Name: Dopaminerjik Homeostasis farelerde yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi ve Synaptosomal dopamin alımı kullanımı tarafından değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Öğrenin farelerde dopamin homeostazını değerlendirmek için sinaptosomal dopamin alımı ve yüksek performanslı sıvı kromatografi analizi yöntemlerini. Bu teknikler dopamin taşıyıcı fonksiyonunu ve doku içeriğini ölçmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser UCPH 2016 Program of Excellence (U.G., A.R., KJ) tarafından desteklenen, Lundbeck Vakfı (MR) Lundbeck Vakfı Merkezi Biomembranes içinde Nanomedicine (U.G.), Ulusal Enstitüsü, sağlık hibe P01 DA 12408 (U.G.), Danimarka için Bağımsız araştırma - tıbbi Bilimler (U.G.) Konseyi.

Danimarkalı hayvan deney Müfettişliği yönergeleri (izni numarası: 2017-15-0201-01160) takip etti ve bir tam akredite AAALAC tesis yerel hayvan refahı gözetiminde yapılan deneyler Komitesi.
 1. synaptosomal dopamin alımı (yöntem 1) Not: Bu protokol iki beyin paralel değerlendirilmesi için ama başarılı bir şekilde synaptosomal DA alımı deneyler ile dört beyinlerinde gerçekleştirmek için kullanılabilir paralel.
<ol><li>Başına Tablo 1 (24 her beyin için) hazırlıklar <ol><li>Etiket 48 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri. Örnekler arasındaki karışıklığı önlemek için her beyne ait tüpler için farklı renkler kullanın</li> <li>Etiket 51 mercek tüpler #1-51.</li>
		<li>Yer fosfat arabelleğe alınmış serum (PBS) buz üzerinde. Bu beyin soğuk tutmak için kullanılacaktır.</li>
		<li>4'e önceden soğutmak için izin vermek için santrifüj açmak ° C.</li>
		<li>Synaptosomal hazırlık (Bölüm 2.6) sırasında tam doku kilo almak için iki mikro-santrifüj tüpleri önceden tartmak.</li>
		4 mM HEPES ve 0.32 M Sükroz karıştırma tarafından <li>hazırla homojenizasyon arabellek. PH 7.4 için ayarlamak ve buz üzerinde tutmak 
		Not: Homojenizasyon arabellek olabilir aliquots-20 ° C'de muhafaza ve denemenin gün çözdürülen.</li>
		<li>Hazırlama Alım arabelleği aşağıdakileri birleştirerek: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/M), 5 mM D-glikoz (0.991 g/L). PH 7.4 NaOH (sodyum konsantrasyonu yaklaşık 130 mm yol açar) ile için ayarlamak ve buz üzerinde tutmak 
		Not: 1500 mL alımını arabellek 2 beyin için hazır olun. 10 x askorbik asit ve 4'te sürekli glukoz olmadan hisse senedi çözüm olarak Alım arabelleği hazırlamak askorbik asit ve glukoz ilave ° C. olun 1 x çalışan çözüm gününde taze. NaOH ile pH 7.4 için ayarlamak.</li>
		<li>Hazırlama alımını tampon + ligand aşağıdaki birleştirerek: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/M), 5 mM D-glikoz (0.991 g/L), 1 mikron pargyline, 100 nM desipramin, 10 nM Katekol-O-metil-transferaz (COMT) inhibitörü. PH 7.4 NaOH ile uyum ve buz üzerinde tutmak 
		Not: 50 mL alımını arabellek kullanın ve ligand ekleyin. Pargyline, oksidasyon monoamin oksidaz (MAO) aracılığıyla DA bozulması önlemeye yardımcı olmak için eklenir. COMT inhibitörü (RO-41-0960) DA (genel olarak katekolaminler) aracılığıyla COMT bozulma önlemek için eklenir. Desipramin norepinefrin ve serotonin taşıyıcıları aracılığıyla alımını inhibe ve böylece alımı sonuçları buluşman için belirli yapmak eklenir</li>
		<li>Hazırlama alımını tampon + ligand + aşağıdakileri birleştirerek kokain: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/L) 5 mM D-glikoz (0.991 g/L), 1 mikron pargyline, 100 nM desipramin , 10 nM COMT inhibitörü, 500 mikron kokain. PH 7.4 NaOH ile için ayarlamak ve buz üzerinde tutmak 
		Not: 7 mL alımını tampon + ligand kullanıp kokain ekleyebilirsiniz. Kokain (SERT ve NET desipramin tarafından yukarıda açıklandığı gibi inhibe beri) sadece DAT özgü alımını bırakarak bir arka plan ölçüm verileri, çıkarmak için non-spesifik DA Alım elde etmek için eklenir. Alternatif olarak, son derece güçlü ve belirli DAT inhibitörü GBR-12935, kullanılabilir yerine. 
		Önemli: buzda şu andan . her şeyi tutmak</li>
	</ol></li> <li>Synaptosomal hazırlık <ol><li>servikal çıkması ve işten çıkarma tarafından bir defada tek bir fare kurban.</li>
		<li>Kafatası açığa vurmak ve işten çıkarma kafatası soldan herhangi bir aşırı doku arka kesmek için makas kullanarak deriyi kesme. Kafatası anteriorly mümkün olduğu kadar biten sutura sagittalis boyunca küçük düz makasla kes.</li>
		<li>İki makas ipuçları fare her gözlerinin içine yerleştirin ve kafatası ve bozulmamış beyin kısmı kaldırmak için kafatasını kesti. Hızla beyin çıkarın ve buz gibi PBS yerleştirin. Bu soğuk tutacak, ikinci beyin disseke.</li>
		<li>Bir beyin matrisi kullanarak teşrih striatum 3 mm koronal dilim (ön-arka: +1.5 mm den-1.5 mm) bir zımba ile ince diseksiyon izledi. Yumruk alan için bkz: şekil 1.</li>
		<li>Doku buz üzerinde her zaman ilerlemeye de devam.</li>
		<li>Tartmak için 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü doku transferi. 
		Not: Bu ağırlık 1.2.14 adımda kullanılan.</li>
		<li>Tekrarlama adım 1.2.1-1.2.6 ikinci beyin için.</li>
		<li>Ağırlık her iki beyin yerine elde sonra buz gibi homojenizasyon arabelleği 1 mL içeren bir homojenizasyon cam doku transfer.</li>
		<li>Homojenize bir motor tahrikli havaneli 800 rpm'de, 10 hatta konturları kullanarak doku. 
		Not: Tek bir darbe bir eylem yukarı ve aşağı eşittir, ilk vuruşun yaklaşık 5 olmalıdır s, aşağıdaki 3-4 s. homojenizasyon izotonik ortamda synaptosomes 6 / patlama önlemek önemlidir. Uygun kuvvet ve izotonik orta kullanarak presynaptic terminalleri reseal çevreleyen sitoplazma, sinaptik veziküller, mitokondri ve sitoiskeleti sağlayacaktır 15.</li>
		<li>Homogenate 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü transfer ve kalan homogenate ile 0.5 mL ek homojenizasyon tampon durulama tarafından homojenizasyon bardaktan toplamak.</li>
		Diğer beyin dokusundan homojenize verirken <li>örnek buz üzerinde tutun. Adımları 1.2.12-1.2.13 paralel iki beyin çalıştırın.</li>
		<li>Çekirdekleri cips ve hücre enkaz tarafından Santrifüjü (1000 x g, 10 min, 4° C).</li>
		<li>(Hücre zarlarında ve sitoplazma içeren) süpernatant (S1) yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler için transfer ve 4'te 16.000 x g 20 dk için de santrifüj kapasitesi ° C.</li>
		<li>(Sitoplazma içeren) süpernatant atmak ve 40 μL homojenizasyon arabellekte (ham synaptosomes içeren) Pelet (P2) resuspend / (1.2.6. adımda elde ağırlık temel) mg doku. Çok fazla güç synaptosomes kıracak gibi ham synaptosomal kesir p1000 pipet ile hafifçe resuspend. 
		Not: En az 280 μL ile sonuna kadar önemlidir. Eğer değilse, mg başına 40'tan fazla μL ile sulandrarak gerekli olacaktır. Adımları 1.2.1-1.2.13 kısa sürede gerçekleştirilmesi gereken ve buz üzerinde tutulması gerekir sahiptir. Ham synaptosomes homojenizasyon arabellekte resuspended en kısa zamanda buz 6 , 15 , 16 tutulur sürece oldukça kararlı olduklarını.</li>
	</ol></li></ol> 2. Alımı deney <ol><li>ekleyin 440 μL alımını tampon + ligand + kokain için belirlenen 12 1.5 mL microcentrifuge tüpler ve 440 μL alımını tampon + ligand 1.5 mL microcentrifuge tüpler (bkz. Tablo 1 için Düzen) kalan 36. 
	Not: buz 15dk deneye başlamadan önce onları kaldırmak Onları oda sıcaklığına getirmek, ama sonra inhibitörleri korumaya kadar buzda tut.</li>
	<li>Hazırla doyma eğrisi (dopamin (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamin) (91.1 CI/mmol) son çeşitli konsantrasyonlarda (0,031, 0.0625, 0,125, 0,25, 0.5 ve 1,0 mikron)).
	<ol><li>10, 5, 2.5, 1,25, 0.62 ve 0.31 altı 2 mL microcentrifuge tüpler etiket.</li>
		<li>Ekleyin 750 μL alımını tampon + ligand için en düşük sayı 5 microcentrifuge tüplerini.</li>
		<li>Ekleyin 1,455.4 μL alımını tampon + ligand, 14.6 μL dopamin (1 mM), tüp 30 μl 3-H dopamin (11 mikron) etiketli 10.</li>
		<li>Transfer 750 μL tüp 10 5 etiketli Tube etiketli. İyice karıştırın ve 750 μL bu tüpünden 2.5 tüp aktarın. Kalan tüpler bu seyreltme tekrarlamak.</li>
	</ol></li> <li>4 mL alımını arabellek cam mikrofiber filtreleriyle 12 iyi filtre kovanın koyduktan sonra ön durulama.</li>
	<li>Ekleyin 10 μL ilk 24 synaptosomal membran süspansiyon 1,5 mL mikro-santrifüj (bakınız Tablo 1 düzeni için) içeren 440 μL Tampon tüpleri. Girdap dikkatle ve spin aşağı kısa bir süre synaptosomes içinde belgili tanımlık tampon batık emin olmak için. 37 o C 10 dakika süreyle, terk 
	Not: Alımı deney sırasında kez beyin arasında adil karşılaştırma için üzerinde tam olarak önemlidir. Bir kronometre için duyarlığı kullanın.</li>
	Konsantrasyonu 10 ve 5 mikron (Bölüm 2.2) ilk iki sütun ve bırak, 37 o C sallayarak ile 5 min için <li>Ekle 50 μL dopamin. Tam olarak 5 dakika sonra 1 mL buz gibi Alım arabelleği ekleyerek tepki bırak. Konsantrasyon 2.5 ve 1,25 mikron (Bölüm 2.2) ve sonra konsantrasyon 0.62 ve 0.31 mikron ile aynı işlemi uygulayın.</li>
