Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Burada açıklanan tadil edilmiş maya tek hibrid tahlil, herhangi bir işlevsel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamak için klasik maya tek hibrid (Y1H) analizinin bir uzantısıdır.

Bu deneyin genel amacı, düzenli bir laboratuvar ortamında herhangi bir fonksiyonel genomik çalışma için heterolog bir sistemdeki heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamaktır. Bu yöntem, planlı genomik gibi fonksiyonel genomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birden fazla protein veya transkripsiyon faktörü içeren protein DNA etkileşimlerini tespit etmesidir.

Bu prosedüre, birinci gün olarak belirlenecek olan öğleden sonra başlayın. Taze çizgili bir Petri kabından urasil içermeyen sentetik tanımlı veya SD ortamda 5 mililitrelik bir kültüre başlayın. Gece boyunca 30 santigrat derece çalkalayıcıda inkübe edin.

Ertesi öğleden sonra, 10 mililitre YPDA ortamını 500 mikrolitre gece boyunca kültür ile aşılayın ve gece boyunca 30 santigrat derece çalkalayıcıda inkübe edin. Ertesi gün sabahın erken saatlerinde, 100 mililitre YPDA besiyerini 2 mililitre gece kültürü ile aşılayın. Bu taze kültürü, 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,4 ila 0,8'e ulaşana kadar 30 santigrat derecede büyütün.

5 dakika boyunca 1000 kez G ve 21 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı atın. 10 mililitre steril su ekleyin ve peleti girdap yaparak sulandırın.

Beş dakika boyunca 1000 kez G ve 21 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı atın, 2 mililitre TE lityum asetat ekleyin ve peleti girdaplama yoluyla sulandırın. Beş dakika boyunca 1000 kez G ve 21 santigrat derecede santrifüjleyin.

Süpernatanı atın. 4 mililitre TE lityum asetat artı 400 mikrolitre somon sperm DNA'sı ekleyin ve peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Hücreler artık bir sonraki segmentte gösterildiği gibi dönüşüme hazırdır.

Hücrelerin birlikte dönüşümü, 96 kuyulu U-dipli bir karıştırma plakasında gerçekleştirilir. İlk olarak, 96 oyuklu plakada oyuk başına 20 mikrolitre yetkin hücre dağıtın. Daha sonra, kuyucuklara, iki plazmitin her birine 150 nanogram ve normalizasyon kontrolünü ekleyin.

Bu şema, maya hücrelerinin ilgilenilen protein ile birlikte dönüşümü için kurulan genel plakayı göstermektedir. Plaka kurulumu, deneyin ihtiyacına ve test edilen DNA bölgelerinin veya fragmanlarının sayısına göre değiştirilebilir. Oyuk başına 100 mikrolitre TE lityum asetat polietilen glikol ekleyin ve pipetleme ile üç kez karıştırın.

Plakayı nefes alabilen bir conta ile örtün ve 30 santigrat derecede 20 ila 30 dakika inkübe edin. Tam olarak 20 dakika boyunca 42 santigrat derecede ısı şoku. Isı şokundan sonra, 5 dakika boyunca 1000 kez G ve 21 santigrat derecede santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. 110 mikrolitre TE ekleyin ve karıştırın. 5 dakika boyunca tekrar santrifüj edin.

Her kuyucuktan 100 mikrolitre süpernatan çıkarın. Bir zımbayı %100 etanole batırın, alevlendirin, zımba pimlerinin soğuması için bir dakika bekleyin ve ardından peleti yeniden süspanse etmek için steril zımbayı kullanın. Hücreleri SD triptofan üzerine aktarın ve lucine bırakma burgu plakaları.

Plakaları iki gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Beşinci günün öğleden sonrasında, burgu plakalarını inkübatörden alın. Steril 96 kuyulu u-dipli karıştırma plakasının her bir kuyusunu 50 mikrolitre TE ile doldurun. TE'de steril bir zımbayı önceden ıslatın, kolonileri SD triptofan ve lucine bırakma plakasından delin ve bunları TE dolgulu plakada yeniden süspanse edin.

Optimum yüzey kaplaması için kolonileri yeni SD triptofan ve lucine bırakma burgu plakalarına aktarın. Plakaları 2 gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. 7. günün öğleden sonrasında, burgu plakalarını inkübatörden alın.

