Jel Hibridizasyonunu Kullanarak Telomer Uzunluğunu Nicellemek İçin Modifiye Terminal Restriction Fragment Analysis

Bu prosedürün genel amacı, Doktorlar Jerry W.Shay, Woodring Wright ve meslektaşları tarafından tanımlanan bir telomer kısıtlama fragmanı analiz prosedürünün değiştirilmiş bir versiyonunu kullanarak ökaryotik hücrelerdeki telomerlerin uzunluğunu belirlemektir. Prosedür, telomer uzunluğu hakkında veri sağlayarak hücre biyolojisi, davranışsal tıp, epidemiyoloji ve bulaşıcı hastalıklar, yaş, stres, ilaç tedavileri ve enfeksiyonların etkileri hakkındaki soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çeşitli hücrelerde ortalama telomer uzunluğunun kilobaz cinsinden doğrudan bir ölçümünü sağlamasıdır.

Analiz edilecek genomik DNA örnekleri, metin protokolünde açıklandığı gibi ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak hücrelerden ekstrakte edildi. Genomik DNA'nın sindirimini 20 ila 40 mikrolitrelik bir son hacimde gerçekleştirin. Her bir mikrosantrifüj tüpünde aşağıdakileri birleştirin: üç mikrogram genomik DNA; 10x DNA sindirim tamponu; bir mikrolitre Rsa1 kısıtlama enzimi; bir mikrolitre Hinf1 kısıtlama enzimi; ve son hacme kadar steril, deiyonize su.

Tüm bileşenlerin tüpün dibinde olduğundan emin olmak için kısa bir süre santrifüjleyin. Sindirimi en az 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi% 0.6 agaroz çözeltisi hazırlayarak başlayın.

Jel elektroforez sistemini jel döküm için hazırlayın. Uç kapakları jel döküm tepsisine takın. Agaroz jel çözeltisi 50 santigrat dereceye kadar soğuduktan sonra, jel döküm tepsisine dökün, jelin içine bir koni yerleştirin ve jelin oda sıcaklığında üstü açık olarak 45 dakika sertleşmesine izin verin.

Uç kapakları döküm tepsisinden çıkarın ve tarağı jelden çıkarın. Jel elektroforez sistemini, elektroforez tamponu ile doldurma hattına kadar doldurun ve jelin tamamen tampona daldırıldığından emin olun. Jelin kuyucuklarını DNA örnekleriyle doldurun ve örnekler arasında boş bir kuyu bırakın.

Jelin zıt uçlarındaki kuyucuklara 10 mikrolitre DNA merdiveni ekleyin. DNA'yı hızlı bir şekilde jelin içine taşımak için jel elektroforezini 30 dakika boyunca 150 voltta çalıştırın. 30 dakika sonra voltajı 57 volta ayarlayın ve 18 ila 24 saat çalıştırın.

Jel 18 ila 24 saat çalıştıktan sonra, elektrik kaynağını kapatın ve jel ile birlikte jel döküm tepsisini elektroforez tamponundan çıkarın. Jelin yönü için bir referans görevi görmesi için jelin sağ üst köşesini dilimleyin. Bir parça filtre kağıdını jelden biraz daha büyük bir boyutta kesin.

Filtre kağıdını bir döküm tepsisindeki jelin üzerine yerleştirin ve kağıdın jel üzerindeki fazla çözeltiyi emmesine izin verin. Kabarcıkları yanlardan sıkmak için bir pipeti rulo olarak kullanarak filtre kağıdı ile jel arasındaki hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın. Jeli ve filtre kağıdını, kağıt jelin altında kalacak şekilde ters çevirerek jeli döküm tepsisinden çıkarın.

Jeli filtre kağıdı ile birlikte bir jel kurutucuya aktarın ve jeli plastik sargı ile örtün. Rulo olarak bir pipet kullanarak streç film ve jel arasındaki tüm hava kabarcıklarını çıkarın. Jeli iki saat boyunca 50 santigrat derecede kurutun.

Jel kuruduktan sonra, streç filmi çıkarın ve jeli ve filtre kağıdını 250 mililitre deiyonize su içeren bir cam kaba aktarın. Filtre kağıdını dikkatlice çıkarın ve jeli oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Jeli 12 x 12 inçlik bir naylon ağın üzerine yerleştirin.

Naylon ağı ve jeli birlikte yuvarlayın, jelin kendisiyle temas etmediğinden emin olun. Ağı ve jeli bir hibridizasyon tüpüne yerleştirin. 100 mililitre 5x SSC ve 12 mikrolitre yeşil floresan nükleik asit boyasını birleştirin ve hibridizasyon tüpüne yerleştirin.

Rotasyonlu bir hibridizasyon fırınında 42 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Çözeltiyi ışıktan koruyun. 30 dakika sonra, naylon ağı ve jeli hibridizasyon tüpünden çıkarın.

Rulo halinde açın ve 250 mililitre deiyonize su içeren bir cam tabağa düz bir şekilde yerleştirin. Naylon ağı yavaşça çıkarın. Belirtilen ayarlara sahip bir fosfor görüntüleyici kullanarak jeli görüntüleyin.

