Name: Karaciğer ve Süt örneklerinde vahşi tipli ve sialik asitler tayini ve CMAH Knock-out Fare. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Keşfedin fare karaciğer ve süt örneklerinde sialik asitlerin HPLC ile tayini yöntemini. CMAH genotiplerinin etkisini inceleyerek glikosains alanında heterozigot farelerde de analiz yapılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Çin Doğal Bilimler Vakfı (JV ve LL&#39;ye 31471703, A0201300537 ve 31671854 hibe numaraları) ve 100 Yabancı Talent Planı (JVB için JSB2014012 hibe numarası) tarafından desteklendi.

Hayvanları ilgilendiren prosedürler, Nanjing Ziraat Üniversitesi Deneysel Hayvan Merkezi Etik Kurulu tarafından Deneysel Hayvan Refahı Ulusal Rehberine (Çin Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Bakanlığı, 2006) uygun olarak, bir SPF&#39;de barındırılan hayvanlarla onaylanmıştır Tesis (İzin KİMLİĞİ: SYXK-J-2011-0037). 1. Cmah Knock-out Fare Modeli <ol><li> Yangzhou Üniversitesi (Çin) Karşılaştırmalı Tıp Merkezi&#39;nden alınan vahşi tip C57Bl / 6 farelerini kullanın. Not: Cmah knock-out fareler de Cmah geninin ekson 6 92 baz çifti kaldırarak, ticari olarak bir CRISPR / Cas9 20 strateji kullanarak önceki Cmah nakavt çalışmaları 17, 19 ve elde edilen sağlanan bilgilere dayanarak oluşturulan Insan CMAH geninde silinmiş 19 . Pozitif F 0 &lt;/ alt&gt; -mice (2 birey) heterozigot F 1 -mice elde etmek için, yabani tip fareler ile çaprazlanır. Heterozigot F 1- misli (beş birey) geçtikten sonra, homozigot CmA knock-out F 2- misli başarıyla elde edilebilir (3 kişi). </li><li> Ticari bir DNA saflaştırma kiti kullanarak Zangala 21 tarafından gösterilen yönteme göre genomik DNA kullanarak farelerin genotiplendirme yapın. <ol><li> Ticari DNA polimeraz ve primer çift 5&#39;gaaagggctcggctctgtatgaa3 &#39;ve 5&#39;tttaaaatgtcccgggtgagaagc3&#39; kullanarak Cmah geninin ilgili bir DNA parçasını genişletin. 94 ° C&#39;de 40 saniye, 63 ° C&#39;de 40 saniye tavlama ve 1 dakika boyunca 72 ° C&#39;de uzama içeren 34 PCR döngüsü kullanılarak gen amplifikasyonunu uygulayın. </li><li> PCR ürünlerini% 1 agaroz jel üzerinde görselleştirin. Vahşi tip birey için tek bir bant (0.5 kb), çift bant (0.4 ve 0.5 kb) gözlemlenmelidir.Heterozigot knock-out bireyi ve homozigot nakavt bireyi için tek bir bant (0.4 kb) içermektedir. </li></ol></li></ol> 2. Örnek Koleksiyon <ol><li> Willingham ve ark tarafından açıklanan protokolü kullanarak fare sütü toplayın . 22 . </li><li> Gonçalves ve ark. Tarafından tarif edilen protokolü kullanarak fare karaciğer dokusunu toplayın . 23 ve örnekleri -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. Sütten Sialik Asitlerin İzolasyonu <ol><li> Damıtılmış H2O 88 mL&#39;lik buzlu asetik asit 12 ml ilave edilerek 2 M asetik asit solüsyonu, 100 mL hazırlanması </li><li> 50 mL sütü bir 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın ve hazırlanan sulu asetik asit çözeltisinden 1.2 mL ekleyin. </li><li> Süspansiyonu 80 ° C&#39;de 4 saat inkübe edin ve numuneyi 14.000 xg&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantın en iyi 1.000 μL&#39;sini taze bir 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın ve remÇözücüyü oda sıcaklığında santrifüj buharlaştırmayla kurutun (bağlı vakum pompasına bağlı olarak 4-20 saat sürecektir). Yeniden çözülür damıtılmış H2O 500 uL numune </li><li> Bir mikro-anyon değişim sütunu hazırlayın. Bu adım, özellikle anyonik bileşiklerin zenginleşmesine ve süt ve karaciğer örneklerinden katyonik ve nötr bileşiklerin uzaklaştırılmasına ve dolayısıyla florojenik OPD etiketleme maddesinin sialik asit türetilmesi için seçiciliğini arttırır. <ol><li> Her numune için, 200 mg anyon değişim reçinesi (Dowex 1X8), boş bir 3 ml sütun tüplerine, bağlı bir musluk ile aktarın. </li><li> Reçinedeki klorür iyonlarını asetat iyonlarıyla değiştirmek için aşama 3.1&#39;de hazırlanan sulu asetik asit çözeltisinin 2 mL&#39;si ilave edin. Çözücü reçinenin üst kısmına ulaştığında musluğu kapatın. </li><li> Damıtılmış H 2 O damla damla 2 mL hafifçe ilave edin, musluğu açın ve çözücünün çoğuna ulaştığında akışını durdurunReçinenin üstü. Reçinenin daima solvent ile kaplandığından emin olun. </li><li> Fazla asetat çıkarılması için damıtılmış H2O 2 mL reçine sütun iki kez daha yıkanır. </li></ol></li><li> Elde edilen 500 μL örnek solven 3.4 adımından aktarılır. Reçine sütun üzerine yerleştirin ve akışı atın. Yavaşça 1.5 mL bir 50 mM amonyum asetat solüsyonu 1 ml kullanılarak reçineden örnek anyonlar (amonyum asetat 386 mg damıtılmış H2O, 100 mL) damıtılmış H2O Elute 2 mL reçine yıkama Santrifüj tüpü. Solvent, oda sıcaklığında kuruyana kadar santrifüj buharlaştırma ile çıkarılır. NOT: Kuru numuneler en fazla 12 ay süreyle 4-6 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 4. Karaciğer dokusundan Sialik Asitlerin İzolasyonu <ol><li> 20-50 mg fare karaciğeri yavaşça çözündürün ve bir Dounce doku öğütücüsüne (1 mL veya 2 mL hacim) aktarın. 