Name: Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Öğrenin, yetişkin Danio rerio beynine amiloid-β42 enjeksiyonu yaparak Alzheimer hastalığı modeli oluşturmayı. Bu yöntem, nöral kök hücreler üzerindeki toksisite etkilerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser DZNE ve Helmholtz Derneği (VH-NG-1021), CRTD, tarafından desteklenmiştir TU Dresden (FZ-111, 043_261518) ve DFG (KI1524/6) (C.K.); ve tarafından Leibniz Derneği (SAW-2011-IPF-2) ve BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Biz de Ulrike Hofmann peptid sentez ve Nandini Asokan, Prayag Murawala ve Elly Tanaka için yordamı çekimleri sırasında yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Bu iletişim kuralı EU kurallar tarafından önerilen bir standart bir uygulamadır (2010/63) ve Avrupa Toplum Biyoloji ve Tıp (EuFishBioMed) yılında Karlsruhe Enstitüsü, Teknoloji (KIT) Balık modelleri için. Sonra burada açıklanan tüm yöntemleri (Landesdirektion Dresden; belge numarası TVV-52/2015) etik Komisyonu tarafından onaylanmış olan.
 1. hazırlık Aβ42 peptid <ol><li>Synthesize peptidler (bkz. Tablo 1) standart 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) Kimya 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-ile kullanma tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) kaplin reaktif tarihinde bir otomatik katı fazlı peptid synthesizer 52 olarak. Sentez ölçeğini 100 µmol yapıldı.</li>
	<li>500 mg Fmoc korumalı reçine ile otomatik peptid synthesizer (yükleme kapasitesi 0,2 mmol/g) katı faz yükleyin. Çözünmüş Fmoc korumalı amino asit konsantrasyonu 0.5 M, yük hacimli gerekli ve ilgili synthesizer için hesaplanan olarak. 
	Not: Her Fmoc korumalı amino asit kavraması her yapı taşı reçine 47 5 kere fazlalığı ile iki kez etkinleştirmek için hesaplamalar yapılır.</li>
	<li>Dimethlyformamide (DMF) peptid sentezi için gerekli reaktifler geçiyoruz. Örneğin, Sigara tepki amino grupları kap için belgili tanımlık harekete geçirmek, HBTU, bir konsantrasyon 0,48 m, % 45 v/v N-Methylmorpholine (NMM) (temel) ve % 5 v/v asetik anhidrit (kapatma karışımı) adlı hazırlayın.</li>
	<li>Trifluoroacetic asit (TFA) oluşan bir taze hazırlanmış bölünme karışımı bir karıştırıcı kullanarak sağlam destek sürekli karıştırılarak reçine tüm peptidler ayırmak: Triisopropylsilane(TIS): su: Dithiothreitol (DTT) 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), 4 h için kullanın 10 mL 100 µmol sentez ölçek için.</li>
	<li>100 mL buz gibi Dietil eter için bölünme karışımı ekleyerek cleaved ürün çökelti. 0,45 µm gözenek büyüklüğü ile politetrafloroetilin (PTFE) filtre ve yıkama ile 20 mL buz gibi Dietil eter içeren bir filtrasyon ünitesi üzerinden geçmek.</li>
	<li>Filtre uygulanmış peptid filtre kağıdı toplamak ve erime 100 mg 5 ml zarlarını peptid deiyonize su distile: Asetonitril 1:1.</li>
	<li>Ters fazlı yüksek basınçlı sıvı Kromatografi (HPLC) üzerinde Boncuk boyutu 10 µm gözenekli polistiren divinylbenzene sütun ile donatılmış bir yarı partiye hazırlık HPLC ile arındırmak.
	<ol><li>Sütun ön ısı ve 50 ° C cihazı Isıtma bir sütun kullanarak korumak. Degrade % %5 100 solvent B 25 dk 4 mL/dak., uygulayarak bir otomatik kesir toplayıcı kullanarak büyük kesirleri toplamak 