Radyoaktif telomer sondasını, tesisin radyoaktiviteyi işleme düzenlemelerine uygun olarak hazırlayın. Mikrosantrifüj tüpünde aşağıdakileri birleştirin: iki mikrolitre telomer probu; 2.5 mikrolitre 10x polinükleotid kinaz reaksiyon tamponu; P32 ile gama fosfat grubu üzerinde etiketlenmiş ATP'ye üç mikrolitre; dört mikrolitre T4 polinükleotid kinaz; ve DNaz içermeyen, steril, deiyonize suyu 20 mikrolitrelik nihai hacme kadar ekleyin. Tüpü kısaca santrifüjleyin.

Tüpü bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin. Tüpü kısa bir süre santrifüjleyin ve reaksiyonu durdurmak için 65 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Radyoaktif prob çözeltisini hazırlanmış bir G25 kromatografi kolonuna yükleyin ve 700 kez g'de iki dakika santrifüjleyin.

Radyoaktif telomer probunu içeren süzüntüyü kaydedin. Jeli 250 mililitre Denatüre Edici Çözelti içeren bir cam kaba koyun ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Denatüre Etme Solüsyonunu çıkarın ve 250 mililitre steril, deiyonize su ile değiştirin.

Oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika inkübe edin. Deiyonize suyu çıkarın. 250 mililitre nötralizasyon çözeltisi ile değiştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Jeli naylon bir ağ içine yuvarlayın ve hibridizasyon tüpüne yerleştirin. 20 mililitre hibridizasyon çözeltisi ekleyin ve 42 santigrat derecede bir hibridizasyon fırınında 10 dakika boyunca rotasyonla inkübe edin. 10 dakika sonra hibridizasyon solüsyonunu çıkarın ve 20 mililitre taze hibridizasyon solüsyonu ile değiştirin.

Telomer probunun tamamını ekleyin ve gece boyunca döndürülerek 42 santigrat derecede bir hibridizasyon fırınında inkübe edin. Telomer probu ile hibridizasyon tamamlandığında, jeli ve ağı hibridizasyon tüpünden çıkarın ve 250 mililitre 2x SSC içeren bir cam tabağa yerleştirin. Naylon ağı açın ve tabaktan çıkarın.

Cam kabı bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 2x SSC'yi çıkarın, 250 mililitre 0.1x SSC artı %0.1 SDS çözeltisi ile değiştirin ve oda sıcaklığında orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika inkübe edin. 0.1x SSC artı %0.1 SDS çözeltisini çıkarın.

250 mililitre 2x SSC ile değiştirin ve orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika daha inkübe edin. Jeli 2x SSC'den çıkarın ve jeli plastik sargıya sarın. Jel ile streç film arasındaki tüm kabarcıkları ve hava ceplerini çıkarın.

Jeli fosfor ekranlı bir pozlama kasetine yerleştirin ve fosfor ekranını gece boyunca jele maruz bırakın. Ertesi gün, açıkta kalan fosfor ekranını görüntülemek için bir fosfor görüntüleyici kullanın. Fosfor görüntüleri daha sonra metin protokolünde açıklandığı gibi telomer uzunluğu ölçümü için kullanılır.

Ölümsüzleştirilmiş bir insan sünnet derisi fibroblast hücre hattından ve insan periferik kan mononükleer hücrelerinden izole edilen üç DNA konsantrasyonu telomer uzunluğu için analiz edildi. Yeşil floresan nükleik asit boyası ile boyanmış kurutulmuş astroz jelinin bu fosfor görüntüsü, DNA merdiven bantlarının birinci ve sekizinci şeritlerdeki konumunu göstermektedir. Jelin tepesinden her bir moleküler ağırlık standardına ölçülen mesafe mavi oklarla gösterilir.

Bir telomer probu ile hibridizasyonun ardından, telomer bantları her şeritte yayma olarak görünür. Her şerit artı bir arka plan şeridi için 150 kutudan oluşan ızgaralar hesaplandı. Her bir numune seti için seçilen analiz alanları gösterilir.

Arka plan yoğunluklarının her bir örnek seti için benzer olduğundan emin olmak için her bir örnek seti için B ile işaretlenmiş ayrı arka plan şeritleri seçilmiştir. Ortalama telomer uzunluğu hesaplamaları, ölümsüzleştirilmiş hücre hattında insan periferik kan mononükleer hücrelerine göre daha yüksek bir ortalama telomer uzunluğu ortaya çıkardı. Bu sonuçlar ayrıca, her bir şeritte analiz edilen genomik DNA miktarının, hibridizasyonun ardından tespit edilebilir bir sinyal elde etmek için kritik olduğunu göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 2 1/2 güne yayılmış 12 saat içinde gerçekleştirilebilir ve uygun şekilde yapılırsa iki gecelik inkübasyon ile gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, her örnek için en az üç mikrogram DNA kullanmayı ve her örneği iki kez ölçmeyi unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, yaşlanma alanındaki araştırmacıların, insanlar da dahil olmak üzere farklı hayvan türlerinde telomer uzunluğunun korunmasından sorumlu mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, telomerlerin ortalama uzunluğunu doğrudan nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.