Name: Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Öğrenin adeno ilişkili virüs vektörleriyle sıçan merkezi sinir sistemine gen transferi yöntemini. Bu teknik, gen tedavisi ve nörolojik hastalıkların incelenmesi için hızlı ve güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser ALS Derneği, Karyopharm tedavi, Inc, Meira GTx ve Thomas Lawson, kendisi için minnettarız ALS araştırma için bir hayırsever bağış tarafından finanse edildi. Biz Elysse Orchard ve Donna Burney tavsiye ve eğitim için teşekkür ederiz. JAS yalan Vakfı tarafından desteklenen ve ulusal sağlık Enstitüleri GM103418 verin.

tüm yordamları uygun NIH yönergeleri takip etti. Tüm yordamları hayvan bakım ve kullanım Komitesi LSU Sağlık Bilimleri Merkezi Shreveport'taki tarafından onaylanmış hayvan iletişim kuralları izledi. Kadın Sprague-Dawley Rat 6 hafta-in yaş, bu yordam için kullanıldı.
 1. vektör gerekli doz/hacimleri belirlemek <ol><li>enjekte edilir ve viral vektör her hayvan için gerekli miktarını belirlemek farelerin tabanlı vektör hazırlık titresi (konsantrasyon) üzerinde tartmak. Daha önce sıçan CNS verimli ifade için başarılı olmuştur vektör dozlarda kullanın (Jackson ve ark bkz. 6). Not: AAV9 TDP-43 için ya da AAV9 GFP, tipik bir doz ise 3 x 10 13 arasında - 1 x 10 14 vektör genleri/kg. 6 hafta-in yaş, genç yetişkin fareler tartmak 150 g.</li>
	<li>Sistematik karşılaştırmalar için tüm hayvanlarda kg başına eşdeğer doz olun. Ses standart tavsiye enjeksiyon birimleri (250-500 µL için 250 gr iri fare) fazla olamaz emin olun. Genç Yetişkin fare için 200 μl tipik enjeksiyon birimdir.</li>
</ol> 2. İş istasyonu hazırlamak <ol><li>tüm gerekli malzemeleri toplamak: bir parafin film kare (yaklaşık 5 x 5 cm) hayvan, hayvan, gazlı bez yastıkları (hayvan başına 2-3), başına bir alkol hazırlık yastık başı damlalıklı ipuçları ve bir micropipette.</li>
	<li>% 70 etanol ile yüzey Temizleme tarafından çalışma yüzeyi hazırlamak. Bir Isıtma yastığı (~ 37 ° C) düşük ayarla sıcaklık ile yerleştirin. Bir tezgah yastık Isıtma yastığını üstüne yerleştirin.</li>
	<li>Gaz anestezi (isoflurane) hazırlayın. Yeterli oksijen ve gaz anestezi prosedürü için emin olun. İndüksiyon odası ve anestezi maskesi % 70 etanol ile temiz ve anestezi maskesi tezgah rampasında yer.</li>
</ol> 3. Vektör hazırlamak <ol><li>oda sıcaklığında vektör çözülme ve her hayvan için bir steril microcentrifuge tüp etiket.</li>
	<li>AAV hacmi belirlenen damlalıklı 1.1 uygun tüp içine adım ve istenen enjeksiyon hacmi (burada, 200 μl) kadar birim ile lactated zil getirmek &#39; s çözüm ya da serum.</li>
	<li>Darbe girdap 1-2 s için örnek ve santrifüj 5 için nabız tüp alt örnek getirmek s.</li>
	<li>Damlalıklı tüp ve parafin film kare üzerine fare için toplam enjeksiyon hacmi.</li>
	<li>1 mL şırınga 30 gauge iğne yerleştirin.</li>
	<li>İğne eğimi parafin film vektör içine aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Tüm virüs iğne ve şırınga olana şırınga pistonu geri çek. Uygulama ile daha kolay olur iğne içine hava kabarcıkları çizim önlemek dikkatli olun.</li>
</ol> 4. Fareyi hazırlamak <ol><li>1 L/dk'ya kadar oksijen açın ve isoflurane anestezi %5 için ayarlayın. Gaz anestezi indüksiyon odasına tüm bağlantı hortumları ve stopcock yönleri kontrol ederek akan olun.</li>
	<li>Fare yanıt vermiyor kadar gaz anestezi indüksiyon odasında yaklaşık 3 dakika, fareyi koyun.</li>
	<li>Ayak parmak pinching tarafından yeterli anestezi derinliği sağlamak. Ayak çimdik sonra ayak veya bacak hareket yok olmalıdır.</li>
	<li>Anestezi bakımı için % 2 isoflurane anestezi azaltmak ve anestezi anestezi maskesi akan stopcock ayarlayın.</li>
	<li>Fareyi yer &#39; s burun anestezi maskesi ve yan tarafında yatıyor sıçan ayarlayın.</li>
	<li>Tanımlamak yan kuyruk ven. 