	<li>Örnekleri için önceden durulanır mikrofiber filtreler ekleyin ve 5 x 4 mL buz gibi Alım arabelleği ile yıkayın. İlk 12 örnekleri süzgeçlerle eklendiğinde, filtreleri mercek tüpler için hareket. Bu sonraki 12 örnekleri ile yineleyin.</li>
	<li>Tekrarlama adım 2,4-2,6 sonraki beyin için.</li>
	<li>Hazırlamak 3 max-sayma tüpler bir mikrofiber filtre mercek tüpler 49-51 dibine yerleştirip 25 µL üstünde tepe (10 mikron) en fazla dopamin konsantrasyon ekleme.</li>
	<li>Tüm 51 mercek tüplerde bir duman Başlık 1 h. için bırakın</li>
	<li>Ekle 3 mL mercek sıvı her mercek tüp ve shake üzerinde bir shaker için 1 h. dinç</li>
	<li>Sayısı [3 H]-beta-Counter 1 dk. DA
	<ol><li>Programı açın ve seçin: Label: H-3, plaka/filtre: 4 mL flakon, 4 ile 6, tahlil türü: Normal ve zaman sayma: 1 dk. 
		Not: Bu adımı ertesi gün daha rahat yapılabilir. Gece boyunca kalay folyo ile kaplı örnekleri bırakın.</li>
	</ol></li> <li>Protein tayini <ol><li>synaptosomes fmol/dk/μg sayar min (BGBM) başına gelen ayarlamalar ve Alım uygun karşılaştırma için protein konsantrasyonları belirlemek için bir standart BCA Protein tahlil kit kullanın Örnekler arasındaki.</li>
	</ol></li></ol> 3. Veri analizi eğrisi her grup için ve Michaelis Menten sürekli (K M) ve (V max) reaksiyon hızını hesaplamak bir doygunluk yapmak <ol><li>Kullanım anlamazdın verilerden deney. 
	Not: Yarısı V maksimum ulaşmak için gerekli substrat konsantrasyonu K M değeri yansıtır. Buna göre V max yansıtır doğrudan yüzeyi ve nasıl kendi faaliyet ardından değişiklikler ve/veya etkileşen proteinler tarafından yanı sıra modülasyonlu üzerinde DAT sayısına bağlıdır (en fazla Alım kapasitesi), DAT fonksiyonu değişiklikler iyon gradyanlar içinde. K M değer substrat benzeşme ışınlama için dolaylı bir ölçüsüdür bu önemlisi de can modülasyonlu ardından değişiklikler ve/veya etkileşen proteinler tarafından. Tam fonksiyonel değişiklikler değerlendirmek için bu nedenle doğrudan örneğin bir yüzey biotinylation tahlil tarafından yüzey ifade düzeylerini belirlemek önemlidir. Dopamin geri alım ve anlamı üzerinde bir gelişme K M ve V max değerlerden açıklaması Schmitz vd. 17 tarafından gözden.</li>
</ol> 4. Yüksek performanslı sıvı Kromatografi (yöntem 2) <ol><li>beyin diseksiyon <ol><li>etiket ve tartmak microcentrifuge tüpler; bir fare bölgedeki başına.</li>
		<li>Servikal çıkması ve işten çıkarma tarafından bir defada tek bir fare kurban. Hızla beyin 1.2 bölümünde açıklandığı gibi kaldırın. Daha fazla diseksiyon hemen yapmak.</li>
		<li>Bir beyin matrisi kullanarak teşrih NAc ve dStr bir zımba ile ince ikili diseksiyon ardından striatum 3 mm koronal dilim. Yumruk alan için bkz. şekil 3.</li>
		<li>1.5 mL microcentrifuge tüpler doku transferi ve hızlı bir şekilde kuru Buza koyun. Doku tartmak ve hemen geri kuru buza yerleştirin. 
		Not: Doku ağırlık konsantrasyon hesaplaması için daha sonra önemlidir.</li>
		Sonraki fare ile <li>Yinele adımları 4.1.1-4.1.4. 
		Not: doku 80 o C daha fazla işleme kadar yerleştirin veya hemen doku işlemeye devam.</li>
	</ol></li></ol> 5. Doku hazırlık <ol><li>4 ° C-önceden soğutmak izin vermek üzere santrifüj açmak</li> <li>homojenizasyon çözüm (0.1 N Perklorik asit (HClO 4)) hazırlamak ve buz üzerinde tutmak</li>
	<li>Kullanma homojenizasyon çözüm, hazırlamak bir taze 0.1 pmol/μL dopamin standart bir 1 mM hisse senedi çözümden (10.000 x seyreltme). 
	Not: Stok çözüm dopamin homojenizasyon arabelleğe 1 mM, 20 ° C'de bir ay için tutulabilir hisse senedi bir konsantrasyon içinde eriterek tarafından hazırlanmıştır. Beynin diğer alanlarda ilgi varsa, konsantrasyon standart prefrontral korteks dahil olmak üzere diğer beyin bölgeleri beri değiştirilmesi gerekecektir, Hipokampus, gözlemliyorum nigra ve ventral tegmental alan sahip ilâ 100 kere daha az DA striatum için karşılaştırıldığında.</li>
	<li>500 μL homojenizasyon çözüm her örnek için (Yani NAc ve dStr doku; Bölüm 4.1) ekleyin ve bir ultra-homogenizer üzerinde son sürat yaklaşık 30 s. tutmak için kullanarak örnekleri örnek buzlu suda homojenizasyon sırasında lunaparkçı. Her örnek arasında temiz su ile ultra homogenizer (tam hız 30 s).</li>
	<li>Örnekleri için 4 ° c, 14.000 x g. 30 dk santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Transfer yaklaşık 200 μL Örnek 1 mL plastik Ģırınga kullanarak bir cam 0,22 mikron filtre (1 cm çapında). 
	Not: Seçilen filtreler yüksek molekül ağırlıklı maddeler kaldırmak için 0,22 mikron olarak cam filtre kullanımı, önemlidir değil.</li>
	<li>Elektro-kimyasal algılama (EC) tarafından analiz örnekleri-6 bölümde açıklandığı gibi HPLC metodolojisi 18.</li>
</ol> 6. Yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi <ol><li>hazırla aşağıdaki çözüm için mobil faz: sodyum asetat 55 mM, octanesulfonic asit 1 mM, Na 2 EDTA 0.1 mM, Asetonitril % 8, Asetik asit 0.1 M, pH = 3.2. 
	Not: pH 0,1 M Asetik asit ile ayarlayın. PH ile kesin olarak önemlidir. Çözüm degasse olmalıdırd on-line degasser (HPLC sistemi entegre parçası) tarafından. Mobil faz 2 L yapmak ve hakkında ayda bir değiştirin (gürültü fark geldiğinde değiştirmek). Dalgalanmalar nedeniyle mobil faz değiştirdikten sonra ayarlamak için yaklaşık 24 saat sürerse.</li>
	<li>Dedektörü up: <ol><li>Set volt çıkış 700 Og ve sıcaklık dedektörü Fırın 32 ° C için; bu çok önemlidir. Online kılavuzu kullanarak bir Aralık programı olun. Daha fazla ayrıntı için verilen kılavuzuna başvurun). Tablo 2 başına zaman program eklemek. 
		Not: Bu çalışmada, program otomatik olarak, küme saklama zamanlarda, HPLC en iyi mevcut korumak için ve mümkün olduğunca ama hala görünümündeki genişlemiş Kromatografik doruklarına tutmak için geçerli değiştirmek için ayarlanır. Bu fareler gelen striatal beyin lysates için optimize edilmiştir.</li>
	</ol></li> <li>Bulmak-e doğru program eklendiğinde 3 nokta kalibrasyon eğrisi olun, standart enjekte edilerek üç kez (5, 10 ve 15 μL). 
	Not: Standart (10 μL (0.1 pmol/μL x 10 μL 1 pmol DA =)) her onuncu örnek ve örnek için en yakın standart kalibre enjekte. Güzel 3 noktalı standart ayarlama ve Kromatografik beklenen aralıkta gelmek dışarı eğer kontrol belgili tanımlık sistem belgili tanımlık gün önce ayarlayın. Önemli gürültü gözlem yapılırsa, mobil faz değiştirin. Bir tepe 990 mV sonra yeniden enjekte düşük bir ses örnek daha yüksektir, veya yeni bir dizi program ve yeni bir standart eğri olun. Algılama sınırı 3 kez mV en düşük en yüksek değeri için her standart enjekte gürültü değer olarak ölçülür (NA, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT ve 5-HT).
	<ol><li>Kurulum sistem LC çözüm açarak ve analiz 1; Bu başlar çevrimiçi modda etkinleştirme. Kullanıcı kimliğini ve parolasını yazın ve Tamam'ı tıklatın. LC çözüm aletleri için bağlanmak bekleyin. Toplu tabloya git ve veri bilgileri doldurun (örneğin, örnek türü: Standart, analiz türünün örnekleri ve std bilinmeyen: QT, INJ Cilt: 10, ISTD amt: düzey 1 con). Dosyayı Kaydet (gitgidmek eğe - &#62; toplu iş dosyası olarak - kaydet &#62; kaydetmek).</li>
		<li>Yapmak ilk örnek basarak enjekte sistem &#39; toplu başlatmak &#39;. Bu çözelti teslim modülü ile otomatik örnekleyici tarafından 10 μL örnek enjeksiyon içinde sonuçlanacaktır. 
		Not: 0.15 mL/dk ve C18 sütunun bir pompa akış hızı ile ters faz kullanın. Burada bir amperometric dedektörü elektrokimyasal algılama için kullanıldı. Cam gibi karbon elektrot 0.8 V bir Ag/AgCl referans elektrot ile ayarlanmalıdır. Dopamin tahlil, µ Kromatografi 3 kullanmak için (3) C18 ODS (Kromatografik ayırma ulaşmak DA 2 mm x 100 mm, parçacık boyutu 3 µm).</li>
		<li>Kaydedilen ve hesaplanan en yüksek alanlarda ayıklayın.
		<ol><li>Veri toplama örnekleri bittiğinde Kromatografik izlemeye git. Sonrası analizler - Lc gidin &#62; dosya adını (Kromatografik açılacaktır) - açmadı &#62; görünümü'nü tıklatın. El ile tümleştirme çubuğunda entegre olmak için - tüm tepeler eklemek &#62; veri raporuna gitmek ve okuyun çıktısını. 
			Not: Burada veri analizi ve sistem denetimi için LC çözüm yazılım kullanıldı.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Tepe alanlarından bir örneğinde, dopamin konsantrasyonu aşağıdaki gibi standart bilinen konsantrasyon kullanarak hesaplar: <ol><li>(1 pmol eşittir) standardının en yüksek alan faktör A. elde etmek için kullanmak 
		<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56093/56093eq1.jpg" /></li> <li>faktör A toplama örnekleri almak için cihaz. 
		Örnek (içinde pmol başına 10 μL) konsantrasyon = faktör A × pik alanı örnek</li> <li>örnek toplama ng almak için bu formülü kullanın. 
		Örnek konsantrasyon pmol / 10 µL x 500 µL dopamin MW x ng örnek konsantrasyon = örnek (ng) konsantrasyon örnek konsantrasyon (pmol başına 10 μL) 500 μL x = dopamin MW x</li> <li>örnek toplama t almak için ng kullanın pg/g doku konsantrasyon örnek (örnek konsantrasyon pg / doku g pg/g doku =).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+modulation+of+synaptic+transmission+in+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum.</a> Neuron. 76, 33-50 (2012).</li>
