Karaciğer ve Süt örneklerinde vahşi tipli ve sialik asitler tayini ve

Bu metodolojinin genel amacı, HPLC analizi kullanarak yabanıl tip ve CMAH nakavt farelerin karaciğer ve sütünde N-Asetilnöraminik asit ve N-Glikolilnöraminik asidin tespit edilmesidir. Bu yöntem, glikosbilim alanındaki soruların, özellikle CMAH fare modellerinin genotiplerinin bu hayvanların gerçek sialik asit içerikleri üzerindeki etkisinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin genetik taramalara kıyasla sahip olduğu temel avantaj, heterozigot fareler için de bağıl sialik asit seviyelerinin belirlenebilmesidir.

Bu yöntemi, laboratuvarımızdan iki lisansüstü öğrencisi olan Cui Cao ve Wang Wenjiao değerlendirecek. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde CMAH nakavt farelerden fare sütünün ve fare karaciğer dokusunun toplanmasıyla başlayın. Sütten siyalik asitleri izole etmek için 50 µL sütü 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 1,2 mL hazırlanmış sulu asetik asit çözeltisi ekleyin.

Karaciğer dokusundan sialik asitleri izole etmek için, 20 ila 50 miligram fare karaciğerini nazikçe çözdürün ve dounce doku parçalayıcıya aktarın. 1,2 mililitre sulu asetik asit çözeltisi ekleyin ve dokuyu 10 saniye boyunca nazikçe kayma kuvveti uygulayarak homojenize edin. Elde edilen süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Ardından, asitlendirilmiş sütü veya doku süspansiyonunu 80 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, örneği 14.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantın üst kısmındaki 1000 µL'yi yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.

Çözücüyü, oda sıcaklığında santrifüjlü evaporasyon yoluyla tamamen kuruyana kadar uzaklaştırın. Numuneyi 500 µL distile su içinde yeniden çözün. Ardından, numune başına 200 mg anyon değişim reçinesini musluk takılı boş 3 mL tüplere aktararak bir mikroanyon değişim kolonu hazırlayın.

Reçinedeki klorür iyonlarını asetat iyonlarıyla değiştirmek için 2 mililitre sulu asetik asit çözeltisi ekleyin. Solvent reçinenin üst kısmına ulaşır ulaşmaz musluğu kapatın. Nazikçe 2 mililitre distile su ekleyin ve musluğu açın.

Çözücünün çoğu reçinenin üst kısmına ulaştığında akışı durdurun. Reçinenin her zaman çözücü ile kaplı olduğundan emin olun. Ardından, fazla asetatı uzaklaştırmak için reçine kolonunu iki mililitre distile su ile iki kez daha yıkayın.

Elde edilen 500 µL örnek çözücüsünü reçine kolonuna aktarın ve geçiş sıvısını atın. Reçineyi 2 mL distile su ile nazikçe yıkayın. Örnek anyonlarını 1 mL 50 mM amonyum asetat çözeltisi kullanarak reçineden 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne elüe edin.

Çözücü, oda sıcaklığında santrifüjle buharlaştırılarak kurutulana kadar uzaklaştırılır. Analitik bir terazi kullanılarak 5 ile 8 miligram arasında N-Asetilnöraminik asit, 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne tartılır. Kesin ağırlık kaydedilir ve her miligram için 164 mikrolitre distile su eklenir.

N-Glikolilnöraminik asidi, 1 miligramlık alikvotlar gibi orta fiyatlı ve daha küçük miktarlarda temin edin. Yaklaşık 20 milimolar Neu5Gc stok çözeltisi elde etmek için bileşiğin üzerine doğrudan 154 mikrolitre distile su ekleyin. Çözeltiyi 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Bu çözelti, -20 °C'de 12 aya kadar saklanabilir. Her bir stok çözeltiden 5 µL alarak yeni bir 1.5 mL santrifüj tüpünde birleştirin. Ardından, oda sıcaklığında santrifüjlü evaporasyon ile çözücüyü tamamen uzaklaştırarak kurutun.

Fare sütü, fare karaciğeri veya karışık siyalik asit standardından elde edilen siyalik asit örneklerine 20 µL OPD çözeltisi ekleyin. Örneği 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Ardından, örnekleri karanlıkta 80 °C'de dört saat boyunca inkübe edin.

Numunelerin beş dakika boyunca soğumasını bekledikten sonra, 80 µL distile su ekleyin. Ardından, tüpleri 14.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüj edin. Sonrasında, süpernatanttan 80 µL'yi 300 µL'lik yüksek geri kazanımlı bir HPLC flakonuna aktarın.

Türevlendirilmiş sialik asit örnekleri, dört ila altı santigrat derecede bir haftaya kadar saklanabilir. Örnekleri, çevrimiçi bir floresan detektöre bağlı standart bir HPLC sistemi kullanarak analiz edin. Analiz için 250 milimetre uzunluğunda ve 4,6 milimetre çapında ters faz C18 kolon kullanın.

Çözücü A ve çözücü B hazırlandıktan ve HPLC çalışması protokolde detaylandırıldığı şekilde kurulduktan sonra, HPLC sistemine 50 µL örnek enjekte edin. Elüansı, floresan dedektörün 373 nm uyarılma dalga boyu ve 448 nm emisyon dalga boyu kullanılarak izleyin. Son olarak, Neu5Gc'nin bağıl miktarını metin protokolünde açıklandığı şekilde hesaplayın.

Burada, homozigot knock-out CMAH farelerden ve heterozigot knock-out CMAH farelerden elde edilen süt örneklerindeki floresan işaretli siyalik asitlerin temsili HPLC kromatogramları gösterilmiştir. Yabanıl tip fareler de gösterilmektedir. Benzer şekilde, fare karaciğerinden türetilen floresan işaretli siyalik asitlerin kromatogramları burada sunulmuştur.

Neu5Gc'nin bağıl miktarlarının karşılaştırılması, homozigot CMAH nakavt farelerin hiç Neu5Gc içermediğini, heterozigot CMAH nakavtların ve vahşi tip farelerin ise %10 ile %75 arasında Neu5Gc içerdiğini göstermektedir. Yöntem iyice kavrandığında ve prosedür uygun şekilde uygulandığında, örnekler sekiz saat içinde hazırlanabilir. Ayrıca örnekler, HPLC otomatik örnekleme ile gece boyunca analiz edilebilir.

Bu prosedürü uygularken, sialik asit izolasyonu ve türevlendirme işlemini aynı gün içinde gerçekleştirmenin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Prosedürün ardından, elde edilen floresan sinyallerinin doğasını doğrulamak amacıyla kütle spektrometrik analiz gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, araştırmacıların biyolojik örneklerdeki sialik asit dağılımını incelemesine olanak tanır.

Konsantre asetik asit ve formik asit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.