1.2 mL sulu asetik asit çözeltisiAdım 3.1&#39;de hazırlanan ve dokuyu 10 saniye boyunca hafifçe keserek homojenize edin. Nihai süspansiyon 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarılır. </li><li> Adımları takip edin 3.3. 3.6&#39;ya kadar. NOT: Kuru numuneler en fazla 12 ay süreyle 4-6 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 5. Karışık bir Sialik Asit Standardının Hazırlanması <ol><li> Analitik bir balansda 1-5 mg santrifüj tüpüne 5-8 mg N-asetilnöraminik asit tartılır. Kesin ağırlık not edin ve her mg için damıtılmış H2O 164 mcL (yani Neu5Ac ağırlığı 7.2 mg, sonra 7.2 = 1 x 164, damıtılmış H2O 181 mcL ise). Bu, -20 ° C&#39;de 12 aya kadar depolanabilen 20 mM Neu5Ac stok solüsyonuyla sonuçlanır. </li><li> N-glikolneukaminik asit, 1 mg&#39;lık alikotlar gibi orta bir fiyatla daha küçük miktarlarda alın. Bir ~ 20 mM Neu5Gc stok solüsyonu elde etmek üzere bileşik 2 O direkt olarak distile H 154 uL ekleyin. AktarınSolüsyonu 1.5 mL&#39;lik santrifüj tüpüne eklenir. Bu çözüm -20 ° C&#39;de 12 aya kadar depolanabilir. </li><li> Adım 5.1 ve 5.2&#39;deki her stok solüsyondan 5 μL, taze bir 1.5 mL santrifüj tüpüne birleştirin ve kuruyana kadar oda sıcaklığında santrifüj buharlaştırarak çözücü çıkartın. NOT: Karışık sialik asit standardı 4 - 6 ° C&#39;de 12 aya kadar depolanabilir. </li></ol> 6. Sialik Asitlerin Flüoresan Türetilmesi <ol><li> O-fenilendiamin 100 mg ve 10 ml sodyum hidrojen sülfit 208 mg oluşan 10 ml OPD-solüsyonunun hazırlanması H2O damıtılmış </li><li> Fare sütünün (adım 3), fare karaciğeri (adım 4) veya karışık sialik asit standardından (adım 5) türetilmiş sialik asit örneklerine 20 μL OPD çözeltisi ekleyin. 30 saniye boyunca şiddetle girdap edin ve örnekleri karanlıkta 80 ° C&#39;de 4 saat inkübe edin ( yani mikro tüpleri alüminyum folyoya sarın). </li><li> Örnekleri 5 dakika soğumaya bırakın, 80 μ ekleyinDamıtık H2O L ve 1 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de santrifüj tüpleri. </li><li> Süpernatandan 80 μL, 300 μL&#39;lik yüksek kurtarma HPLC şişesine aktarın. Türetilmiş sialik asit örnekleri, bir haftaya kadar 4-6 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 7. Sialik Asit Türevlerinin HPLC Analizi <ol><li> Çevrimiçi flüoresan dedektörüne bağlı standart bir HPLC sistemi kullanarak numuneleri analiz edin. </li><li> Analiz için 250 mm uzunluğunda ve 4.6 mm çaplı standart boyutlara sahip ters faz C18 sütun kullanın. </li><li> 200 mL stok solüsyonunu 800 mL LCMS dereceli su (LCMS - sıvı kromatografi kütle spektrometresi) ile seyrelterek solvent A hazırlayın. Stok çözeltisinin kendisi aşağıdaki gibi hazırlanabilir: <ol><li> LCMS dereceli H2O 800 mL formik asidin 46 g &#39;ekleme </li><li> Damla damla amonyum hidroksit çözeltisi (puriss. Pa) ilave ederek pH&#39;ı 4.5&#39;e ayarlayın. </li><li> Solventi birLCMS dereceli H 2 O ile 1000 mL&#39;ye kadar doldurun. Bu stok çözeltisi 4 - 6 ° C&#39;de 3 aya kadar depolanabilir. </li></ol></li><li> B çözücüsü için LCMS dereceli asetonitril kullanın. </li><li> Sialik asit türevlerini 1 mL / dakika akış oranında aşağıdaki gradyanlı elüsyon ile ayırın: <ol><li> Önce çözücü A&#39;ya karıştırılmış B çözücüsü% 10 eklenerek başlanmalıdır. </li><li> 0 dakikadan 15 dakikaya kadar, solvent B oranını yavaşça doğrusal bir gradyanla% 60&#39;a yükseltin. </li><li> 15 dakika ila 16 dakika arasında, solvent B oranını% 60 ila% 90 arasında doğrusal bir gradyanla hızla arttırın. Bu, HPLC kolonunun yıkanmasını başlatır. </li><li> HPLC sütununu daha da yıkamak için, 18 dakika ile 19 dakika arasında çözücünün B düzeyini% 10&#39;a kadar kademeli olarak düşürmeden önce, çözücünün B seviyesini 16 dakika ile 18 dakika arasında% 90 seviyesinde tutun. </li><li> HPLC sütununu,% 19 B başlangıç ​​koşullarına 19 ila 24 dakika arasında yeniden dengeleyin. </li></ol></li><li> İçinde50 μL numuneyi HPLC sistemine verin. </li><li> 373/448 nm floresan dedektör uyarma / emisyon dalga boylarını kullanarak eluentleri izleyin ve türevlendirilmiş sialik asitlerin yaklaşık tutma süreleri 9 dakika (Neu5Gc-OPD için) ve 10 dakika (Neu5Ac-OPD için) beklenebilir. </li><li> Neu5Ac (A Neu5Ac ) ve Neu5Gc&#39;nin (A Neu5Gc ) floresan zirve bölgelerinden Neu5Gc&#39;nin (F Neu5Gc ) göreli miktarını aşağıdaki gibi hesaplayın: F Neu5Gc [100] = 100 x A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). Homozigot Cmah knock-out fare F Neu5Gc&#39;den süt ve karaciğer örnekleri% 0 olmalı, oysa heterozigot ve vahşi tip F Neu5Gc değerleri fare yaşına ve doku türüne (2% Ve&gt;% 90) ve beklenen hata marjları ±% 12&#39;dir. </li></ol>