	Not: Yan kuyruk damarlar yalan yaklaşık 10 ve 2 o &#39; saatiyle 12 olarak kuyruk sırt üstünde o &#39; saat. Yan tarafında yalan fare ile yatay kuyruk ven yukarı bakmalıdır</li>
	<li>Alkol hazırlık pad ile enjeksiyon alanı silin. Üçte iki kuyruk uzunluğu aşağı enjeksiyon sitedir.</li>
</ol> 5. Vektör enjekte <ol><li>sıkıca kuyruk biraz enjeksiyon alanı tek parmakla üzerindeki doğrudan yanal kuyruk damar üzerinde tutun; bu damar genişletmek.</li>
	<li>Eğimi ile aynı yönde görünür kuyruk ven ile iğne hizalamak, karşı karşıya.</li>
	<li>Deri alarak büyük bir özen diğer yandan kuyruk tutarak ve kuyruk ven basarak önlemek için ise kuyruk damar üzerinde pierce.</li>
	<li>Yayın normal kan akışı için izin vermek kuyruk ven baskısı.</li>
	<li>İğne damar içine taşıyın. İğne kuyruğu damarı delmiş emin olmak için geri biraz pistonu üzerinde çek. İğne damar ise, kan iğne akacaktır.
	<ol><li>Yeniden konumlandırmak gerektiği gibi iğne. Sonra iğne stabilize etmek için el enjeksiyon sitenin altındaki enjeksiyon siteye yukarıda taşıyıp şırınga sonu karşı kuyruk tutun.</li>
	</ol></li> <li>Yavaş yavaş vektör kuyruk (yaklaşık 20 µL/s) enjekte. 
	Not: Damar vektör akıyor olarak renk kaybı olabilir. Çözüm ven dışında enjekte edildi işaretleri dahil blebbing, deri veya direnç vektör enjekte zaman sarararak. Uygulama ile ekstra vasküler pozlama en aza indirilebilir.</li>
	<li>Vektör yönetilen sonra fare iğneden kaldırmak ve 30-60 s. için sıra kanamada yardımcı olmak için enjeksiyon izi karşı bir gazlı bez yastık tuşuna basın</li>
</ol> 6. Temizlik <ol><li>isoflurane kapat anestezi ve oksijen. Bilincinin tekrar yerine geleceğinden sıçan izlemek ve onun kafes dönün.</li>
	<li>Dikkatle tüm iğneler "Sharps" kapsayıcısına getirin. AAV ile uygun biohazard konteyner içine kontamine potansiyel olarak diğer tek kullanımlık malzeme atmayın. Çalışma istasyonları % 70 etanol ile temizlik.</li>
</ol> 7. Hindlimb kaçış refleks değerlendirmek Not: Hindlimb açıkları genellikle 2-6 hafta sonra TDP-43 gen transferi, vektör doz bağlı olarak ortaya.
<ol><li>Üzerinde düz yüzey net enkaz bir iki parmak ile fare kapmak &#39; s kuyruk yaklaşık 2 cm vücuttan. Ön ayakları sıçan ventral alt görüntülerken asılı olan kadar fareyi yavaşça kaldır.
	<ol><li>Gerçekleştirme yordamı haftalık boyunca deneysel zaman-gen transferi sonra (örneğin, yukarı 12 hafta sonrasına gen transferi). 
		Not: Ayrıca forelimb açıkları bu şekilde Puan edinildi ama hindlimb açıkları bağlı olarak kullanılan vektör doz bu modelde oluşma olasılığı daha.</li>
	</ol></li> <li>Hindlimbs Eğer bir veya her iki hindlimbs orta hat 10 sırasında doğru sıkmak için 10 s. Not gözlemlemek s.</li>
	<li>Tekrar toplam 30 ile üç kez sınava s denemeler arasında. Eğer bir veya her iki hindlimbs her üç denemeler için kenetlenmişdurumda, fare motor fonksiyon bozukluğu gösteriyor. Tüm üç denemeler kenetlenmesi tutarlı ise verilerini (el ile notlar) ya da tek taraflı veya iki taraflı hindlimb açığı mevcut kayıt.</li>
</ol> 8. Rotarod üzerinde motor işlevleri değerlendirmek rotarod ayarlamak için <ol><li>rotarod altında bir tezgah yastık yerleştirin ve ivme üzerinde 2 dk (oranını artırır tarafından ~0.3 d/d/s) 4-40 devir / dakika (devir/dakika) ayarlayın. 12 haftalık zaman-kurs için konularda çalıştırmak 2, 4, 8 ve 12 hafta sonra gene transfer.</li>
	<li>İzin ver 20 dakika süreyle test odasına alışmana sıçan</li>
	<li>Rotarod ilk kez kullanmak için fare tren ilk set 4 rpm hızında rotarod başlayın, sonra fareyi üzerinde rotarod yerleştirin. 4 RPM bir tam devrim için yürümek, o zaman ivme başlamak fareyi izin ve sıçan kadar düşüyor rotarod üzerinde yürümek izin. Fareyi sürekli olarak en az 40 için yürüyüş yapabilirsiniz kadar eğitim devam s. Sağlıklı, genç bir yetişkin fare kolayca bu şekilde eğitilecek.