		Not: Solvent A % 0,1 olduğunu TFA su ve solvent B % 0,1 olduğunu TFA Asetonitril 52.</li>
		<li>220, Kromatografik izlemek nm, uygun doruklarına toplamak ve LC-Bayan kullanarak analiz</li>
	</ol></li> <li>Onayla saflık tarafından analitik ters faz ultra yüksek basınç sıvı Kromatografi (UPLC) vasıl 220 nm UV bulmak ile örnek bir analitik C18 sütun (Boncuk boyutu 1.7 µm) üzerinden geçen süre izleme. Peptid ürün tarafından kütle spektrometresi onaylayın. 
	Not: Bir electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi (ESI-MS) ve Tandem Quadrupole Dedektör UPLC birleştiğinde.</li>
	<li>Bir yuvarlak alt şişesi içinde istenen peptid doğru kesirler için kabarık bir toz 0,052 mbar, bir vakum uygulayarak lyophilize. Vakum pompası süresiz olarak-78 ° C. Store-80 ° C'de tutulan bir dondurucu birimine çift.</li>
	<li>Kullanmak lyophilized peptid Asetonitril bir karışımı 1 mM stok çözeltisi hazırlamak için: DMF: analitik sınıf su 1:1:1 deneyler için. Peptidler Bu çözümde toplamak değil gibi bu eriyik-ebilmek var olmak stok en az 6 ay için.</li>
</ol> 2. Enjeksiyon karışım hazırlanması <ol><li>lyophilized peptidler seyreltmek için fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) hazırlayın.</li>
	<li>Peptid PBS 20 µM son bir konsantrasyon için geçiyoruz. Bu çözüm taze hazırlayın. İyice karıştırın ve buza enjeksiyon kadar saklayın. Çözüm toplamada önlemek için 30 dk fazla olamaz.</li>
</ol> 3. Anestezi <ol><li>hazırla anestezikler, düzenli balık suda dolaşan üzerinden % 0,1 etil-m-aminobenzoate methanesulphonate (MESAB), hisse senedi çözüm sistem. Anestezi çözüm %0.0025 (v/v) son bir konsantrasyon için hazır olun.</li>
	<li>Bir taşıma kaba 5 L sistem su ile onların tank balık için istediğiniz sayıyı kaldır.</li>
	<li>Yarı-dolgu plastik bir Petri kabına (90 mm) 40 mL anestezi ile. Bu yemek için iğne kullanın.</li>
	<li>Opercular hareketi sona erdi kadar anestezi balıkta kuluçkaya.</li>
</ol> 4. Cerebroventricular mikroenjeksiyon <ol><li>enjeksiyon aparatı hazırlanması <ol><li>hazırla cam enjeksiyon kılcal bir iğne çektirmenin aşağıdaki parametreleriyle kullanma: Isıtma döngüsü, 537; çekerek döngüsü, 250; hız, 1,5 s; zaman, 80 Bayan</li> <li>basınç ayarı için 25 psi basınç kaynağı getirmek.</li>
		<li>Microinjector parametreleri şu şekilde ayarlayın: tutun 20 psi basınç; basınç çıkarma 10 PSI; dönem değeri 2.5; gating değeri 100 Bayan</li>
		<li>Cam kılcal enjeksiyon çözüm yükleyin. Cam kılcal mikroenjeksiyon yuvasına takın. Enjeksiyon açısını 45 ° için ayarlamak. 
		Not: Başvurular 27 , 46 de açıklandığı gibi daha ayrıntılı iletişim kuralları bulunabilir.</li>
	</ol></li> <li>Yer bir balık yeni bir petri içine dolu anestezi solüsyonu (aynı derecede içinde adım 3.3).</li>
	<li>Balık forseps ve orient enjeksiyon için tutun.</li>
	<li>Bir yarık 30 G iğne ucu kafatasında üzerinde optik tectum iki yanal tabak buluştuğu kullanarak oluşturun. İpucu beyin dokusu içine eklemek değil, bu kanama ve hasara neden olur. Bkz: 27 , 45 , 46 ek ayrıntılar için başvurur.</li>
	<li>Cam kılcal slit takın.
	<ol><li>Sadece iğne kullanmanızı ve kafatası ile daha--dan 1 mm nüfuz değil. Balık tutmaya ve cam kesi site üzerinden kapiller ucunu takın.</li>
