Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme
25 Ekim 2017
Bu iletişim kuralı sentezi, karakterizasyonu ve monomeric amiloid-β42 peptidler amiloid toksisite histolojik analizler ve tespiti takip bir Alzheimer hastalığı modeli kurmak için yetişkin Zebra balığı üretme için enjeksiyon açıklar toplamalardan.
Bu yöntemin genel amacı, amiloid beta 42 peptitlerini sentezlemek ve bunları Alzheimer hastalığında görüldüğü gibi belirli bir Amiloid dozu modeli oluşturmak için yetişkin zebra balığı beynine enjekte etmektir. Bu yöntem, amiloid toksisitesinin nöral kök hücreler üzerindeki etkisi ve bu tür zararlı koşullarda gençleşme tepkisini nasıl ortaya çıkarabileceğimiz gibi sinirbilim alanındaki önemli soruları ele almamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, raporu, tekrarlanabilir olması ve elde ettiğimiz fenotiplerin insan beynindeki Alzheimer hastalığını oldukça anımsatmasıdır.
Bu tekniğin etkileri, Alzheimer hastalığının tedavisine kadar uzanır, çünkü hastalık durumunda nöral kök hücreleri aktive edebilen doğal omurgalı modeli sağlar, bu nedenle zebra balığı bize nörodejenerasyonu nasıl geri kazanacağımızı öğretebilir. Amiloid beta 42 peptidini hazırlamak için, katı faz olarak 500 miligram FMOC korumalı reçine içeren otomatik bir peptit sentezleyici yükleyin. Ardından, ilgili sentezleyici için hesaplandığı gibi gerekli hacimde 0.5 molar çözünmüş FMOC korumalı amino asitleri yükleyin.
HBTU aktivasyonunu 0.48 molar konsantrasyonda çözmek için DMF'nin dimetilformamidini kullanın. Daha sonra DMF'de hacim başına %45 hacim n metilmorfolin veya NMM, baz ve hacim başına %5 hacim, asidik anhidrit, kapak karışımı ekleyin. Hazırlanan reaktifleri sentezleyiciye yükleyin ve peptitin katı faz sentezi için otomatik sentezleyiciyi çalıştırın.
Sentezleyici üzerindeki peptit sentez döngülerinin tamamlanmasından sonra, reçineyi bir reaksiyon tüpüne aktararak ve aşağıdakilerden oluşan 10 mililitre taze hazırlanmış bir bölünme karışımı ekleyerek peptitleri parçalayın. Daha sonra, peptitleri katı destekten ayırmak için katı desteği bölünme karışımında dört saat boyunca sürekli olarak karıştırın. Bölünme karışımını 100 mililitre buz gibi soğuk dietil etere ekleyerek parçalanmış ürünü çökeltin.
Çözeltiyi, gözenek boyutu 0.45 mikrometre olan bir PTFE filtre içeren bir filtrasyon ünitesinden geçirin. Ardından, filtrelenmiş peptidi filtre kağıdından toplayın. Ve 100 miligram çökeltilmiş peptidi 5 mililitre 1: 1 asetonitril çözeltisi içinde çözün ve deiyonize suyu damıtın ve ham peptidi çözmek için girdap yapın.
Daha sonra, peptidi saflaştırmak için, ters baz HPLC ile, vuruş boyutu 10 mikrometre olan gözenekli bir polistiren divinilbenzen sütunu ile donatılmış bir HPLC hazırlanmış bir yarı hazırlayın. Kolonu 50 santigrat derecede tutmak için bir kolon ısıtma ünitesi kullanarak kolonu önceden ısıtın. Peptidi kolona uygulayın ve otomatik bir fraksiyon toplayıcı kullanarak tüm ana fraksiyonları toplayın.
25 dakika boyunca dakikada dört mililitrede %5 ila %100 akrilonitril arasında bir gradyan uygulayarak. Kromatogramı 220 nanometrede izleyin, uygun tepe noktalarını toplayın ve sonuçları LCMS kullanarak analiz edin. Toplanan ana fraksiyonlar numune şişelerine aktarılır ve analitik kontrol için bir LCMS makinesine yüklenir.
Numuneler bir UV dedektörü ile izlenirken, numune pancar boyutu 1.7 mikrometre olan bir analitik CA ekip kolonundan geçirilir. Doğru fraksiyonlar kütle spektrometresi ile tanımlanır. İstenilen peptidin doğru fraksiyonlarını, 0.052 milibarlık bir vakum uygulayarak yuvarlak tabanlı bir şişede kabarık bir toza liyofilize edin.
Vakum pompasını eksi 78 santigrat derecede tutulan bir dondurma ünitesine bağlayın. Daha sonra liyofilize tozu süresiz olarak eksi 80 santigrat derecede saklayın. 1: 2: 1 asetonitril, DMF karışımından oluşan bir milimolar stok çözeltisi hazırlamak için liyofilize peptidi kullanın.
Ve deneyler için analitik sınıf su. Enjeksiyon için, PBS'de 20 mikromolar bir karışım hazırlayın. Ve çözeltiyi enjeksiyona kadar buz üzerinde saklayın.