<ol><li>Lamari, F. N., Karamanos, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+methods+for+sialic+acids+and+critical+evaluation+of+their+biologic+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).</li>
<li>Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+the+absence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans.</a> J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).</li>
<li>Chou, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+human+CMP-sialic+acid+hydroxylase+occurred+after+the+Homo-Pan+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).</li>
<li>Rehan, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Glycomics+of+Livestock%3A+Discovery+of+Highly+Sensitive+Serum+Biomarkers+Indicating+an+Environmental+Stress+Affecting+Immune+Responses+and+Productivity+of+Holstein+Dairy+Cows%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows.</a> J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).</li>
<li>Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+ganglioside+and+glycoprotein+sialic+acid+in+breastfed+compared+with+formula-fed+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants.</a> Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).</li>
<li>Yao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sialic+acids+in+red+meat+by+UPLC-FLD+using+indoxylsialosides+as+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards.</a> Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).</li>
<li>Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+natural+human+antibodies+against+a+nonhuman+sialic+acid+that+metabolically+incorporates+into+activated+and+malignant+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells.</a> J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).</li>
<li>Byres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+non-human+glycan+mediates+human+susceptibility+to+a+bacterial+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin.</a> Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).</li>
<li>Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+human-specific+mechanism+for+diet+and+antibody-mediated+inflammation+in+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).</li>
<li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li>
<li>Svennerholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+sialic+acids.+II.+A+colorimetric+resorcinol-hydrochloric+acid+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method.</a> Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).</li>
<li>Warren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiobarbituric+acid+assay+of+sialic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The thiobarbituric acid assay of sialic acids.</a> J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).</li>
<li>Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+sialic+acids+by+gas+chromatography+of+the+mannosamine+derivatives+released+by+the+action+of+N-acetylneuraminate+lyase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase.</a> J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).</li>
<li>Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+sialic+acids+for+stabilization+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+and+concomitant+differentiation+of+alpha%282+--%3E+3%29-+and+alpha%282+--%3E+6%29-isomers%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).</li>
<li>Hurum, D. C., Rohrer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+sialic+acids+in+infant+formula+by+chromatographic+methods%3A+a+comparison+of+high-performance+anion-exchange+chromatography+with+pulsed+amperometric+detection+and+ultra-high-performance+liquid+chromatography+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods.</a> J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography+method+for+sialic+acid+determination%3A+an+internal+standard+method+and+its+application+to+sialic+acid+analysis+of+human+apolipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22E.+Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein.</a> E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+Center+Marker+GL7+Probes+Activation-Dependent+Repression+of+N-Glycolylneuraminic+Acid%2C+a+Sialic+Acid+Species+Involved+in+the+Negative+Modulation+of+B-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation.</a> Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).</li>
<li>Manzi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+liquid+chromatography+of+sialic+acids+on+a+pellicular+resin+anion-exchange+column+with+pulsed+amperometric+detection%3A+a+comparison+with+six+other+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems.</a> Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).</li>
<li>Hedlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-glycolylneuraminic+acid+deficiency+in+mice%3A+implications+for+human+biology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution.</a> Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Zangala, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genomic+DNA+from+mouse+tails%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of genomic DNA from mouse tails.</a> J Vis Exp. (6), e246(2007).</li>
<li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves%27+muntjac+deer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar J. 6, 169(2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada sunulan protokol, süt ve karaciğer numunelerinin Neu5Gc nispi miktarlarını analiz ederek ve nicelleştirerek homozigot Cmah nakavt farelerinin fenotipik değerlendirmesini sağlar. Analiz, floresans algılama özelliğine sahip standart bir HPLC ayarı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu prosedürün en kritik basamağı, anyon değişim sütunlarının hazırlanması ve anyon değişim kromatografisinin uygulanmasıdır; Reçineyi düzgün şekilde çöktürmek ve doğru yıkama ve elüsyon paylarını toplamak biraz pratik gerektirir. </...