		<li>Cam telencephalon 45 ° açıyla doğru kapiller ucu gelecek şekilde yönlendirin. Çözüm 1 µL enjekte. Sıvı Enjeksiyon sonra hemen çekilmesini.</li>
	</ol></li></ol> 5. Kurtarma <ol><li>balık geri taşıma kapsayıcıya o iyileşene kadar yer. Optimum su kalitesini artırmak amacıyla düzenli olarak dolaşımdaki balık su kapsayıcı bağlanın. 
	Not: Kurtarma normalde 1 dk sürer. Daha uzun sürerse, Balık anestezikler için daha kısa bir defa (Bu deneyci tarafından optimize edilmiş olması gerekir) tutulmalıdır.</li>
</ol > 6. Doku hazırlık ve Sectioning <ol><li>balık ödün önce istenen bir süre için bekleyin. 
	Not: Bu deneysel soruda bağlıdır. Amiloid birikimi 1 gün sonra enjeksiyon gibi erken görülebilir.</li>
	<li>Bağlı olarak etik kurallara uygun yöntemi kullanarak balık kurban (örneğin, 0.1 M MESAB balıkla tedavi).</li>
	<li>Sivri forcep dorsal tarafta kullanarak optik tectum Kurukafa ikiye ayıracağım ve kafa sadece arkasında bir neşter kullanarak göğüs fin teşrih.</li>
	<li>Tamir % 2 paraformaldehyde (PFA) kullanarak kafalarını gecede, İngiltere'de yılın 4 ° C. kullanım 3 mL plastik tüp içinde başına bir vidalı kapaklı. 
	Uyarı: uygun kişisel koruyucu ekipman PFA işleme giyerler.</li>
	<li>İçin üç kez 0.1 M kafaları cryoprotection yıkayıp, kalsiyumun, fosfat tampon (pH 7,4), sonra onları % 20 sucrose/20% ethylenediaminetetraacetic (EDTA) çözüm aktarmak ve gecede 4'te kuluçkaya ° C.</li>
	Doku reçine, kesit içine gömmek için <li>plastik Histoloji kalıpları kuru buz (yaklaşık 3-5 bir blok dondurmak için min) % 7.5 gelatin/20% Sükroz çözümde kafaları dondurmak. -80 ° C'de örnekleri depolamak veya sonraki adıma (cryosectioning) devam.</li>
	<li>Bir cryostat açıklanan 28 , 42 kullanarak 12 µm kalınlığında cryosections içine başları bölüm. Cryosections cam slayta doğrudan aktarın ve uzun vadeli kullanım için-20 ° C'de depolayın.</li>
</ol> 7. İmmunohistokimyasal boyama ve mikroskopi Not: oksijen odasında tüm kuluçka adımları gerçekleştirin. Ve tüm çamaşır 10 dk her adımlardır.
<ol><li>Kuru oda sıcaklığında 30 dk için bölümler. Çözdürme sonra iki kez PBS ve bir kez PBSTx bölümleri yıkayın (PBS % 0.03 ile Triton-X-100).</li>
	<li>Incubate, 4 ° C gece. birincil antikoru (anti-Aβ42 antikor; PBSTx 1:500 seyreltme) ile gün yıkamak bir kez PBS ve iki kez PBSTx.</li>
	<li>İkincil antikor (floresan birleştiğinde algılama, 1:500 seyreltme) ile birlikte DAPI bölümlerle kuluçkaya (1 μg/mL) içinde oda sıcaklığında 2 h için PBSTx.</li>
	<li>Yıkama üç kez PBSTx. Son yıkandıktan sonra bir coverslip 100 μL % 70 gliserol kullanarak slaytları mount.</li>
	<li>Edinme floresan görüntüleri confocal mikroskop (örneğin 20 X PL APO N.A. 0,7 amacı ile 488 uyarma aralığı ve bir standart yeşil filtre; ile kullanma Şekil 2) 39.</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Amiloid peptidler sıra varyasyonları veya çeşitli Etiketler içerecek şekilde değiştirilmiş. Örneğin, şifreli amiloid peptid oluşturulabilir ve peptidler N-terminus peptid sonu itibariyle floresan etiketlerle etiketlenmiş ya da taşıyıcı peptidler39ile Etiketlenmiş. Benzer şekilde, bu protokol için taşıyıcı peptid hücre Penetran peptid TR etkinliğini nakliye kargo derin nedeniyle beyin doku39içine alınır. Ayrıca, bizim yöntem enjeksiyon ve toksik toplamalardan<sup class="xref...