Steril 96 kuyulu u-dipli karıştırma plakasının her bir kuyusunu 50 mikrolitre SD triptofan ve lucine bırakma ortamı ile doldurun. Steril 96 derin kuyu bloğunun her bir kuyusunu 180 mikrolitre SD triptofan ve lucine bırakma ortamı ile doldurun. Zımbayı sterilize edin, zımbayı ve ortamı önceden ıslatın ve kolonileri plakadan her biri 50 mikrolitre ortam içeren kuyucuklara aktarın.

20 mikrolitre mayayı 180 mikrolitre SD triptofan ve lucine bırakma ortamına aktarın. Bloğu nefes alabilen bir conta ile kapatın ve 36 saat çalkalayarak 30 santigrat derecede inkübe edin. Dokuzuncu günün sabahı, sterilize edilmiş 96 derin kuyu bloğunda 100 mikrolitre kültürü 500 mikrolitre YPDA ortamına aktarın.

Nefes alabilen bir conta ile örtün ve üç ila beş saat boyunca 200 rpm'de çalkalama ile 30 santigrat derecede inkübe edin. Üç ila beş saat sonra, kültürü yeniden askıya alın ve her bir oyuktan 125 mikrolitreyi bir spektrofotometre plakasına aktarın. 0,3 ile 0,6 arasında olduğundan emin olmak için optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün.

Derin kuyu bloğunda kalan hücreleri 10 dakika boyunca 3000 kez G ve 21 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı ters çevirerek çıkarın. Her kuyucuğa 200 mikrolitre Z tamponu ekleyin ve girdap yapın.

Beş dakika boyunca 3000 G ve 21 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı ters çevirerek çıkarın. Her kuyucuğa ve girdaba 21 mikrolitre Z tamponu ekleyin.

Plakayı donma, çözülme döngülerine dayanıklı sızdırmazlık folyosu ile örtün. Çeker ocakta, sıvı nitrojen ve 42 santigrat derece su banyosu kullanarak 4 döngü donma/çözülme gerçekleştirin. Her oyuğa 200 mikrolitre taze hazırlanmış Z tampon beta merkaptoetanol ONPG çözeltisi ekleyin.

30 santigrat derecede 17 ila 24 saat veya renk gelişene kadar inkübe edin. 10. günün sabahında rengin gelişip gelişmediğini kontrol edin. Reaksiyonu durdurmak için her oyuğa 110 mikrolitre bir molar sodyum karbonat ekleyin.

Zamanı kaydedin ve plakayı girdaplayın. On dakika boyunca 3000 kez G ve 21 santigrat derecede santrifüjleyin. Her kuyucuktan 125 mikrolitre süpernatanı bir spektrofotometre plakasına aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.

Optik yoğunluğu 420 nanometrede ölçün. Metin protokolünde açıklandığı gibi bir elektronik tablodaki beta galaktosidaz aktivitesini hesaplayın. Bu çalışmada, transkripsiyon başlangıç bölgesinin başlangıcından yukarı akışta 2600 baz çiftinin promotör bölgesi, altı bölgeye veya fragmana bölünmüştür.

Bu fotoğraf, protokolün beşinci gününden sonra iyi yetişmiş ve pozitif bir plaka örneğidir. Bu temsili sonuçta, bir ve dört DNA fragmanları, protein A ve B kompleksi ile pozitif etkileşim gösterir. Beta golactisidase aktivitesinin ölçümü üzerine, birinci fragman, raportör gen aktivitesinin dört kat indüksiyonunu gösterir.

Bu prosedürün, yalnızca önerilen protein protein etkileşiminin doğrulanmasından sonra DNA bölgeleri hakkında bilgi edinmek için önerildiğini ve hedef bölgeler hakkında bilgi sağlamak için tasarlanmadığını hatırlamak önemlidir. Bu prosedürleri takiben, ek soruları yanıtlamak için çip tahlili ve Msar gibi diğer yöntemler hazırlanabilir. Örneğin, hedef siteleri in vivo olarak belirlemek.

Bu videoyu izledikten sonra, ortak bir DNA hedefine bağlanan multimerik protein komplekslerinin rolünü nasıl test edeceğinizi ve doğrulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.