	<ol><li>Bir göze çarpan motor bozukluğu olan bir sıçan söz konusu olduğunda hangi engelleyebilir sıçan 40 / düşmeye temel gecikme süresi elde s, fare rotarod puanlama başlamadan önce 3-5 Eğitim girişimleri sağlamak.</li>
	</ol></li> <li>Rotarod test başlamak için fareyi üzerinde rotarod yerleştirin ve rotarod ivme başlatmak. Not fareyi rotarod denk zaman; Bu sonbahar için gecikme süresi olur. Fareyi üzerinde rotarod 120 sonra kalırsa s, oturum bu noktada kap, fare rotarod kaldırmak ve bir sonbahar gecikme süresi 120 kaydetme s.</li>
	<li>Üç deneme olmak üzere toplam iki kez daha test yineleyin. Yorgunluk etkisini en aza indirmek için denemeler en az 5 dk arayla uzay. Üç deneme skoru ortalama. Zarar görmemiş bir yetişkin fare genellikle, düşmeye ortalama bir gecikme süresi vardır &#62; 40 s.</li>
	<li>Kafesine döndü fare yerleştirin ve temiz rotarod ve çevresindeki % 70 etanol ile.</li>
</ol> 9. Miktar beyincik GFP ifadenin <ol><li>fareler anestezi ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ve % 4 paraformaldehyde ile sıvı. Beyin ve omurilik teşrih ve mendil sabitleştirici geceleme ıslatın ve ardından % 30 Sükroz çözüm taşıyın. Denge sonra 50 mikron koronal bölümler sahne 4 , 5 , 6 dondurma ile sürgülü bir microtome üzerinde kesti.</li>
	<li>Vermis, beyincik orta LOB eşit aralıklandırılmış 3-6 beyincik bölümlerini seçin. Fluorescently etiket GFP sinyal en üst düzeye çıkarmak için. Birincil antikor GFP için 1:500 ve 1:300 4 , 5 , 6 seyreltme Alexa 488 konjuge ikincil antikor kullanır. 
	Not: Bkz: 4 , 5 , 6 örnekleme, daha fazla ayrıntı için başvuruları kesit ve yordamlar boyama.</li>
	<li>Bir düşük büyütme objektif bir mikroskop kullanarak her bölümünde tanımlanmış bölge ilgi photomicrograph. Kullanım bir 2.5 X amaç (N.A. 0,12) ve filtre ayarla 10, 450-490/515-565 uyarma/emisyon). Kamera ayarlarını tutmak (pozlama zaman, örneğin, 2 s) analiz edilecek örnekleri arasında aynı. Olarak kaydetmek bir. TIF dosyası.</li>
	<li>Photomicrograph yaygın olarak kullanılan "Soy" görüntü programında açın; iki pencere-ecek açık. Yakın olarak pencere belirtilen &#34; dizine alınmış renk &#34;.</li>
	<li>Seç &#34; seçenekleri &#34;, sonra &#34; yoğunluk SliceŔ tonları çeşitli kırmızı arama tablo (LUT) penceresinde gösterilir. Penceresinde belirli GFP sadece etiketleme içinde doldurmak için imleci kullanın ve non-spesifik arka plan görüntüde alınmayı başladığında durmak. 
	Not: Bu sayısal photomicrograph floresan alan vurgular. Ayarları özellikle gözle görülür floresan hücrelerin tümünü yakalamak için optimize edilmelidir. Uygulama ile bu yöntem tam olarak belirli Floresans vurgulayabilirsiniz.</li>
	<li>Floresan alan ölçme önce ilk yapılan ölçümler doğru birimlerinde (piksel) olduğundan emin olun. Bunu yapmak için tıklatın &#34; analiz &#34;, sonra &#34; ScaleŔ ayarla Dördüncü satır demeliyim &#34; birim &#34;. Piksel piksel cinsinden ölçmek için tıklatın aþaðý açýlan listeden seçin &#34; Tamam &#34;. Çözümleme seçeneğini Değiştir &#34; dahil iç delikleri &#34; dahil tüm hücre vücut analiz edilmesi emin olmak için.</li>
	Floresan alanı ölçmek için <li>'ı tıklatın &#34; analiz &#34; tıklatıp ardından &#34; ölçü birimi &#34;. Bu değer görmek için tıklatın &#34; analiz &#34; sonra'ı tıklatın &#34; göstermek ResultsŔ sonuçlar pencere-ecek gözükmek. Floresan alan ölçüm etiketli başlığı altında olacaktır &#34; alan &#34;.</li>
	<li>Ölçümler arasında standardizasyon sağlamak için LUT penceresinde vurgulanmış değerleri değişmez.</li>
	Tüm ölçümler kaydedildi kere, <li>ortalama her hayvan (hayvan başına 3-6 bölümlerden) değerleridir. Uygun istatistiksel test grupları arasındaki transduced alanlara karşılaştırmak için kullanın. 6</li></ol>