Reklam nöronlar kaybı ile karakterize kronik ilerleyici bir hastalıktır ve serebral korteks1,2,3,4,5' te synapses. Reklam klasik neuropathological işaretlerinden amiloid peptidler birikimi vardır ve neurofibrillary oluşumu (NFTs)6ipliği. Senil plaklar, olarak da bilinen amiloid plaklar, β-Pileli yapıları içinde beyin parankimi5formu amiloid-β (Aβ) peptidler oluşur. Aβ42 birikimi reklam hastalarda, hastalığın ilerlemesinde erken ve kritik bir rol vardır. Sinaptik fonksiyon bozukluğu, Engelli plastisite ve nöronal kayıp7,8,9,10önde gelen olaylar bir çağlayan reklam tetikler.
Teleost Zebra balığı yetişkin beyin düzenleme kök hücre plastisite11,12,13,14,15, , eğitim için mükemmel bir model hizmet veren 16,17,18,19,20 ve21,yılında22,23 de dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi (MSS), çeşitli hastalıklarda ,24. Kullanılabilir deneysel yöntemleri19,20,25,26,27,28,29, geniş bir dizi sayesinde 30 , 31, bu çalışmalar bilgilendirici ve uygulanabilir. Zebra balığı CNS13,15,32,33,34,35,36,37doldurmak, kısmen aktif nöron kaybı19,39,40,41,42,43sonra, moleküler programları kullanarak, 38, 44. Bu nedenle, nörodejeneratif hastalık modeli içinde Zebra balığı kurulması omurgalı beynindeki rejeneratif yeteneği ve kök hücre biyolojisi ile ilgili yeni soruları adresine yardımcı olabilir.
Son zamanlarda, sentetik Aβ42 peptidler (Tablo 1)39enjekte edilerek yetişkin Zebra balığı beyin amiloid toksisite modelinde geliştirdik. Bu enjeksiyon neden ateş fenotipleri (örneğin, hücre ölümü, mikroglial harekete geçirmek, sinaptik bozulma ve bellek açıkları), insan beyninin patolojinin anımsatan Bu Zebra balığı-ebilmek var olmak kullanılmış için alabilme gösteren ateş Zebra balığı beyinde peptidler immunohistokimyasal stainings ve rejenerasyon CNS olabilir yetişkin Zebra balığı olarak moleküler mekanizmaları ile tespit edilebilir Aβ4239tespit edilmiştir. Bu protokol için biz sentetik amiloid peptidler makarna bir cerebroventricular enjeksiyon (CVMI) yöntemi27,39,45,46 kullanarak Zebra balığı beyin içine enjeksiyon göstermek Amiloid birikimi (şekil 1) taklit etmek için. CVMI enjeksiyon olarak β-sayfa yapıları üzerine toplamak ve toksisite sarfetmek peptidler, teslim yeni bir yol sağlar. Peptidler45tüm rostro Kaudal eksen boyunca ventrikül alan hedefleme beyin boyunca eşit olarak dağıtılır. Ayrıca, bu yöntem amiloid kapanımlar takip yetişkin Zebra balığı beyinde NSPCs morfolojik ve moleküler yanıt analiz için sağlar. Bu tür çalışmalar bize memelilerde başarılı beyin tamir için bir fikir verecek. Bizim yöntem başarılı rejenerasyon yanıt gerekli moleküler mekanizması kayıp neurons ve fonksiyonel iyileşme ikmal ikna etmek için reklam benzeri belirtiler sonra anlamak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Fmoc korumalı amino asitler</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya)</td><td></td><td>Katı faz peptit sentezi için Fmoc bazlı amino asitler (SPPS)</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)üronyum hekzaflorofosfat (HBTU)</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya)</td><td>RL-1030</td><td>Aktivatör</td></tr><tr><td>Oxyma</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya)</td><td>RL-1180</td><td>Rasemizasyon baskılayıcı</td></tr><tr><td>N,N-Diizopropilaminlamin</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya)</td><td>SOL-003</td><td>Baz</td></tr><tr><td>Dimetilformamid</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya)</td><td>SOL-004</td><td>Çözücü</td></tr><tr><td>N-Metilmorfolin</td><td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Almanya</td><td>A12158</td><td>Baz</td></tr><tr><td>1-Hidroksibenzotriazol hidrat (HOBT)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC. ( St. Louis, MO, ABD)</td><td>157260 ALDRICH</td><td>Aktivatör</td></tr><tr><td>Piperidin</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya)</td><td>822299</td><td>Fmoc koruma koruma azaltıcı</td></tr><tr><td>reaktif Diklormetan (DCM)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya)</td><td>106050</td><td>Çözücü</td></tr><tr><td>Formik asit (FA)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya)</td>100264 