Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Bu deneyin genel amacı, standart bir laboratuvar ortamında herhangi bir fonksiyonel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamaktır. Bu yöntem, planlı genomik gibi fonksiyonel genomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birden fazla proteini veya transkripsiyon faktörünü içeren protein-DNA etkileşimlerini tespit edebilmesidir.

Bu prosedüre, birinci gün olarak belirlenecek günün öğleden sonrasında başlayın. Yeni ekilmiş bir Petri kabından, urasil içermeyen sentetik tanımlı veya SD ortamında 5 mililitrelik bir kültür başlatın. 30 derece Celsius sıcaklıktaki bir çalkalayıcıda gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün öğleden sonra, 10 mililitre YPDA besiyerine 500 mikrolitre gece boyu kültürü ekleyin ve 30 derece Celsius'luk bir çalkalayıcıda gece boyu inkübe edin. Ertesi gün sabah erken saatlerde, 100 mililitre YPDA besiyerine 2 mililitre gece boyu kültürü ekleyin. Bu taze kültürü, 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,4 ile 0,8 değerine ulaşana kadar 30 derece Celsius'da büyütün.

1000 ×g'de ve 21 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın. 10 mL steril su ekleyin ve pelletle vorteksleyerek yeniden süspanse edin.

1000 ×g ve 21 °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın, 2 mL TE lityum asetat ekleyin ve peleti vorteksleyerek yeniden süspande edin. 1000 ×g ve 21 °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı atın. 4 mililitre TE lityum asetat ve 400 mikrolitre somon spermi DNA'sı ekleyin ve peleti pipetle yukarı-aşağı çekerek yeniden süspande edin. Hücreler, bir sonraki bölümde gösterildiği üzere artık transformasyon için hazırdır.

Hücrelerin ko-transformasyonu, 96 kuyucuklu U-tabanlı bir karıştırma plakasında gerçekleştirilir. İlk olarak, 96 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna 20 µL kompetan hücre dağıtın. Ardından, kuyucuklara iki plazmidin her birinden 150 ng ve normalizasyon kontrolü ekleyin.

Bu şema, maya hücrelerinin ilgilenilen protein ile ko-transformasyonu için genel plaka düzenini göstermektedir. Plaka düzeni, deneyin gereksinimlerine ve test edilen DNA bölgelerinin veya fragmanlarının sayısına göre modifiye edilebilir. Her kuyuya 100 µL TE lityum asetat polietilen glikol ekleyin ve pipetleme yoluyla üç kez karıştırın.

Plakayı nefes alabilen bir sızdırmazlık malzemesiyle kapatın ve 30 °C'de 20 ila 30 dakika boyunca inkübe edin. Tam olarak 20 dakika boyunca 42 °C'de ısı şoku uygulayın. Isı şokundan sonra, 1000 ×g'de ve 21 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırmak için çok kanallı bir pipet kullanın. 110 µL TE ekleyin ve karıştırın. 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.

Her kuyucuktan 100 µL süpernatantı uzaklaştırın. Bir puncher'ı %100 etanol içine daldırın, alevle sterilize edin, puncher iğnelerinin soğuması için bir dakika bekleyin ve ardından pellet'i yeniden süspande etmek için steril puncher'ı kullanın. Hücreleri SD triptofan ve lusin eksiklikli agar plakalarına aktarın.

Plakaları 30 °C'de iki gün boyunca inkübe edin. Beşinci günün öğleden sonrasında, auger plakalarını inkübatörden çıkarın. Steril 96 kuyucuklu u-tabanlı karıştırma plağının her bir kuyucuğunu 50 µL TE ile doldurun. Steril bir puncher'ı TE ile önceden ıslatın, kolonileri SD triptofan ve lösin eksiklik plağından punch ile alın ve bunları TE ile doldurulmuş plakta yeniden süspande edin.

Optimal yüzey kaplaması için kolonileri yeni SD triptofan ve lösin eksikliğindeki agar plaklarına aktarın. Plakları 30 °C'de 2 gün boyunca inkübe edin. 7. günün öğleden sonrasında, agar plaklarını inkübatörden çıkarın.