<li>Cartier, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+and+functional+protein+complex+involving+dopamine+synthesis+and+transport+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles.</a> J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).</li>
<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6+neurotransmitter+transporters%3A+structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).</li>
<li>Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoamine+transporters%3A+from+genes+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Monoamine transporters: from genes to behavior.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).</li>
<li>Runegaard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+dopaminergic+homeostasis+and+dopamine-related+behaviour+in+hemizygous+TH-Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice.</a> Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).</li>
<li>Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation+of+synaptic+vesicles+from+nerve-ending+particles+%28%27synaptosomes%27%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes').</a> Biochem J. 90, 293-303 (1964).</li>
<li>Hornykiewicz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+%283-hydroxytyramine%29+and+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function.</a> Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).</li>
<li>Schultz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+dopamine+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral dopamine signals.</a> Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperlocomotion+and+indifference+to+cocaine+and+amphetamine+in+mice+lacking+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter.</a> Nature. 379, 606-612 (1996).</li>
<li>Torres, G. E., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+monoamine+transporters%3A+new+visions+of+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).</li>
<li>Jones, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+neuronal+plasticity+in+response+to+inactivation+of+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).</li>
<li>Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slice+biotinylation%3A+an+ex+vivo+approach+to+measure+region-specific+plasma+membrane+protein+trafficking+in+adult+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Rickhag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+PDZ+domain-binding+sequence+is+required+for+striatal+distribution+of+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter.</a> Nat Commun. 4, 1580(2013).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+synaptosome+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Thirty years of synaptosome research.</a> J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).</li>
<li>Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission.</a> J Neurochem. 87, 273-289 (2003).</li>
<li>Yang, L., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+neurotransmitter+levels+in+models+of+Parkinson%27s+disease+by+HPLC-ECD%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD.</a> Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).</li>
<li>Earles, C., Schenk, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotating+disk+electrode+voltammetric+measurements+of+dopamine+transporter+activity%3A+an+analytical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation.</a> Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).</li>
<li>Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+increases+in+nucleus+accumbens+dopamine+after+systemic+cocaine+administration+are+caused+by+unique+characteristics+of+dopamine+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission.</a> J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).</li>
<li>Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+constant+potential+amperometry+for+investigations+of+dopaminergic+neurotransmission+kinetics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo.</a> J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).</li>
<li>Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+regulation+of+dopamine+transporters+by+tyrosine+kinases+in+rat+neuronal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations.</a> J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).</li>
<li>Hansen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+dopamine+transporter+mutations+associate+with+adult+parkinsonism+and+ADHD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD.</a> J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).</li>
<li>Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+substantia+nigra+of+the+human+brain.+II.+Patterns+of+loss+of+dopamine-containing+neurons+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease.</a> Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).</li>
<li>Atack, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+dopamine+by+a+modification+of+the+dihydroxyindole+fluorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay.</a> Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).</li>
<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitive+liquid+chromatographic+method+for+determination+of+neuronal+release+of+serotonin%2C+noradrenaline+and+dopamine+monitored+by+microdialysis+in+the+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex.</a> J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).</li>
<li>Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+neurodegenerative+and+behavioural+changes+induced+by+AAV-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein+in+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons.</a> Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).</li>
<li>Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DOPA+pharmacokinetics+in+the+MPTP-lesioned+macaque+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease.</a> Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).</li>
<li>Mikkelsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPTP-induced+Parkinsonism+in+minipigs%3A+A+behavioral%2C+biochemical%2C+and+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study.</a> Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+dopamine+regulation+in+substantia+nigra+and+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Van Dam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+distribution+of+biogenic+amines%2C+amino+acids+and+cholinergic+markers+in+the+CNS+of+the+C57BL%2F6+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain.</a> Amino Acids. 28, 377-387 (2005).</li>
<li>Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones+affect+neurotransmitters+and+shape+the+adult+female+brain+during+hormonal+transition+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods.</a> Front Neurosci. 9 (37), (2015).</li>
<li>Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+bulb+monoamine+concentrations+vary+with+time+of+day%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day.</a> Neuroscience. 247, 234-241 (2013).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+and+impaired+response+habituation+in+hyperdopaminergic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).</li>
<li>Ungerstedt, U., Pycock, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4371656">Functional correlates of dopamine neurotransmission.</a> Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).</li>
<li>Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Rapid+Dopamine+Dynamics+with+Fast+Scan+Cyclic+Voltammetry+During+Intra-oral+Tastant+Administration+in+Awake+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats.</a> J Vis Exp. , e52468(2015).</li>
<li>Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+phasic+changes+in+extracellular+dopamine+concentration+in+freely+moving+rats+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).</li>
<li>Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+in+vivo+dynamics+of+neurotransmitter+release+and+serotonin+uptake+after+acute+para-methoxyamphetamine+and+3%2C4-methylenedioxymethamphetamine+revealed+by+chronoamperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry.</a> Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu el yazması DA seçim herhangi bir fare modeli homeostazı betimlemek için yararlı deneysel iletişim kurallarını açıklar. Biz ayrıntılı iletişim kuralları DA ölçüm düzeyde beyin dokusu içinde HPLC ve synaptosomal DA alımı yoluyla DAT. fonksiyonel DA ulaşım değerlendirmek için kullanarak fare üzerinden sağlar Yordamlar, iletişim kuralları ve HPLC deney ve synaptosomal DA alımı tahlil aşağıda gelişmiş.
Synaptosomal alımını Protokolü DAT. kombine işlevsellikle bir yüzey biotinylation deney<sup cl...