Cam enjeksiyon kılcal damarlarını hazırlamak için metin protokolünde belirtilen parametrelere sahip bir iğne çektirmesi kullanın. Basınç kaynağındaki basınç ayarını 25 PSI olarak ayarlayın. Ardından mikro enjektörde tutma basıncını 20 PSI'ye, çıkarma basıncını 10 PSI'ye, periyot değerini 2.5'e ve olumsuzlama değerini 100 milisaniyeye ayarlayın.
Ardından, cam kılcal damarı enjeksiyon çözeltisi ile yükleyin. Ardından cam kılcal damarı mikroenjeksiyon tutucusuna yerleştirin ve enjeksiyon açısını 45 dereceye ayarlayın. Bir balığı anestezi solüsyonu ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına koyun.
Anestezi uygulandıktan sonra, balığı forseps ile tutun ve enjeksiyon için yönlendirin. 30 gauge bir iğnenin ucunu kullanarak, iki yan plakanın birleştiği optik tektum üzerinde kafatasında bir yarık oluşturun. İğnenin sadece ucunu kullanın ve kafatasından bir milimetreden fazla nüfuz etmeyin.
Daha sonra balığı tutmaya devam ederken, cam kılcal damarın ucunu yerleştirme yerinden geçirin. Cam kılcal damarın ucunu 45 derecelik bir açıyla telensefalona doğru yönlendirin. Sonra çözeltinin bir mikrolitresini enjekte edin.
Balıkları iyileşene kadar bir taşıma kabına geri koyun. Ardından, optimum su kalitesini sağlamak için kabı düzenli olarak dolaşan balık suyuna bağlayın. Balıkları kurban ettikten sonra, metin protokolüne göre, sivri bir forsep kullanarak sırt tarafındaki optik tektumun üzerindeki kafatasını kesin.
Ardından, göğüs yüzgecinin hemen arkasındaki başı incelemek için bir neşter kullanın. Kafaları üç mililitre% 2 PFA'ya yerleştirin. Ve dokuyu gece boyunca% 4 Santigrat'ta inkübe edin.
Sitoproteksiyon ve dekalsifikasyon için, kafaları 0.1 molar fosfat tamponunda, pH 7.4'te üç kez yıkayın, ardından bunları %20 sükroz, %20 EDTA çözeltisine aktarın. Ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra kafaları plastik histoloji kalıplarında %7.5 jelatin, %20 sükroz çözeltisine aktarın.
Ve onları kuru buz üzerinde dondurun. Kafaları 12 mikrometre kalınlığındaki kriyoseksiyonlara ayırmak için bir kriyostat kullanın. Daha sonra kriyoseksiyonları doğrudan cam slaytlara aktarın ve uzun süreli kullanım için eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Slaytları lekelemek için, bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika kurutun. Çözüldükten sonra, bölümleri PBS'de iki kez ve PBS'de bir kez PBSTx adı verilen% 0.3 Triton X-100 ile yıkayın. Slaytlara birincil antikor ekleyin.
Ve numuneleri gece boyunca% 4 Santigrat'ta inkübe edin. Ertesi gün, slaytları bir kez PBS ile ve iki kez PBSTx ile yıkayın. Daha sonra DAPI ve PBSTx ile birlikte floresan bağlı ikincil antikor bölümlerine ekleyin.
Ve slaytları karanlıkta oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. PBSTx'te üç kez yıkadıktan sonra, her bir slaytı monte etmek için 100 mikrolitre% 70 gliserol ve bir kapak fişi kullanın. Son olarak, konfokal bir mikroskop kullanarak floresan görüntüler elde edin.
Doğru sentezlenmiş peptidi tanımlamak için, doğal amiloid beta 42 ve CPP etiketli amiloid beta 42 peptitleri için tüm HPLC saflaştırılmış fraksiyonları üzerinde kütle spektroskopisi analizi yapıldı. UPLC'de bir tepe noktası veren HPLC fraksiyonu, yani gerekli amiloid beta peptidinin doğru ana yük oranı, deneyler için daha fazla işlendi.
Serebroveleküler mikroenjeksiyondan sonra, peptitler beyinde toplanır ve yeşil kümeler tarafından görüldüğü gibi amiloid birikimleri oluşturur. Bu agregalar çoğunlukla hücre içi birikimler olarak görülür, aynı zamanda kan damarlarının etrafında da görülür. Bu tür agregasyonlar, amiloid peptitlerin ve dokunun başarılı bir şekilde biriktiğinin göstergeleridir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, enjeksiyon birkaç dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, hayvanın sağlığını ve davranışını yakından izlemek önemlidir. Bu tekniği geliştirdikten sonra, zebra balığı beynindeki patoloji ve nöral kök hücre tepkisi gibi Alzheimer hastalığı ile ilgili soruları ele almamıza yardımcı oldu.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, Alzheimer hastalığı modeli oluşturmak için yetişkin zebra balıklarına amiloid-β42 peptitlerinin sentezini ve enjeksiyonu çerçevesini belirtmektedir. Çalışmanın amacı, amiloid toksisitesinin nöral kök hücreler üzerindeki etkilerini ve potansiyel gençleşme tepkilerini araştırmaktır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Alzheimer Hastalığı Araştırması
- Hayvan Modelleri
Arka Plan
- Amiloid-β42 peptitleri Alzheimer hastalığı patolojisinde etkilidir.
