. En önemlisi, merkezi sinir sistemi çevreden manipüle edilir.

Nispeten invaziv olmayan bir intravenöz vektör enjeksiyonu, beyin ve omuriliğe, CNS'ye ulaşır.