Dopamin (DA) düzenleyici nörotransmitter motor davranış, ödül ve bilişsel işlev1,7,8,9için kritik olduğunu. Dengesizlikler DA Homeostazı, dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu, uyuşturucu bağımlılığı, depresyon ve Parkinson hastalığı1gibi birkaç nöropsikiyatrik hastalıkların karıştığı. DA presynaptic nöron böylece daha fazla sinyal taşıma nerede bağlar ve tarih öncesi ve postsinaptik membran reseptörleri aktive, sinaptik yarık serbest bırakılır. Synapse yayımlanmasından sonra DA kademede dağınık şekilde ve geçici DAT3,10tarafından kontrol edilir. Taşıyıcı DA ekstrasellüler uzaydan tüketiyor ve böylece fizyolojik DA düzeyleri3,11ayakta tutan. DAT genetik kaldırılması farelerde yükseltilmiş sinaptik DA düzeyleri tarafından karakterize bir hyperdopaminergic fenotip hücre içi DA havuzları ve postsinaptik DAergic10,12sinyal derin değişiklikler tükenmesi neden olur.
Burada, iki ayrı protokol sundu, ölçü birimi DA doku içerik ve Gabriel vd.13 tarafından açıklanan yüzey biotinylation tahlil ile buluşman kombine işlevselliğini değerlendirmek için başka bir yöntem bu iki yöntem DA bilgileri DAT içerik ve işlevsel düzeyleri DA homeostazı ayrıntılı bir değerlendirme için. Bu yöntemler ile DA homeostazı çeşitli transgenik fareler veya hastalık modelleri ile karakterize ve açıklanan. Bu araçlar uygulanan ve en iyi duruma getirilmiş ve laboratuarlarımızda standart kullanılmaktadır. Geçerli deneyleri sonuçları C-terminal DAT14 değiştirme veya Cre recombinase tirozin hidroksilaz (TH) organizatörü 5altında ifade DA homeostazı üzerinde araştırmak için hizmet etmişlerdir.