N-asetilnöraminik asit (Neu5Ac) ve N-glikoli-nöraminik asit (Neu5Gc), çoğu memelide en yaygın sialik asitlerdir 1 . Neu5Ac&#39;yi endojen olarak sentezleyebiliyor olsa da, insanlar bir CMP-Neu5Ac hidroksilaz 2 , 3&#39;ü kodlayan CMAH geni üzerinde birincil ekson silinmesi nedeniyle Neu5Gc üretemiyor. Bununla birlikte, hayvana dayalı gıda ürünleri Neu5Gc 4 , 5 , 6&#39;nın diyet kaynaklı olabileceği gibi anti-Neu5Gc antikorlarının üretilmesine ve dolayısıyla Neu5Gc 7&#39;ye karşı bir bağışıklık tepkisinin tetiklenmesine neden olur. Neu5Gc&#39;nin bu besinsel etkisinin kronik inflamasyona ve diğer çeşitli hastalıklara 8 , 9 , 10 katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Neu5Gc&#39;nin h üzerindeki etkilerini kapsamlı olarak anlamak içinUmans, gıda kaynaklı sialik asitlerin etkilerinin sistematik çalışması için bir hayvan modeli son derece arzu edilir. Nakavt farelerinin analizinde polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanan protokoller iyi belirlenmiş ve genotipik değerlendirme için uygun bir yol olmasına rağmen, fenotipin metabolik seviyedeki işlevsel analizi daha spesifik analiz yöntemleri gerektirir. Bir Cmah knock-out fare modelinin fenotipi, karaciğer veya süt örneklerinde sialik asitlerin kompozisyonunu izole ederek ve analiz ederek değerlendirilebilir. Hayvan dokularında sialik asitlerin saptanması için çeşitli yöntemler daha önce bildirilmiştir: sialik asitlerin resorsinol 11 ya da tiobarbitürik asit 12 ile reaksiyona sokulması, bir kromoforik ürünün oluşumuyla sonuçlanır ve basitçe bir platereader temelli kurulum kullanılarak analiz edilebilir ancak sadece toplam siyaliktir Asit içeriği belirlenebilir. Alternatif olarak, sialik asitlerin analizi de gaz kromatografisi13 , MALDI-ToF kitle spektrometrisi 14 veya amperometrik yöntemler 15 . Bununla birlikte, en yaygın olarak uygulanan sialik asit analiz yöntemleri, hidrolitik salıma, bunu takiben floresan türevlendirmeye ve daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisine ( 16 , 17 , 18) dayalıdır.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Kimyasallar: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>N-asetilnöraminik asit</td><td>Sigma</td><td>A0812</td><td></td></tr><tr><td>N-glikolilnöraminik asit</td><td>Sigma</td><td>50644</td><td>1 mg alikot yeterli olmalıdır</td></tr><tr><td>o-Fenilendiamin</td><td>Sigma</td><td>694975</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidrojen sülfit</td><td>J & K Scientific Ltd</td><td>75234</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Aletler/Malzemeler: </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL SPE tüpleri</td><td>Supelco</td><td>Sigma 57024</td><td>boş katı faz ekstraksiyon kolonları</td></tr><tr><td>SPE tüpünün akışını durdurmak için</td><td>Luer musluk</td><td>Sigma</td><td>S7396</td></tr><tr><td>Dowex 1X8</td><td>Dow Chemicals</td><td>Sigma 44340</td><td>200 - 400 mesh</td></tr><tr><td>Dounce doku öğütücü</td><td>Sigma</td><td>D8938</td><td>sıkı uyum</td></tr> <tr><td>< güçlü > HPLC Analizi: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Yüksek geri kazanımlı HPLC şişesi</td><td>Agilent Teknolojileri</td> <td># 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Sistemi</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>HPLC için Floresan Dedektörü</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Sütun</td><td>Phenomenex</td><td>Hiperklonu ODS</td><td>250 x 4,6 mm</td></tr><tr><td>LCMS sınıfı H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS sınıfı Asetonitril</td><td>Merck Millipore</td><td>#100029</td><td>Hypergrade</td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit çözeltisi</td><td>Fluka</td><td>#44273</td><td>saflık.</td></tr></tbody></table>