- Zebra balıkları, nörodejenerasyonu incelemek için doğal bir omurgalı modelidir.
- Amiloid toksisitesini anlamak, terapötik stratejileri bilgilendirebilir.
- Bu yöntem, hastalık koşullarında nöral kök hücre tepkilerinin araştırılmasına olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Zebra balıklarına enjekte edilmek üzere amiloid-β42 peptitleri sentezlemek.
- Alzheimer hastalığını taklit eden bir model oluşturmak.
- Amiloid toksisitesinin nöral kök hücreler üzerindeki etkilerini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Otomatik bir peptit sentezleyici kullanılarak amiloid-β42 peptitlerinin sentezi.
- Sentezlenen peptitlerin yetişkin zebra balığı beynine enjeksiyonu.
- Amiloid agregasyonlarını tespit etmek için histolojik analizler.
- Amiloid toksisitesine tepki olarak nöral kök hücre aktivasyonunun değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Amiloid-β42 peptitlerinin başarılı bir şekilde sentezlenmesi ve enjekte edilmesi.
- Zebra balığı nöral kök hücreleri üzerinde amiloid toksisitesi etkilerinin gözlemlenmesi.
- Gözlemlenen fenotipler insan Alzheimer hastalığına benzer.
- Zebra balığının nörodejenerasyon için terapötik yaklaşımlar hakkında bilgi sağlama potansiyeli.
Sonuçlar
- Yöntem, Alzheimer hastalığının incelenmesi için tekrarlanabilir bir model sağlar.
- Zebra balıkları, amiloid toksisitesi koşullarında nöral kök hücreleri aktive edebilir.
- Bu araştırma, nörodejenerasyon iyileşme stratejileri hakkında bilgilere yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method establishes a vertebrate model to study amyloid-β42 toxicity and its impact on neural stem cell dynamics, addressing a key challenge in neurodegenerative disease modeling. By enabling reproducible induction of Alzheimer’s-like pathology in zebrafish, it supports early-stage target validation and mechanistic de-risking. The model’s capacity to assess endogenous regenerative responses offers translational value for prioritizing therapies aimed at enhancing neurogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of amyloid-β42 toxicity mechanisms in a living vertebrate brain.
- Scientific Value: Supports functional validation of neural stem cell targets by measuring proliferative and neurogenic responses to toxic insult.
- Scientific Value: Facilitates phenotypic screening of compounds for disease-modifying effects on amyloid aggregation and stem cell activation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable histopathological readouts (e.g., amyloid deposits, immunostaining) for assay standardization.
- Operational Value: Uses standardized peptide synthesis and microinjection protocols to ensure reproducibility across experiments.
- Operational Value: Enables scalable preparation of lysates or sections for downstream biochemical or imaging-based assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human-relevant amyloid pathology and neuroinflammatory responses in a regenerative vertebrate system.
- Scientific Value: Links target engagement (amyloid accumulation) to functional outcomes (neural stem cell activation) for mechanistic de-risking.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by evaluating whether test compounds modify toxicity phenotypes without suppressing regenerative capacity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, bridging target hypothesis testing with phenotypic validation prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about amyloid-β42 mechanisms of toxicity and neural stem cell modulation in an intact brain.
- Screening: Produces standardized, quantifiable pathology and cellular response metrics suitable for compound library screening.
- Analytics: Provides histological, fluorescent, and LC-MS validated outputs for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects amyloid toxicity models to endogenous repair pathways, supporting biomarker-aligned preclinical progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neurodegenerative target validation across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by modeling human amyloid toxicity in a vertebrate with conserved neurogenic pathways.
- Operational Value: Delivers a cost-effective, reproducible system with standardized peptide synthesis and injection procedures.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by identifying compounds that modulate toxicity while preserving or enhancing regenerative responses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurodegeneration programs targeting both pathology modification and endogenous repair.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peptide synthesis, zebrafish handling, and neurohistological techniques.
- Depends on automated peptide synthesizers, HPLC purification systems, and confocal microscopy for validation.
- Necessitates standardization of injection coordinates, peptide dosing, and timing of tissue collection across users.
- Involves adaptation considerations when extending to other zebrafish brain regions or disease models.
- Limited by the need for specialized equipment and training, though offset by low consumable costs and high reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Preparation of Aβ42 Peptide
4:40
Preparation of Injection Apparatus
6:09
Tissue Preparation and Sectioning
7:23
Immunohistochemical Staining and Microscopy
8:31
Results: Purification and Immunohistochemistry of Amyloid-β42 in Adult Zebrafish Brain
9:24
Conclusion