<ol><li>Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injections+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansive+gene+transfer+in+the+rat+CNS+rapidly+produces+amyotrophic+lateral+sclerosis+relevant+sequelae+when+TDP-43+is+overexpressed%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed.</a> Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).</li>
<li>Dayton, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+forelimb+impairment+in+rats+expressing+a+pathological+TDP-43+25+kDa+C-terminal+fragment+to+mimic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV9+supports+wide-scale+transduction+of+the+CNS+and+TDP-43+disease+modeling+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther.+Methods+Clin.+Dev%22%5BJournal%5D)">AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats.</a> Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).</li>
<li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+targeting%2C+better+efficiency+for+wide-scale+neuronal+transduction+with+the+synapsin+promoter+and+AAV-PHP.B%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B.</a> Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).</li>
<li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+respiratory+changes+at+end+stage+in+a+FUS-induced+disease+state+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+vector+%26%2334%3Bmagic+bullet%26%2334%3B%3A+targeted+expression+in+the+central+nervous+system+after+peripheral+delivery+using+the+synapsin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Gene vector &#34;magic bullet&#34;: targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).</li>
<li>van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+embolism%3A+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Physiol.+Funct.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Gas embolism: pathophysiology and treatment.</a> Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teslimat rotalarını çeşitli AAV vektörel çizimler için test: içi parenkimal, içi-cerebroventricular, içi thecal, intravenöz, burunici, intra kas, vs. Her yol belirli avantajları hem de dezavantajları var. Kuyruk ven AAV yetişkin fareler için MSS tutarlı iletim ulaşmak için güvenilir bir yöntem bir ilçedir. Periferik enjeksiyon yöntemi bir enjeksiyon kanül giriş içine belgili tanımlık CNS doku önler ve bu nedenle minimal invaziv. Bu yöntemle elde verimli CNS ifade tekniği en büyük avantajı var. Enjeksiyon yöntemi çok oldu...