HPLC <td></td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit (TFA)</td> için tampon <td>bileşeniMERCK KGaA ( Darmstadt, Almanya)</td><td>808260</td><td>Levage Karışım reaktifi</td></tr><tr><td>Triizopropilsilan (TIS)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya)</td><td>233781 ALDRICH</td><td>Clevage Karışım reaktifi</td></tr><tr><td>Asetonitril (UPLC/LCMS için)</td><td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td><td>34967-1L</td><td>Çözücü</td></tr><tr><td>Asetonitril (HPLC için)</td><td>VWR International Ltd, İngiltere</td><td>83639.320</td><td>Çözücü</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>VWR International Ltd, İngiltere</td><td>23811.326</td><td>Peptit çökeltme için çözücü</td></tr><tr><td>Dithiotritol (DTT)</td><td>VWR International Ltd, İngiltere</td><td>0281-25G</td><td>Çatal Karışım reaktifi</td></tr><tr><td>TentaGel S RAM Fmoc rink amid reçine</td><td>Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Almanya)</td><td>S30023</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Peptit sentezi için katı faz 5 ml şırınga dahil filtreli</td><td>Intavis AG (Köln, Almanya)</td><td>34.274</td> SPPS ve Katı Faz Politetrafloroetilen (PTFE) <td>filtresinden elde edilen klevaj için reaksiyon tüpü</td></tr><tr><td></td><td>Sartorius Stedtim (Aubagne, Fransa)</td><td>11806-50-N</td><td>Çökeltilmiş peptitlerin filtrelenmesi</td></tr><tr><td>Polivinilidenflorür (PVDF) şırınga filtresi</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td><td>KC78.1</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>Peptit Sentezleyici</td><td>Intavis, Köln, Almanya</td> için ön filtreleme<td>ResPep SL</td><td>Otomatik katı fazlı peptit sentezleyici</td></tr><tr><td>Su İttifakı HPLC</td><td>Waters, Milford Massachusetts, ABD</td><td>Waters 2998, Waters e2695</td><td>Yarı hazırlayıcı ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)</td></tr> <tr><td>PolymerX, boncuk boyutu 10 & mu; m, 250x10 mm</td><td>Phenomenex Ltd. Almanya</td><td>00G-4328-N0</td><td>Gözenekli polistiren divinilbenzen HPLC sütunu</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10, Milli-Q filtreli</td><td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, ABD</td><td>LCPAK0001</td><td>Su arıtma sistemi</td></tr><tr><td>Filtrasyon Ünitesi</td><td>Sartorius Stedtim (Aubagne, Fransa)</td><td>16307</td> UV Dedektörlü <td></td></tr><tr><td></td><td>peptit çökeltme UPLC Aquity için filtrasyon ünitesiWaters, Milford, Massachusetts, ABD</td><td>M09UPA 664M</td><td>LC-MS</td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 için analitik ters faz ultra HPLC, boncuk boyutu 1.7 & mu; m, 50x2.1 mm</td><td>Sular, Milford, Massachusetts, ABD</td><td>186002350</td><td>Analitik C18 sütunu</td></tr><tr><td>ACQUITY TQ Dedektörü</td><td>Sular, Milford, Massachusetts, ABD</td><td>QBB908</td><td>Elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS)</td></tr><tr><td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td><td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Almanya</td><td>16706, 101542</td><td>Vakum pompalı liyofilizatör</td></tr><tr><td>Paradigma plaka okuyucu</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MESAB (etil-m-aminobenzoat metansülfonat)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Life Technologies, GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>İğne</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>üreticiye göre</td><td></td>değişir</tr><tr><td>Dumont Cımbız</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Gillies Diseksiyon Forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>501265</td><td></td></tr><tr><td>Cam enjeksiyon kılcal damarları</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>TWF10</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>5430-12</td><td></td></tr><tr><td>Pnömatik PicoPump</td><td>World Hassas Aletler</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Halka aydınlatıcı; Halka Işık Kılavuzu</td><td>Parkland Scientific</td><td>ILL-RLG</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr></tbody></table>

amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin zebra balığı beyinde modelleme

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer hastalığı (Ah) bir toksik amiloid-β42 hangi birikimi (Aβ42) peptidler açar sinaptik bozulma, iltihap, nöronal ölüm nörodejeneratif hastalık zayıflatıcı, açıkları öğrenme 's. İnsanlar reklam durumunda kayıp nöronlar kısmen sinir kök/progenitor hücreler (NSPCs) ve düşük neurogenesis Engelli proliferatif kapasitesi nedeniyle yeniden olamaz. Bu nedenle, verimli rejeneratif terapiler de yayılması geliştirmek gerekir ve Nörojenik NSPCs. Zebra balığı (Danio rerio) kapasitesini rejeneratif bir organizmadır ve temel moleküler programlar hangi ile biz tasarım olabilir öğrenebilirsiniz Reklam mücadele için tedavi yaklaşımları. Bu nedenle, Zebra balığı bir reklam gibi modelinde nesil gerekliydi. Bizim metodoloji kullanarak, biz Aβ42 peptid sentetik türevleri doku delici kabiliyetine sahip yetişkin Zebra balığı beynine tanıtmak ve hastalık patoloji ve rejeneratif yanıt analiz. Mevcut yöntemler veya hayvan modelleri üzerinde o Zebra balığı nasıl omurgalı bir beyin doğal olarak yeniden ve böylece insan nörodejeneratif hastalıklar daha iyi endojen NSPCs hedefleyerek tedavisi için bize yardımcı bize öğretebilir avantajdır. Bu nedenle, Yetişkin Zebra balığı beyinde kurulan amiloid-toksisite modeli Nörobilim ve klinik tıp alanında araştırma için yeni yollar açılabilir. Ayrıca, bu yöntem basit yürütülmesi için maliyet-etkin ve verimli deneysel değerlendirme sağlar. Bu el yazması sentezi ve Aβ42 peptidler kod Zebra balığı beyin içine ekleme açıklar.