karaciğer ve süt örneklerinde vahşi tipli ve sialik asitler tayini ve<em&gt; cmah</em&gt; knock-out fare.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (sitidin monofosfat-N-asetilnöramin asit hidroksilaz), memelilerde sitidin monofosfat-N-asetilnöraminik asitlerin oksidasyonundan sorumludur. Bununla birlikte, insanlar CMAH geninin primer ekson silinmesi nedeniyle sitidin monofosfat-N-asetilnöraminik asiti sitidin monofosfat-N-glikoli-nöraminik asite oksitleyemezler . CMAH aktivitesinin eksikliğinin etkilerini ve etkilerini daha ayrıntılı olarak anlamak için, farelerde bir Cmah knock-out modeli, temel ve uygulamalı araştırmalara yoğun ilgi duymaktadır. Bu fare modelinin fenotipini belirlemek için analiz metodu burada detaylı olarak tarif edilmiş olup, vahşi tip ve Cmah nakavt farelerinin karaciğerindeki ve sütünün her ikisinde de N-asetilnöraminasit ve N-glikolenüraminik asitin saptanmasına dayanmaktadır. Endojen sialik asitler serbest bırakılır ve daha sonra HPLC ile analiz edilebilen flüorojenik türevler oluşturmak üzere o-fenilendiamin ile türevlendirilir. Sunulan protokol,Çeşitli başka kaynaklı süt ve doku örneklerinin analizi için de uygulanmış ve N-glikoli-nevüaminik asidin beslenme ve sağlık etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Tanımlanan analiz yönteminin şematik bir görünümü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir ve vahşi tip ve Cmah nakavt mutant farelerinin süt ve karaciğer numunelerinden sialik asitlerin izolasyonu ve bu bileşenlerin flüoresan türetilmesi ve HPLC analizini içerir. Şekil 2 ve Şekil 3 , homo- ve heterozigot nakavt Cmah farelerinden (- / - ve +/-) ve yabani tip farelerden süt ve karaciğer örnekl...