Nöronlar içinde vivo transducing için verimli oldukları için rekombinant adeno ilişkili virüs (AAV) CNS araştırma için vazgeçilmez araçları vektörleridir. AAV vektörel çizimler farklı transgenes ve protein izoformlarının, farklı doku, farklı ana türler ve yönetim farklı yolları eğitimi için çok yönlü vardır. Örneğin, AAV fareler için çevresel, nispeten nöronlar MSS boyunca ilk olarak transduce için intravenöz enjeksiyon Foust vd ve Duque vd.'da açıklanan invazif olmayan, tarafından yönetilemez duruma gelir (bkz: JÜPİTER tarafından kağıt Gombash vd. (2014)). 1 , 2 , 3 bu gen teslim yaklaşım fareler verimli bir şekilde her iki yeşil flüoresan protein (GFP) ifade etmek için kullanılan veya ALS ilgili protein, transactive Yanıt MSS 43 kDa (TDP-43) DNA'ya bağlanıcı protein. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Rat sıçan fizyolojik ve metabolik parametreleri insanlar fareler karşılaştırıldığında daha yakın olduğundan ve davranışsal ve toksikolojik deneyleri özellikle fareler için tasarlanmış önemli çalışıyor. Ayrıca, daha fazla transgenik fare çizgi kullanılabilir hale gelmektedir bu AAV gen transferi çalışmalarda kullanılan.
Yöntemleri geniş CNS gen transferi fare ve hızlı, güvenilir miktar sonuçlar için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Geniş ölçekli CNS iletim ALS belirtiler Sıçanlarda TDP-43 spinal kord ifade ederek taklit etmek için kullanılır. TDP-43 vektör olarak Jackson ve ark. kullanılan genç yetişkin fareler için kuyruk ven enjeksiyonu yöntemidir 6 , 8 , 9 motor açıkları TDP-43-indüklenen tarafından iki yöntem birkaç hafta sonra attı: kaçış refleks ve Dayton vd ve Jackson ve ark. kullanılan gibi rotarod 5 , 6 , 7 , 9 denetim GFP vektör, otopsi analizi, beyincik floresan alan Jackson ve ark. içinde kullanılan iletim verimliliği dizini olarak hesaplanır 6 , 8 beyincik analiz CNS iletim periferik gen teslim sonra derece hızlı ve güvenilir bir dizin olduğu kanıtlanmıştır ve periferik orta gen transferi çalışırken yaklaşımlar çeşitli için uygulanabilir olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Ölçek</td><td>Pelouze</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene kova</td><td>Thermo Scientific</td><td>12014000</td><td>4000 mL</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Laktasyonlu Zil Çözeltisi</td><td>Baxter Healthcare</td><td>0338-0114-04</td><td></td></tr><tr><td>Mini vortekser</td><td>Fisher Scientific</td><td>128101</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>22624415</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar filmi</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>BD</td><td>309626</td><td>25 g'lık bir iğne takılı olarak gelir. Enjeksiyon için 27-30g iğne ile değiştirin</td></tr><tr><td>30g iğne</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Piramal Healthcare</td><td>66794-013-25</td><td>İzofluran USP 250 mL</td></tr><tr><td>Anestezi maskesi</td><td>Kopf Instruments</td><td>906</td><td></td></tr><tr><td>Gazlı Bez</td><td>Henry Schein</td><td>100-2524</td><td>2 "x 2" (5cm x 5cm)</td></tr> <tr><td>Pipet uçları</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0816</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet</td><td>Gilson</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>Gaz anestezi buharlaştırıcı</td><td>SurgiVet</td><td>4214322</td><td>Classic T3</td></tr><tr><td>Gaz anestezi çöpçü</td><td>SurgiVet</td><td>32373B10</td><td>Enviro-PURE</td></tr><tr><td>Isıtma yastığı</td><td>Sears</td><td>17280</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah pedi</td><td>VWR</td><td>56617-006</td><td></td></tr><tr><td>Rotarod</td><td>Panlab/Harvard Aparatı</td><td>76-0772</td><td>4 sıçan/ 4 fare</td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2401</td><td>140 kanıt</td></tr><tr><td>%70 İzopropanol</td><td>VWR</td><td>89108-160</td><td></td></tr><tr><td>Filiz Görüntüsü</td><td>Scion Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP Etiketi Poliklonal Antikor</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Birincil Antikor - 1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td>İkincil Antikor - 1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>Axioskop 40 mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz yönetim için ipuçları