HPLC sentezlenmiş peptid arındırmak için kullanılan ve kütle spektrometresi arıtılmış amiloid β peptidler karakterize etmek için kullanılmıştır. HPLC sütun Aβ peptidler ayrılması geliştirmek için 50 ° C sıcak olduğu ve bütün fraksiyonları toplanmıştır. Doğru sentezlenmiş peptid tanımlamak için kütle spektroskopisi analiz tüm bölümler için gerçekleştirildi. UPLC Kromatografik bileşik saflığı gösterir. UPLC (Yani, gerekli amiloid Beta peptid oranında şarj etmek için doğru kitle) üz...

Bu iletişim kuralı sentezi, karakterizasyonu ve monomeric amiloid-β42 peptidler amiloid toksisite histolojik analizler ve tespiti takip bir Alzheimer hastalığı modeli kurmak için yetişkin Zebra balığı üretme için enjeksiyon açıklar toplamalardan.

Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Bu yöntemin genel amacı, Alzheimer hastalığında görülen amiloid dozlarının özel bir modelini oluşturmak için amiloid beta 42 peptidlerini sentezlemek ve bunları yetişkin zebra balığı beynine enjekte etmektir. Bu yöntem, amiloid toksisitesinin nöral kök hücreler üzerindeki etkisi ve böylesine zararlı koşullar altında gençleşme yanıtını nasıl tetikleyebileceğimiz gibi nörobilim alanındaki önemli soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, raporlanabilir olması, tekrarlanabilirliği ve elde ettiğimiz fenotiplerin insan beyinlerindeki Alzheimer hastalığını güçlü bir şekilde anımsatmasıdır.Bu tekniğin etkileri, hastalık durumunda nöral kök hücreleri aktive edebilen doğal bir omurgalı model sağladığı için Alzheimer hastalığının tedavisine kadar uzanmaktadır; dolayısıyla zebra balıkları bize nörodejenerasyonun nasıl iyileştirilebileceğini öğretebilir. Amiloid beta 42 peptidini hazırlamak için, katı faz olarak 500 miligram FMOC korumalı reçineyi otomatik bir peptid sentezleyicisine yükleyin. Ardından, ilgili sentezleyici için hesaplanan gerekli hacimde, 0.5 molar çözünmüş FMOC korumalı amino asitleri yükleyin.HBTU aktivasyon ajanını 0,48 molar konsantrasyonda çö

modeling-amyloid-42-toxicity-neurodegeneration-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, döllenmiş zebra balığı embriyoları stereo mikroskop altında dekoryona tabi tutulur ve daha sonra bir kolesterol sentezi inhibitörüne maruz bırakılır, bu da larvalarda kan damarı yırtılmalarına ve beyin kanamalarının gelişmesine yol açar. Farklı kırmızı lekelerle tanımlanabilen hemorajik larvalar daha sonra daha fazla analiz için mikroskop altında ayrılır.

Zebra Balığı Larvalarında İlaca Bağlı Kanamanın Modellenmesi

Bu video, Alzheimer hastalığında görülen nöronal hasarı taklit ederek amiloid toksisitesi oluşturmak için yetişkin zebra balıklarının ön beynine monomerik amiloid peptitlerin enjekte edilmesi prosedürünü...

Amiloid Peptit Enjeksiyonu ile Zebra Balığı Beyninde Alzheimer Hastalığı Modeli Oluşturulması

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Tek tek hücrelerde yönlendirilmiş strese veya ölüme neden olacak hedefli manipülasyonların gerçekleştirilmesi nispeten zor olmuştur. Burada, hücre kültüründe ve canlı hayvanlarda tek tek hücreleri seçici olarak strese sokmak ve öldürmek için tek hücre çözünürlüklü bir ablasyon yaklaşımı, standart bir konfokal UV lazere dayalı olarak açıklanmaktadır.

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Bu çalışma, zebra balığı içinde akut ve kronik hiperglisemi modelleri oluşturmak için kullanılan yöntemleri açıklamaktadır. Amaç, hipergliseminin, yapısal ve yaralanmaya bağlı nörogenez gibi fizyolojik süreçler üzerindeki etkisini araştırmaktır. İş ayrıca PET / CT'yi kullanarak radyoaktif işaretlenmiş molekülleri (burada [18F] -FDG) takip etmek için zebrafish kullanımını vurguluyor.