Fare karaciğeri ve sütündeki N-asetilnöraminik asit ve N-glikolenüraminik asitin tayini için HPLC temelli bir yöntem açıklanmaktadır.

Karaciğer ve Süt örneklerinde vahşi tipli ve sialik asitler tayini ve<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Fare.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Bu metodolojinin genel amacı, HPLC analizi kullanarak yabanıl tip ve CMAH nakavt farelerin karaciğer ve sütünde N-Asetilnöraminik asit ve N-Glikolilnöraminik asidin tespit edilmesidir. Bu yöntem, glikosbilim alanındaki soruların, özellikle CMAH fare modellerinin genotiplerinin bu hayvanların gerçek sialik asit içerikleri üzerindeki etkisinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin genetik taramalara kıyasla sahip olduğu temel avantaj, heterozigot fareler için de bağıl sialik asit seviyelerinin belirlenebilmesidir.Bu yöntemi, laboratuvarımızdan iki lisansüstü öğrencisi olan Cui Cao ve Wang Wenjiao değerlendirecek. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde CMAH nakavt farelerden fare sütünün ve fare karaciğer dokusunun toplanmasıyla başlayın. Sütten siyalik asitleri izole etmek için 50 µL sütü 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 1,2 mL hazırlanmış sulu asetik asit çözeltisi ekleyin.Karaciğer dokusundan sialik asitleri izole etmek için, 20 ila 50 miligram fare karaciğerini nazikçe çözdürün ve dounce doku parçalayıcıya aktarın. 1,2 mililitre sulu asetik asit çözeltisi ekleyin ve dokuyu 10 saniye boyunca nazikçe kayma kuvveti uygulayarak homojenize edin. Elde edi

determination-sialic-acids-liver-milk-samples-wild-type-cmah-knock

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Optimal Kesme Sıcaklık orta (OCT) gömülü sabitlenmemiş dondurulmuş doku örneklerinin salgılanan mukus doğal dağıtım ve glikozilasyon incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, doku işleme minimal ve glikolipitler, müsin ve glukanıdır-epitopların doğal sunumu korunur. Doku kesitleri floresan veya kromojenik algılama kullanılarak immünohistokimyasal olarak analiz edilebilir.

Doğal Müsin Dağıtım Eğitim için sabitlenmemiş, Dondurulmuş Dokular kullanma

Bu videoda, floresan tespitine yardımcı olmak için uygun bir floresan etiketleme reaktifi ile türevlendirmeyi takiben yüksek performanslı sıvı kromatografisi, HPLC kullanarak sialik asitlerin, N-asetilnöraminik asit ve N-glikolilnöraminik asidin tespitini gösteriyoruz.