<table><tbody><tr><td>COMT inhibitörü</td><td>Sigma Aldrich, Almanya</td><td>RO-41-0960</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr> <tr><td>[3H]-Dopamin</td><td>Perkin-Elmer Yaşam Bilimleri, Boston, MA, ABD</td><td>NET67-3001MC</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>Cam mikrofiber filtreler</td><td>GF / C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire</td><td>1822-024</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü</td></tr><tr><td>için HiSafe Sintilasyon sıvısı</td><td>Perkin Elmer</td><td>1200-437</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>MicroBeta2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü</td></tr><tr><td>için BCA Protein Test kiti</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23225</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Life Science</td><td>S7903</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>S3014</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü</td></tr><tr><td>için KCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>P9541</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck KGaA</td><td>10043-52-4</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü</td></tr><tr><td>için MgSO4</td><td>Sigma Life Science</td><td>63065</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0278</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Life Science</td><td>G7021</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>Pargyline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-8013</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>Desipramine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3900</td><td>Sinaptozomal DA alımı için protokol</td></tr><tr><td>Dopamin</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>H8502</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>Kokain</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>C5776</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü</td></tr><tr><td>için Beyin matrisi</td><td>ASI cihazları</td><td>RBM2000C</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü için</td></tr><tr><td>Cafano mekanik teflon bozucu</td><td>Buch & Holm</td><td>Durduruldu</td><td>Sinaptozomal DA alım protokolü (homojenizasyon) içinAntec</td></tr> <tr><td>Decade (Amperometrik dedektör)</td><td>Antec, Leiden, Hollanda</td><td>Durdurulan: yeni model DECADE Elite / Lite&trade; </td><td>HPLC protokolü</td></tr><tr><td>Avantec 0.22 & mu için Elektrokimyasal Dedektör tipi 175 ve 176; HPLC protokolü için m cam filtre</td><td>Frisenette ApS, Danimarka</td><td>13CP020AS</td><td></td></tr><tr><td>Sütun: Prodigy 3 & mu; ODS-3 C18</td><td>Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Almanya</td> Parça Numarası: <td>HPLC protokolü için</td><td>00A-3300-E0</td></tr><tr><td>LC çözüm yazılımı</td><td>Shimadzu</td><td>LabSolutions Serisi İş İstasyonu</td><td>HPLC protokolü için</td></tr><tr><td>Perklor asidi HPLC protokolü için Perklor asidi 0.1M</td><td>Fluka Analitik</td><td>35418-500ml</td><td>(Doku hazırlama) HPLC</td></tr> <tr><td></td><td>protokolü</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için EDTA Sigma E5134-50gNatriumdihidrojenfosfar</td><td>Bie& HPLC protokolü için Berntsen</td><td>1.06346 1000g</td><td>HPLC protokolü için</td></tr> sodyum <tr><td>1-oktansülfonat monohidrat</td><td>Aldrich</td><td>74885 -10g</td><td></td></tr><tr><td>HPLC protokolü için Asetonitril, izokratik HPLC sınıfı</td><td>Scharlau</td><td>AC03402500</td><td>HPLC protokolü için</td></tr><tr><td>Filtre 0.22um</td><td>Frisenette ApS, Danimarka</td><td>HPLC protokolü için Avantec 13CP020AS</td><td>(Doku hazırlama)</td></tr> <tr><td>orto-Fosforik asit %</td><td>85Merck</td><td>1.00563. HPLC protokolü için 1000ml</td><td></td></tr><tr><td>Elektrot</td><td>Antec, Leiden, Hollanda</td><td>AN1161300</td><td>HPLC protokolü için (çevrimiçi kılavuza bakın)</td></tr><tr><td>DECADE II elektrokimyasal dedektör</td><td>Antec, Leiden, Hollanda</td><td>Lite ve ticaret; HPLC protokolü için Elektrokimyasal Dedektör tipi 175 ve 176</td><td></td></tr></tbody></table>