Zebra basımında Akut ve Kronik Hiperglisemi Modelleri: Hipergliseminin Nörogenez Üzerindeki Etkisini ve Radyoaktif Etiketli Moleküllerin Biyo Dağılımını Değerlendiren Bir Yöntem

Bilişsel performansı değerlendirmek için tasarlanmış bir davranış odası sunuyoruz. Zebra balıklarının elde edildikten sonra 8 hafta sonra görevi hatırladığını gösteren veriler sunuyoruz. Ayrıca hipergliplik zebra balıklarının bilişsel performansı değiştirdiğini ve bu paradigmanın biliş ve hafızayı değerlendiren çalışmalar için geçerli olduğunu gösteriyoruz.

Zebra Balığını Model Sistem Olarak Kullanan Üç Odalı Seçim Davranışsal Görevi

Yetişkin zebra balığı için Marmarou ağırlık düşürme modelini, künt travmatik beyin hasarı (TBI) ve sonraki nöronal yenilenmenin altında kalan mekanizmaların ardından çok çeşitli patolojileri incelemek üzere değiştirdik. Bu künt kuvvetli TBI modeli ölçeklenebilir, hafif, orta veya şiddetli bir TBI'ya neden oluyor ve insan TBI'sında gözlenen yaralanma heterojenliğini yeniden özetler.

Yetişkin Zebra Balıklarında Künt Kuvvet Yaralanmasının Etkilerini Incelemek İçin Ölçeklenebilir Bir Model

Öğrenme ve hafıza, gelişimsel, hastalığa bağımlı veya çevresel olarak indüklenen bilişsel bozuklukların incelenmesinde güçlü metriklerdir. Bilişsel değerlendirmelerin çoğu özel ekipman ve kapsamlı zaman taahhütleri gerektirir. Bununla birlikte, mekik kutusu tahlili, yetişkin zebra balığı bilişinin hızlı ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi için geleneksel bir jel kutusu kullanan ilişkilendirilebilir bir öğrenme aracıdır.

Yetişkin Zebra Balığı Kullanarak Öğrenme ve Bellek Çalışmalarında Bilişsel Değerlendirme için İlişkisel Bir Öğrenme Aracı Olarak Mekik Kutusu Tahlil

Bu protokol, ortaya çıkan nöroinflamatuar yanıtı ve nörotoksisiteyi incelemek için bir zebra balığı larva modelinde beyin ventriküler bölgesine lipopolisakkaritin mikroenjeksiyonunu göstermektedir.

Nöroinflamasyon ve Nörotoksisiteyi Değerlendirmek için Larva Zebra Balıklarına Lipopolisakkaritin Beyin Ventriküler Mikroenjeksiyonları

Mevcut protokolün amacı, yetişkin zebra balığı için bir sosyal tercih testi oluşturmak ve kullanmak için gerekli adımları ana hatlarıyla belirtmek ve etanolün neden olduğu sosyal kusurları karakterize etmek için kullanılabileceğini göstermektir.

Olumsuz Bir Embriyonik Ortamın Yetişkin Sosyal Davranışı Üzerindeki Etkisini Karakterize Etmek için Zebra Balıklarında Fetal Alkol Spektrum Bozukluklarının Modellenmesi

Bu protokol, dopaminergik nöron kaybı ve lokomotor davranış bozukluklarını niceleyen in vivo zebrafish kullanarak standartlaştırılmış, yüksek verimli bileşik tarama yöntemi sunar ve böylece nöroprotektif bileşiklerin verimli taramasını sağlar.

Zebrafish larvalarında dopaminergik nörodejenerasyonun in vivo fenotiplenmesi, davranışsal analiz ve yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak

Öğrenin, yetişkin Danio rerio beynine amiloid-β42 enjeksiyonu yaparak Alzheimer hastalığı modeli oluşturmayı. Bu yöntem, nöral kök hücreler üzerindeki toksisite etkilerini incelemek için kullanılır.

Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme

Daha fazla video keşfet