Ters Fazlı Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi: Fare Karaciğerinden İzole Edilen Floresan Etiketli ve Türetilmiş Sialik Asitlerin Kantitasyonu İçin Sağlam Bir Yöntem

Hayvan modellerinden süt toplanması çeşitli araştırma yollarını kolaylaştırır: pasif bağışıklığı anlamak, dikey bulaşmadan sorumlu patojenleri tanımlamak ve hatta transgenik farelerin kullanımı yoluyla insan anne sütünde bulunan proteinlerin ticari üretimi. Burada farelerde ve Reeves'in munçak geyiğinde süt toplama için basit bir yöntem gösteriyoruz.

Fareler ve Reeves &#39;munçağı Deer için Süt Toplama Yöntemleri

Bu makalede açıklanan dolaylı immünfloresan protokol algılama ve fare meme bezinde proteinlerin yerelleştirme verir. Tam bir yöntem olup, meme bezi örnekleri hazırlamak için floresan mikroskobu ile görüntü, doku kesitlerinde immunhistokimya gerçekleştirmek için ve görüntüleri yeniden verilir.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

BM12 lenfositlerinin bir C57BL/6 alıcısına transferi, sistemik lupus eritematozusun yerleşik bir modelidir. Burada, bu modeli kullanarak hastalığın nasıl başlatılacağını ve T foliküler yardımcı hücrelerin, germinal merkez B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini açıklıyoruz.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Sialik asit glycoconjugates içinde bulunan tipik bir yaşam ünitesi var. Moleküler ve hücresel etkileşimlerin bir bolluk ilgilenmektedir. Burada hücre yüzey sialik asit ifadesi N- acetylmannosamine türevleri ile metabolik glycoengineering kullanarak değiştirmek için bir yöntem mevcut.

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Tükürük bezi hypofunction otoimmün hastalığı ve radyasyon terapisi sık bir sonucudur. Bu hastalıkların fare modellerinde Tükürük bezi ile tekrarlanabilir değerlendirilmesi teknik bir sorundur. Burada, tükürük üretim farelerde doğru ve tekrarlanabilir ölçüm için basit bir yöntem açıklanmıştır.

Tükürük bezi işlevi farelerde ölçülmesi için bir yöntem

Bu eser basılı glycan dizi (PGA) teknoloji küçük hayvanlarda Anti-karbonhidrat antikorlar dolaşan analiz için potansiyelini gösterir.

Basılı Glycan dizi: Anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği

Burada dextran sülfat sodyum (DSS) bağışıklık yanıtı düşmesi tadına bakma ilgili genlerin etkisini araştırmak için bir protokol mevcut-inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) fare modeli indüklenen.

Protein Halifeliğin bağırsak iltihabı bir iltihabi bağırsak hastalığı fare modeli üzerinde sinyal tat etkileri

Bu çalışmada, BALB/c farelerde, bu hastalıkta görülen cinsiyet farklılıkları da dahil olmak üzere ilaca bağlı otoimmün hepatitin patogenezini incelemek için kullanılabilecek bir in vivo immünizasyon, translasyonel hepatit modeli tanımlanmıştır. Bu modelin in vivo ve in vitro deneysel teknikler kullanarak tekrarlanabilir analizleri nasıl gösterdiğini açıklayacağız.

Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi

Bu makale, laboratuvar farelerinden süt toplamak için kullanılabilecek bir cihazın nasıl monte edileceğini açıklamaktadır. Bu cihaz uygun fiyatlıdır, taşınabilirdir ve eğitimli bir kişi tarafından 0,1-0,5 mL süt toplanmasına izin verir. Ayrıntılı bir sağım protokolü de dahildir.

Laboratuvar Farelerinden Süt Örneklemesi için Verimli Bir Tek Kişilik Teknik

Keşfedin fare karaciğer ve süt örneklerinde sialik asitlerin HPLC ile tayini yöntemini. CMAH genotiplerinin etkisini inceleyerek glikosains alanında heterozigot farelerde de analiz yapılabilir.

Karaciğer ve Süt örneklerinde vahşi tipli ve sialik asitler tayini ve

Daha fazla video keşfet