dopaminerjik homeostasis farelerde yüksek performanslı sıvı kromatografi analizi ve synaptosomal dopamin alımı kullanımı tarafından değerlendirilmesi

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamin (DA) bir düzenleyici nörotransmitter kontrol motor aktivite, ödül süreçleri ve bilişsel işlev var. Dopaminerjik (DAergic) neurotransmission bozulma şiddetle Parkinson hastalığı, dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu ve uyuşturucu bağımlılığı1,2 gibi merkezi sinir sistemi ile ilişkili çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ,3,4. Hastalık mekanizmaları DA dengesizlik içeren operasyona eleştirel yönleri hastalıkları taklit etmek için hayvan modellerinde bağımlı, ve böylece DA homeostazı belirli bölümlerini değerlendirmek protokolleri roman yorumlara ve tedavi mümkün sağlamak önemlidir Bu hastalıklar için hedefler.
Burada, o zaman birlikte iki yararlı deneysel protokol mevcut farelerde DAergic sisteminin fonksiyonel bir okuma sağlar. Biyokimyasal ve fonksiyonel parametrelere DA homeostazı DA düzeyleri ve dopamin taşıyıcı (DAT) işlevselliği5değerlendirilmesi ile elde edilir. Ne zaman DA sistemi araştıran, güvenilir bir şekilde endojen DA--dan yetişkin beyin düzeylerini ölçmek için temel yeteneğidir. Bu nedenle, biz mevcut yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) gerçekleştirmek nasıl beyin dokusunda da düzeylerini belirlemek için fare Dorsal striatum (dStr) ve nucleus accumbens (NAc) doku üzerinde deney gerçekleştirmek, ama yöntemi Ayrıca diğer DA innervated beyin bölgesi için uygun mu.
DAT DA geri presynaptic terminal içine Alım için gerekli böylece serbest bırakmak da zamansal ve mekansal etkinliği denetleme Düzeyleri ve DAT işlevselliğini striatum içinde bilerek büyük DA homeostazı değerlendirirken önemlidir. Burada, aynı anda yüzey düzeyleri ve işlev bir synaptosomal6 DA alımı tahlil kullanarak bilgi anlamak için izin veren bir protokol sağlar.
Geçerli yöntemleri standart immunoblotting iletişim kuralları ile kombine DAergic sistemi karakterize etmek için araştırmacı ile ilgili araçlar sağlar.