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörleridir Nörobilim anahtar bir reaktif kümelenmiş için düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR), optogenetics, cre-lox hedefleme, vb. Bu yazının amacı geniş merkezi sinir sistemi (MSS) gen transferi kuyruk ven enjeksiyon AAV fare içinde çalışan araştırmacı yardım etmektir. Geniş ölçekli ifade koşulları yaygın patoloji ile ilgilidir ve bir fare modeli büyük boyutu ve fareler için karşılaştırıldığında insanlar fizyolojik benzerlikler nedeniyle önemlidir. Bu örnek uygulamada geniş ölçekli nöronal iletim tüm spinal kord, amyotrofik lateral skleroz (ALS) etkiler bir nörodejeneratif hastalık taklit etmek için kullanılır. Verimli geniş ölçekli CNS iletim terapötik protein faktörleri önceden klinik çalışmalarda sunmak için de kullanılabilir. Birkaç hafta sonra bir sonrası enjeksiyon ifade aralığı, iletim etkileri değerlendirilir. Yeşil flüoresan protein (GFP) denetim vektör için beyincik GFP miktarını hızla ve güvenle temel bir görüntüleme programı tarafından tahmin edilmektedir. ALS tarafından indüklenir motor hastalığı fenotipleri protein transactive yanıt 43 kDa (TDP-43) DNA'ya bağlanıcı protein ilgili için açıkları kaçış refleks ve rotarod tarafından attı. Hastalık modelleme ve gen tedavisi dışında geniş ölçekli gene burada açıklanan hedefleme için çeşitli potansiyel uygulamalar vardır. Bu yöntemin Genişletilmiş Kullanım Hipotez testleri sinir ve neurogenetics hızlandırdığını yardımcı olacak.

