Toll benzeri Reseptör Sinyali Önleyicileri İçin Fagositik Bağışıklık Hücrelerinde Biyoaktif Nanopartiküllerin Taranması

Bu tarama prosedürünün genel amacı, toll benzeri reseptör sinyalini inhibe edebilen yeni biyoaktif nanopartikülleri tanımlamaktır. Bu yöntem, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde toll benzeri reseptör sinyalini hedefleyen yeni nanoinhibitörleri fiziksel olarak tanımlamanıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hızlı ve sağlam olması ve raportör hücre sistemleri kullanılarak gerçekleştirilmesinin kolay olmasıdır.

Bu tekniğin uygulamaları birçok enflamatuar hastalığın tedavisine kadar uzanır, çünkü toll benzeri reseptör sinyalizasyonunun bu hastalıkların patogenezinde rol oynadığı bulunmuştur. Bu yöntem altın nanopartiküller üzerinde yüksek tarama sağlayabilse de, diğer nanopartikül sistemlerine, terapötik küçük moleküllere ve biyolojilere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, kültür ortamlarını metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın.

Ardından, 125 mililitrelik temiz bir cam şişeye 100 mililitre ultra saf endotoksin içermeyen su ekleyin. Salgılanan embriyonik alkalin fosfataz substrat tozundan bir torba ekleyin ve çözeltiyi tamamen eriyene kadar hafifçe döndürün. Alt tabakaların tamamen çözünmesini sağlamak için 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

0.2 mikrometrelik bir membran kullanarak çözeltiyi filtreleyin. Kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra, 25 mililitre ultra saf endotoksin içermeyen su içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne bir torba lusiferaz substrat tozu ekleyin.

Toz tamamen çözüldükten sonra, kullanıma hazır olana kadar bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Ardından, diğer tüm reaktiflerin stok çözeltilerini metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Hücreleri kültürledikten ve hazırladıktan sonra, bunları kültür şişesinden bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri beş dakika boyunca 300 kez G'de döndürün. Daha sonra, bunları R-10 ortamında, mililitre başına 1 X 10 ila 6 hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. PMA çözeltisinin alikotlarını, nihai konsantrasyon mililitre başına 50 nanogram olacak şekilde hücre süspansiyonuna ekleyin.

Hücre süspansiyonunu steril bir reaktif haznesine dökün. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu 96 oyuklu düz tabanlı bir kültür plakasının her bir oyuğuna aktarın. 37 santigrat derecede 24 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.

Bundan sonra, kültür ortamını dikkatlice çıkarmak için bir vakum aspiratörü kullanın. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, türetilmiş makrofajların kuyu dibine yapıştığından emin olmak için hücreleri kontrol edin. Her yıkama için kuyu başına 100 mikrolitre PBS kullanarak hücreleri iki kez nazikçe yıkayın.

Ardından, her kuyucuğa 100 mikrolitre taze R-10 ortamı ekleyin. Raportör tahlilini gerçekleştirmeden önce hücrelerin 37 derece Santigrat derecede bir inkübatörde iki gün dinlenmesine izin verin. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi optimal LPS dozunu belirleyin.

Ardından, 96 oyuklu yeni bir düz alt plakanın her bir oyuğuna 180 mikrolitre önceden ısıtılmış Quanti-Blue çözeltisi ekleyin. Ardından, her numuneden 20 mikrolitre süpernatanı plakaya aktarın. Rengin pembeden koyu maviye dönüşmesini sağlamak için 37 santigrat derecede bir ila iki saat inkübe edin.

Optik yoğunluk birin üzerine çıktıktan sonra, 655 nanometrede emilimi belirlemek için bir plaka okuyucu kullanın. IRF aktivasyonunun analizine başlamak için, her numuneden 10 mikrolitre taze süpernatanı 96 oyuklu taze düz tabanlı beyaz bir plakaya aktarın. Otomatik enjeksiyon kullanarak, her oyuğa 50 mikrolitre lusiferaz çözeltisi ekleyin.

Daha sonra, nanopartikül taraması için en uygun LPS konsantrasyonunu belirlemek üzere bir doz yanıt eğrisi oluşturmak için lüminesansı hemen iyice toplayın. Daha sonra, 1.5 mililitre Eppendorf tüplerinde 20 hacim peptid-GMP hibrit çözeltisini 30 dakika boyunca 18.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanları dikkatlice atın.