Geçerli DA Alım Protokolü (şekil 1) DAT işlevindeki fare üzerinden synaptosomes değerlendirmek için gereken tüm adımları içerir. Temsilcisi verilerimiz DA Alım yöntemi (Şekil 2) bir doygunluk eğrisi ayarsız veri (şekil 2B) ile gösteriyor ve veri (şekil 2A) ayarlanabilir. Doygunluk eğrisi alımını vahşi türü Fareler gösteriyor. Genellikle bir DA alımını bir doygunluk eğris...

Synaptosomal dopamin alımı ve yüksek performanslı sıvı Kromatografi analiz temsil deneysel araçları tarafından değerlendirilmesi dopamin taşıyıcı işlevi ve striatal dokusunda dopamin düzeyleri dopamin homeostazı farelerde araştırmak için anılan sıraya göre. Burada protokolleri dopamin doku içeriği ölçmek ve dopamin taşıyıcı işlevselliğini değerlendirmek için mevcut.

Dopaminerjik Homeostasis farelerde yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi ve Synaptosomal dopamin alımı kullanımı tarafından değerlendirilmesi

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Bu protokolde iki tekniği tanıtıyoruz. Birincisinin amacı, sinaptozomal preparatlardan dopamin alımını ölçerek dopamin taşıyıcı fonksiyonunu değerlendirmektir. İkincisi ise, HPLC analizi ile dokulardaki dopamin seviyelerini değerlendirmek içindir.Bu yöntemler, farelerde dopamin doku içeriğinin nasıl ölçüleceğini ve dopamin taşıyıcının işlevselliğinin nasıl değerlendirileceğini göstererek dopamin homeostazının önemli parametrelerini sağlamaktadır. Bu tekniklerin temel avantajı; kemogenetik manipülasyonlar, in-vivo ilaç tedavileri veya hayvanların davranışsal eğitimi gibi in-vivo manipülasyonlar sonrası uygulanabilmeleridir. HPLC prosedürünü Neuropsychiatry Laboratuvarı'ndan Doçent Pia Weikop gerçekleştirecektir.Bu prosedüre başlamak için, cildi keserek ve fazla dokuları temizleyerek kafatasını açığa çıkarın. Ardından, kafatasını sutura sagittalis boyunca en ön kısma kadar kesin. Makas uçlarını gözlere yerleştirin ve kalan kafatasını keserek çıkarın.Beyni hızla çıkarın ve buz soğukluğundaki PBS içine yerleştirin. Ardından, bir beyin matrisi kullanarak striatumun üç milimetrelik bir koronal kesitini ayırın. Bunu, bir ponksiyon ile daha hassas bir diseksiyonla takip edin.Ardından, dokuları tartmak için 1,5 milimetrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, aynı prosedürleri ikinci beyin için tekrarlayın. Her iki beyin için de ağırlık elde edildikten sonra, dokuları bir mililitre buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu içeren bir homojenizasyon camına aktarın.Bundan sonra, dokuyu motorlu bir havan eli kullanarak homojenize edin. Ardından, homojenatı 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve homojenizasyon camını 0,5 mL ek homojenizasyon tamponu ile durulayarak kalan homojenatı toplayın. Sonrasında, santrifüjleme yoluyla çekirdekleri ve hücre kalıntılarını çöktürün.Ardından, hücre membranlarını ve sitoplazmayı içeren süpernatantı yeni 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Sonrasında, sitoplazmayı içeren süpernatantı uzaklaştırın ve ham sinaptozomları içeren pellet'i, doku miligramı başına 40 µL homojenizasyon tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. Bu adımda, belirlenmiş 12 adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne 440 µL alım tamponu, ligand ve kokain; geri kalan 36 adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne ise 440 µL alım tamponu ve ligand ekleyin.Altı adet iki mililitrelik mikro santrifüj tüpünü 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 ve 0.31 şeklinde etiketleyin. Ardından, en düşük numaralı beş mikro santrifüj tüpüne 750 µL alım tamponu ve ligand ekleyin. Son olarak, 10 olarak etiketlenen tüpe 1.455,4 µL alım tamponu ve ligand, 14,6 µL işaretlenmemiş dopamin ve 30 µL trityumla işaretli dopamin ekleyin.Ardından, 10 etiketli tüpteki karışımdan 750 microliters miktarını 5 etiketli tüpe aktarın. İyice karıştırın ve bu tüpteki karışımdan 750 microliters miktarını 2,5 etiketli tüpe aktarın. Bu seyreltme işlemini kalan tüplerle tekrarlayın.Ardından, cam mikrofiber filtreleri 12 kuyucuklu filtre kovasına yerleştirdikten sonra dört mililitre alım tamponu ile ön durulamadan geçirin. Bunu takiben, ilk 24 adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne, her birinde 440 mikrolitre tampon bulunacak şekilde 10 mikrolitre sinaptozomal membran süspansiyonu ekleyin. Sinaptozomların tampon içine tamamen gömüldüğünden emin olmak için dikkatlice vorteksleyin ve kısa süreliğine merkezleya çevirin.Ardından, bunları 10 dakika boyunca 37 °C'de bekletin. 10 dakika sonra, ilk iki sütuna 10 µM ve 5 µM konsantrasyonunda 50 µL dopamin ekleyin ve çalkalayarak 5 dakika boyunca 37 °C'de bekletin. Beş dakika sonra, 1 mL buz gibi soğuk uptake buffer ekleyerek reaksiyonu durdurun; aynı işlemi 2,5 µM ve 1,25 µM ile, ardından 0,62 µM ve 0,31 µM ile tekrarlayın.Numuneleri önceden durulanmış mikro fiber filtrelere ekleyin ve beş kez, dörder mililitre buz gibi soğuk alınım tamponu ile yıkayın. İlk 12 numune filtrelere eklendikten sonra filtreleri sintilasyon tüplerine aktarın. Bu işlemi sonraki 12 numune ile tekrarlayın.Sintilasyon tüplerinin (49 ile 51 arası) tabanına bir mikrofiber filtre yerleştirip üzerine 25 µL maksimum 10 µM dopamin ekleyerek üç adet maksimum sayım tüpü hazırlayın. Ardından, 51 sintilasyon tüpünün tamamını bir saat boyunca çeker ocakta bekletin. Daha sonra, her bir sintilasyon tüpüne üç mililitre sintilasyon sıvısı ekleyin ve bir sarsıcıyla bir saat boyunca şiddetli bir şekilde çalkalayın.Trityumlu dopamini bir beta sayıcıda bir dakika boyunca saymak için programı açın ve uygun ayarları seçin. Protein tayini için, ayarlamalar yapmak ve örnekler arasındaki alımı uygun şekilde karşılaştırmak amacıyla sinaptozomların protein konsantrasyonlarını belirlemek için standart bir BCA protein assay kiti kullanın. Doku hazırlığı için, her örneğe 500 µL homojenizasyon çözeltisi ekleyin ve tüm örnekleri bir ultra homojenizatör kullanarak tam hızda yaklaşık 30 saniye boyunca homojenize edin.Homojenizasyon sırasında numuneleri buzlu suda tutun. Ardından, numuneleri 4 °C'de, 14.000 x G hızında 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Sonrasında, EC-HPLC metodolojisi ile analiz etmeden önce her numuneden yaklaşık 200 µL'yi 0,22 mikronluk cam filtreye aktarın. Dedektörü kurmak için, çıkışı 700 mV'ye ve dedektör fırını sıcaklığını 32 °C'ye ayarlayın.Viyalleri otomatik örnekleyiciye yerleştirin. Çevrimiçi kılavuzu kullanarak bir aralık programı oluşturun ve tablo ikiye göre zaman programını ekleyin. Programı açarak sistemi kurun.Ardından, kullanıcı kimliğini ve şifreyi girip tamam'a tıklayın. Sonra, programın cihazlara bağlanmasını bekleyin. Daha sonra, seri tablosuna gidin ve veri bilgilerini doldurun.Dosyayı kaydetmek için "dosya" (file) menüsüne gidin, ardından "toplu dosyayı farklı kaydet" (save batch file as) seçeneğine ve sonrasında "kaydet" (save) düğmesine tıklayın. Ardından, "toplu işlemi başlat" (start batch) düğmesine basarak ilk örneği enjekte edin. Son olarak, örnekler tamamlandığında kromatogramı takip etmek için "veri toplama" (data acquisition) sekmesine gidin.Ardından, LC çalışma sonrası analizine giderek dosya adını seçin. Sonra, görüntüle'ye tıklayın. Manuel entegrasyon çubuğunda, entegre edilecek tüm pikleri ekleyin; ardından, veri raporuna giderek okumayı yazdırın.Program dedektöre eklendikten sonra, hazırlanan standardı 5, 10 ve 15 mikrolitre enjekte ederek üç noktalı bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Bu şekildeki temsilci veriler, yabani tip farelerdeki sinaptozomal preparasyonlardan dopamin taşıyıcısı aracılığıyla gerçekleşen dopamin alımının doygunluk eğrisini göstermektedir. Siyah noktalar, dört fareye ait ayrı ayrı gösterilen değerlerdir.Yeşil eğri, grup başına dört ila altı fareden gelen veriler birleştirilerek verilerin normalde nasıl betimleneceğini göstermektedir. Burada, örneklerin gerçek protein konsantrasyonuna göre ayarlama yapılmadan önceki ham verilerin doygunluk grafiği yer almaktadır. Bu grafik, alım verilerinden arka planı çıkarmak için kullanılan kokain içeren örneklerin sayımlarını göstermektedir.Bu kontrol, alım verilerinin güvenilirliğini belirlemek için gereklidir. Bu histogram, dopamin taşıyıcısının alım kapasitesini göstermektedir ve dopamin taşıyıcısı için Km değerinin 0.1 ± 0.03 µM olduğunu göstermektedir; bu değer, dopamin taşıyıcısının Km değerlerini 0.6 ile 1.2 µM arasında gösteren döner disk voltammetri yöntemiyle iyi bir uyum sergilemektedir. Sinaptozomal optik prosedürü uygulanırken, sinaptozomlar hazırlanırken dokunun her zaman buz üzerinde tutulması önemlidir.Dopamin alımı sinaptozom deneyi sonrası, bozulmuş dopamin alımının dopamin taşıyıcısının değişmiş yüzey ekspresyonu ile açıklanıp açıklanamayacağını belirlemek amacıyla yüzey biyotinilasyon deneyi gibi ek prosedürler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, striatal doku preparasyonlarındaki dopamin taşıyıcısının işlevselliğine ve dopamin seviyelerine erişerek farelerde dopamin homeostazının nasıl araştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