TDP-43 indüklenen motor bozuklukları AAV TDP-43 (şekil 1) kullanılan doz bağlı olarak 2-6 hafta içinde ortaya gereken. Başarısız kuyruk ven enjeksiyonları kısmi veya hiçbir bozuklukları neden olur; AAV etkisi üretmek için kan dolaşımına ulaşmalıdır. AAV GFP başarılı bir enjeksiyon GFP ifade beyin ve spinal kord boyunca bir vektör doz bağımlı şekilde neden olur. Sürücü ifade, Sitomegalovirüs tavuk beta aktin hibrid organizatörü CAG organizatörü olarak da bilin...

Fareyi bir geniş ölçekli merkezi sinir sistemi gen teslimi için yöntemleri kaplıdır. Bu örnekte, amacı tüm omurilik etkileyen bir hastalık taklit etmektir. Yaygın iletim bir terapötik protein MSS için bir kerelik, Çevre Yönetimi'nden teslim etmek için kullanılabilir.

Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Bu adeno-ilişkili virüs vektörü gen transferinin genel amacı, sıçanın beyin ve omuriliğini kapsamlı ve geniş ölçekli bir temelde genetik olarak manipüle etmektir. Bu yöntem, gen transferi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İn-vivo gen aktarımı için oldukça etkili bir yol olup bu nedenle çok güçlü ve çok yönlü bir tekniktir.Bu prosedür hem hızlı hem de yüksek derecede tekrarlanabilirdir. Birçok yayınımızda, sıçanların omurilik boyunca amyotrofik lateral skleroz ile ilişkili bir proteini eksprese etmek için bu geniş ölçekli gen transfer yaklaşımını kullandık. Meslektaşım Robert Dayton, prosedürü uygulamalı olarak gösterecektir.Mychal Grames, Robert'e yardımcı olacaktır. İlk olarak çalışma istasyonunu hazırlayarak başlayın; önce yüzeyi %70 ethanol ile temizleyin. Ardından çalışma alanına bir ısıtma pedi yerleştirin ve sıcaklığı 37 °C olarak ayarlayın.Isıtma pedinin üzerine bir tezgah pedi yerleştirin. İşlem için yeterli miktarda oksijen ve izofluran olduğundan emin olun. İndüksiyon haznesini ve anestezi maskesini %70 etanol ile temizleyin ve anestezi maskesini tezgah pedinin üzerine yerleştirin.Hayvan başına yaklaşık 5 x 5 santimetrelik bir parafin film karesi, bir alkollü hazırlık pedi ve iki veya üç gazlı bez pedin, pipet uçlarının ve bir mikropipetin hazır olduğundan emin olun. Ardından, vektörü oda sıcaklığında çözün ve her hayvan için bir steril mikro santrifüj tüpü etiketleyin. Gerekli AAV hacmini uygun tüpe pipetleyin ve hacmi laktatlı ringer solüsyonu veya salin ile istenen enjeksiyon hacmine tamamlayın.Numuneyi bir veya iki saniye boyunca vorteksledikten sonra, numuneyi tüpün dibine indirmek için beş saniye boyunca puls santrifüj yapın. Toplam enjeksiyon hacmini tüpten pipetleyerek parafin filmi karesinin üzerine aktarın. Ardından, bir mililitrelik şırıngaya 30 gauge iğne yerleştirin.İğnenin eğimli ucu aşağı bakacak şekilde parafin film üzerindeki vektöre yerleştirin. Tüm virüs iğne ve şırıngaya geçene kadar şırınga pistonunu geri çekin. Anestezi sistemini kullanarak sıçanı uygun şekilde anestezi altına alın.Ayak parmağı sıkıştırma testine karşı reaksiyon gözlemlenmemesiyle yeterli anestezi derinliğinin sağlandığından emin olun. Ardından, sıçanı çalışma alanına yan tarafı üzerine gelecek şekilde yerleştirin ve burun konisi kullanarak anesteziyi sürdürün. Sıçan yan yatarken, bir lateral kuyruk veni yukarı bakmalıdır.Enjeksiyon, kuyruk uzunluğunun üçte iki alt kısmına yapılır. Enjeksiyon bölgesini alkollü temizleme pedi ile silin. Kuyruğu, enjeksiyon alanının biraz üzerinden sıkıca tutun; bir parmağınızı doğrudan lateral kuyruk veninin üzerine yerleştirin, bu işlem venin genişlemesini sağlayacaktır.Bevel kısmı yukarı bakacak şekilde, iğneyi görünen kuyruk veniyle aynı yönde hizalayın. Kuyruğu tutan diğer ele ve kuyruk venine baskı yapmamaya büyük özen göstererek, kuyruk veninin üzerindeki deriyi delin. Normal kan akışını sağlamak için kuyruk venindeki baskıyı serbest bırakın.Ardından iğneyi damarın içine ilerletin. İğnenin kuyruk damarını deldiğinden emin olmak için pistonu hafifçe geri çekin. Eğer iğne damarın içindeyse, iğneye kan akacaktır.Gerektiği takdirde iğne yeniden konumlandırıldıktan sonra, şırınganın ucunu kuyruğa yaslayarak iğneyi sabitleyin. Vektörü kuyruğa saniyede yaklaşık 20 µL hızla yavaşça enjekte edin. Enjeksiyonun başarısız olması durumunda, hayvan sadece kısmen transduse olacak ve sonuçlar muhtemelen yararlı olmayacaktır.Bununla birlikte, pratik yaptıkça başarılı enjeksiyonlar oldukça tekrarlanabilir ve güvenilir hale gelir. Vektör uygulandıysa, iğneyi kuyruktan çıkarın ve kanamayı durdurmaya yardımcı olmak için enjeksiyon bölgesine 30 ila 60 saniye boyunca bir gazlı bezi bastırın. İzofluran anestezisini ve oksijeni kapatın.Sıçan yeniden bilincini kazanana kadar gözlemleyin ve ardından kafesine geri koyun. AAV ile kontamine olmuş olabilecek malzemeleri uygun bir biyotehlike konteynerine atın ve çalışma alanını %70 etanol ile temizleyin. Dondurma tablalı bir kaydırmalı mikrotom kullanarak, AAV enjekte edilmiş hayvanın fiksasyonu yapılmış ve kriyokorumaya alınmış beyninden 50 mikron kalınlığında koronal kesitler alın.GFP için immünboyama yapılıp lamlara monte edildikten sonra, bir mikroskop kullanarak düşük büyütmeli bir lens ile tanımlanan ilgi bölgesindeki her bir kesitin fotomikrografını çekin. Analiz edilecek tüm örnekler için kamera ayarlarını aynı tutun ve verileri TIFF dosyaları olarak kaydedin. Fotomikrografı, yaygın olarak kullanılan Scion Image programında açın.İki pencere açılacaktır; indeks rengi olarak belirtilen pencereyi kapatın. Seçenekleri, ardından yoğunluk dilimini seçin. Bakma tablosu penceresinde bir dizi ton kırmızıyla belirtilecektir.Pencerede, imleci kullanarak yalnızca spesifik GFP etiketlemesini doldurun ve görüntüde spesifik olmayan arka plan seçilmeye başladığında durun. Ardından, analyze seçeneğine tıklayın ve scale ayarını yapın. Dördüncü satırda units yazmalıdır; açılır listeden pixels seçeneğini seçin ve ardından okay butonuna tıklayın.Floresan alanı ölçmek için önce analyze (analiz et) ve ardından measure (ölç) seçeneğine tıklayın. Sonrasında, analyze and show results (analiz et ve sonuçları göster) seçeneğine tıklayın. Bir sonuçlar penceresi açılacak ve floresan alan ölçümü, area (alan) olarak etiketlenen başlığın altında yer alacaktır.Tüm ölçümler kaydedildikten sonra, hayvan başına üç ila altı kesitten gelen değerlerin ortalamasını alın. Gruplar arasındaki transduksiyon alanlarını karşılaştırmak için uygun bir istatistiksel test kullanın. Bu temsili görüntü, AAV 9 GFP'nin kuyruk veni yoluyla enjeksiyonundan dört hafta sonra sıçan serebellumundaki GFP immünofloresansını göstermektedir.Floresan alanı seçerek belirlemek ve vurgulanan pikselleri nicelleştirmek için görüntü analiz yazılımı kullanılmıştır. Bu, transduksiyon uygulanmamış bir hayvandan alınan GFP görüntüsüdür. Bu görüntünün, GFP enjekte edilen hayvan için kullanılan parametrelerle analizi, çok düşük düzeyde bir arka plan sinyali tespit etmektedir.Yöntem kavrandıktan sonra, enjeksiyon her bir sıçan için yaklaşık beş dakikada tamamlanabilir. Sonuç olarak, bu teknik, genlerin sıçan MSS'sine verimli bir şekilde aktarılmasının bir yolunu tanımlamaktadır; tek seferlik bir gen iletimi, kalıcı ekspresyon ve uzun süreli etkiler sağlar. En önemlisi, merkezi sinir sistemi periferden manipüle edilmektedir.Nispeten non-invaziv bir intravenöz vektör enjeksiyonu, beyne ve omuriliğe, yani MSS'ye ulaşır.

methods-tips-for-intravenous-administration-adeno-associated-virus-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada görsel korteks nöronlar ve glia floresan etiketlenmesi için AAV vektörleri intrakranial enjeksiyon sunuyoruz.