Steril 96 kuyucuklu u-tabanlı karıştırma plağının her kuyucuğunu 50 µL SD triptofan ve lösin eksiltilmiş besiyeri ile doldurun. Steril 96 derin kuyucuklu bloğun her kuyucuğunu 180 µL SD triptofan ve lösin eksiltilmiş besiyeri ile doldurun. Deliciyi sterilize edin, deliciyi ve besiyerini önceden ıslatın ve kolonileri plaktan, her biri 50 µL besiyeri içeren kuyucuklara aktarın.

20 µL mayayı, 180 µL SD triptofan ve lösin eksiltme ortamına aktarın. Bloğu hava geçiren bir sızdırmazlıkla kapatın ve 30 °C'de çalkalamalı olarak 36 saat boyunca inkübe edin. Dokuzuncu günün sabahında, kültürden 100 µL'yi sterilize edilmiş 96 derin kuyucuklu bir bloğun içindeki 500 µL YPDA ortamına aktarın.

Hava geçiren bir kapakla kapatın ve 200 rpm hızda çalkalayarak 30 degrees Celsius sıcaklıkta üç ila beş saat inkübe edin. Üç ila beş saat sonra, kültürü yeniden süspande edin ve her kuyucuktan 125 microliters'ı bir spektrofotometre plakasına aktarın. Optik yoğunluğun 0.3 ile 0.6 arasında olduğundan emin olmak için 600 nanometers'de ölçüm yapın.

Derin kuyucuk bloğundaki kalan hücreleri 3000 ×g'de ve 21 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı ters çevirerek uzaklaştırın. Her kuyucuğa 200 µL Z tamponu ekleyin ve vorteksleyin.

3000 G ve 21 degrees Celsius'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı ters çevirerek uzaklaştırın. Her kuyucuğa 21 microliters Z tamponu ekleyin ve vorteksleyin.

Plakayı, dondurma-çözme döngülerine dayanıklı sızdırmazlık folyosu ile kapatın. Bir çeker ocakta, sıvı nitrojen ve 42 °C su banyosu kullanarak 4 döngü dondurma/çözme işlemi gerçekleştirin. Her kuyucuğa 200 µL taze hazırlanmış Z tamponu beta merkaptoetanol ONPG çözeltisi ekleyin.

30 °C'de 17 ila 24 saat boyunca veya renk oluşana kadar inkübe edin. 10. günün sabahında, rengin oluşup oluşmadığını kontrol edin. Reaksiyonu durdurmak için her kuyucuğa 1 M sodyum karbonatın 110 µL'sini ekleyin.

Zamanı kaydedin ve plakayı vorteksleyin. 3000 ×g ve 21 °C'de on dakika boyunca santrifüjleyin. Her kuyucuktan 125 µL süpernatanı bir spektrofotometre plakasına aktarmak için çok kanallı pipet kullanın.

420 nanometredeki optik yoğunluğu ölçün. Beta galaktosidaz aktivitesini, metin protokolünde açıklandığı şekilde bir hesap çizelgesinde hesaplayın. Bu çalışmada, transkripsiyon başlangıç noktasının 2600 baz çifti yukarısındaki promotör bölgesi altı bölgeye veya fragmana ayrılmıştır.

Bu fotoğraf, protokolün beşinci gününden sonra iyi gelişmiş ve pozitif bir plakanın örneğidir. Bu temsilci sonuçta, bir ve dört numaralı DNA fragmanları, protein A ve B kompleksi ile pozitif etkileşim göstermektedir. Beta galaktosidaz aktivitesi ölçüldüğünde, birinci fragman raporlayıcı gen aktivitesinde dört kat artış göstermektedir.

Bu prosedürün, yalnızca önerilen protein-protein etkileşimi onaylandıktan sonra DNA bölgeleri hakkında bilgi edinmek için tavsiye edildiği ve hedef bölgeler hakkında bilgi sağlamak amacıyla tasarlanmadığı unutulmamalıdır. Bu prosedürlerin ardından, ek soruları yanıtlamak için ChIP analizi ve Msar gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Örneğin, hedef bölgelerin in vivo olarak belirlenmesi sağlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ortak bir DNA hedefine bağlanan multimerik protein komplekslerinin rolünün nasıl test edileceği ve doğrulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.