Melezleri tek bir taze tüpe aktarın ve bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Bundan sonra, yıkanmış hibritleri bir hacim R-10 ortamında tekrar süspanse edin. Konsantre hibritlerin ve R-10 ortamı içeren LPS'nin eşit hacimlerini, hibritlerin ve LPS'nin nihai konsantrasyonu sırasıyla mililitre başına 100 nanomolar ve 10 nanogram olacak şekilde karıştırın.

Ardından, kültür ortamını makrofaj kültür plakasından çıkarın. Her bir oyuğa 100 mikrolitre hibrit LPS karışımı ekleyin, her koşul için üç kopya ile. Bir negatif kontrol ve bir LPS kontrolü ekleyin.

24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, her bir kuyucuğun ortamını ayrı bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri 30 dakika boyunca 18.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Süpernatanları 96 oyuklu yeni bir yuvarlak alt plakaya aktarın. Bu numuneler üzerinde muhabir tahliline başlamak için, yeni bir 96 oyuklu düz alt plakanın her bir oyuğuna 180 mikrolitre önceden ısıtılmış Quanti-Blue çözeltisi ekleyin. Ardından, her numuneden 20 mikrolitre süpernatantı bu plakaya aktarın.

Koyu mavi renk birin üzerinde optik yoğunluğa ulaşana kadar 37 santigrat derecede bir ila iki saat inkübe edin. Bundan sonra, emilimi 655 nanometrede kaydetmek için bir plaka okuyucu kullanın. Daha sonra, her numuneden 10 mikrolitre taze süpernatanı 96 oyuklu berrak düz tabanlı beyaz bir plakaya aktarın.

Otomatik bir enjektör kullanarak, her bir oyuğa 50 mikrolitre lusiferaz çözeltisi ekleyin ve lüminesansı hemen iyi bir şekilde kaydedin. Ardından, potansiyel adayların inhibitör etkisini doğrulayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi TLR özgüllüğünü değerlendirin. Bu çalışmada, NF-Kappa B AP1'in aktivasyonu, LPS tarafından TLR-4 aktivasyonunun NF-Kappa B AP1'in aktivasyonu ve SEAP üretimi ile sonuçlandığı SEAP kolorimetrik testi ile tespit edilmiştir.

Serbest bırakılan SEAP, substratı dönüştürür ve stimülasyon üzerine salınan SEAP miktarıyla orantılı bir renk değişikliğine yol açar. Bu, 655 nanometrede absorbansın ölçülmesiyle ölçülür. Daha sonra, IRF'nin LPS aracılı aktivasyonu, lüminesans üretmek için substratı katalize eden lusiferaz ekspresyonuna yol açtı.

Mililitre başına 10 nanogramlık bir optimal LPS konsantrasyonu, önceden kurulmuş bir peptit-GMP hibritleri kütüphanesini taramak için bu doz yanıtlarından belirlenir. Bundan yola çıkarak, hem NF-Kappa B AP1 hem de IRF için LPS ile tetiklenen aktivasyonu inhibe etme yetenekleri nedeniyle bir grup melez tanımlanır. Bu inhibitör aktivitenin doğrulanması, LPS konsantrasyonu arttıkça, hibritin inhibitör etkilerinin beklendiği gibi azaldığını göstermektedir.

Daha sonra inhibisyon aktivitesini doğrulamak için immünoblotlama yapılır. Kurşun hibritin p65 fosforilasyonunu azalttığı, I-Kappa B alfa bozunmasını inhibe ettiği ve IRF3 fosforilasyonunu geciktirdiği görülmüştür, bu da kurşun hibritin P12'nin LPS aracılık eden TLR-4 sinyalini inhibe edebildiğini doğrular. Ek araştırmalar, P12'nin ayrıca TLR-2 ve TLR-5 aracılı NF-Kappa B AP1 sinyalini ve ayrıca TLR-3 aracılı IRF aktivasyonunu azalttığını ortaya koymaktadır, bu da P12'nin çoklu TLR yolakları üzerinde güçlü inhibitör aktiviteye sahip olduğunu düşündürmektedir.

Bu prosedürü takiben, tarama sonuçlarını doğrulamak ve yanlış pozitif keşfi önlemek için immünoblotlama ve sitotoksisite testi gibi diğer önlemler alınmalıdır. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nanotıp alanındaki diğer araştırmacıların, yeni nesil ve bilgilendirici terapötikler olarak toll benzeri reseptör sinyallemesinde nanoinhibitörleri keşfetmelerinin yolunu açtı.