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Bu video, Parkinson hastalığını modellemek için sıçan substantia nigra'ya viral bir vektör enjekte etme sürecini göstermektedir. Sıçanın hazırlanması, viral vektörün substantia nigra'ya mikroenjekte edilmesi ve kurtarma prosedürü için adımları ana hatlarıyla belirtir.

Nörodejeneratif Hastalık Modellemesi için Sıçan Substantia Nigra'ya Viral Vektör Enjeksiyonu

Kaynak: Li, D., et al. Yetişkin Farelerde Rekombinant Adeno İlişkili Virüslerin Doğrudan İntratekal Enjeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, adeno-ilişkili virüslerin (AAV) uyanık bir farenin beyin omurilik sıvısına (BOS) intratekal enjeksiyonu için şırınga hazırlığı, omurga hizalaması ve hassas iğne yerleştirmeyi kapsayan prosedürü göstermektedir. Bu yöntem, CNS tedavileri için potansiyelini destekleyerek hedeflenen gen iletimini doğrular.

Merkezi Sinir Sistemi Hastalıklarının Tedavisi için Bir Fare Modelinde Virüslerin İntratekal Verilmesi

Kaynak: Grames, M. S., et al. Adeno İlişkili Virüsün Sıçanlara İntravenöz Uygulanması ve Merkezi Sinir Sistemi Transdüksiyonunun Değerlendirilmesi için Yöntemler ve İpuçları. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, sıçanlarda rekombinant adeno-ilişkili virüsün (AAV) kuyruk veni enjeksiyonunu göstermektedir. Lateral kuyruk venine enjeksiyondan sonra, virüs kan dolaşımına girer, kalpte dolaşır ve beyne ulaşır, burada nöronlara girer ve nöroterapötik uygulamalar için hedef protein üretimini kolaylaştırır.

 Bir Sıçan Modelinde Rekombinant Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin İntravenöz Uygulaması 

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz.  Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Bu el yazması, viral vektör aracılı yerel gen iletiminin, merkezi sinir sistemindeki transgenleri ifade etmek için nasıl çekici bir yol sağladığını açıklamaktadır.  Protokol, Parkinson hastalığı için viral vektör tabanlı bir hayvan modeli geliştirmek için sıçanın substantia nigra'sında bir viral vektör enjeksiyonu gerçekleştirmek için tüm önemli adımları özetlemektedir.

Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme

Burada %1 lidokain hidroklorür viral bir çözümde küçük hayvanlar için verimli adeno ilişkili virüs teslim edilmesini sağlamak ve iletim verimliliği merkezi tahmin etmek için bir skorlama sistemi kurmak için bir doğrudan intratekal enjeksiyon tekniği mevcut sinir sistemi geçici zayıflık lidokain tarafından indüklenen derecesine göre.

Rekombinant Adeno ilişkili virüs yetişkin farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon

Genç sıçanın bel sarnıcına enjeksiyon yapmak için cerrahi bir prosedür tarif edilmiştir. Bu yaklaşım, gen terapisi vektörlerinin intratekal verilmesi için kullanılmıştır, ancak bu yaklaşımın hücreler ve ilaçlar dahil olmak üzere çeşitli terapötikler için kullanılabileceği tahmin edilmektedir.

Juvenil Sıçanlarda Lomber Sarnıç Enjeksiyonu ile İntratekal Vektör Verilmesi

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

Burada, yetişkin farelerde adeno-ilişkili virüsü (AAV) sistemik olarak uygulamak için fare lateral kuyruk veni enjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü detaylandırıyoruz. Ek olarak, AAV transdüksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan tahlillerin protokollerini açıklıyoruz.

Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

Sıçanlarda doğrudan vagus siniri enjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz ve enjeksiyon sonrası komplikasyonlar olmadan doğrudan sinir içine ilaç verilmesini sağlıyoruz. Bu yöntem, otonom sinir sistemi manipülasyonunu içeren klinik öncesi nörolojik çalışmalar için geçerlidir. Sıçanlarda ve diğer türlerde diğer sinirler için gerekli modifikasyonlarla doğrudan sinir enjeksiyonu için kullanılabilir.

Sıçanlar İçin Doğrudan Vagus Sinir Enjeksiyon Protokolü

Öğrenin adeno ilişkili virüs vektörleriyle sıçan merkezi sinir sistemine gen transferi yöntemini. Bu teknik, gen tedavisi ve nörolojik hastalıkların incelenmesi için hızlı ve güvenilir bir yaklaşım sunar.

Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları (Video) | JoVE Journal

Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları

Daha fazla video keşfet