assessment-dopaminergic-homeostasis-mice-use-high-performance-liquid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bir protokol unilateral 6-OHDA lezyonlar, farelerde medyal önbeyin demet gerçekleştirmek için tarif edilmektedir. Bu yöntem, striatal dopamin ve 90,63&gt;% 95 kaybı gösteren hayatta kalan hayvanların% 89 ile düşük mortalite oranı (% 13.3) ±% -4,02, lezyonun tarafa doğru ipsiversive dönme önyargı vardır.

Parkinson Hastalığının tek taraflı lezyonlanmıştır 6-OHDA Mouse Model Geliştirme

Amperometrik tekniği spontan dopamin oksitlenmeye tarafından üretilen oksidatif akımı algılayarak tek bir hücreden dopamin salınımını ölçer. Eşzamanlı gerilim kelepçe ve amperometri metodolojisi dopamin taşıyıcısı ve dopamin ters taşıma Bu faaliyetin düzenleyici rolünün genel "faaliyet" arasındaki mekanistik ilişki bulunmaktadır.

Eşzamanlı Gerilim-kelepçe ve Amperometri ile Dopamin Film Tek Hücre Ölçümü

Dopamin belirgin hücre gövdeleri ve dopamin nöron dendritler içeren Ortabeyin çekirdekler, düzenlenmiştir. Burada substantia nigra (SN) ve kemirgenlerde ventral tegmental alan (VTA) ve orta beyin çekirdeklerinde dopamin regülasyonu üzerine, böylece bir diseksiyon ve örnek işleme sonuçları maksimize etmek için yaklaşım, sonuç ve görüşlerini açıklar.

Substantia nigra ve ventral Tegmental Bölgesi Dopamin Yönetmelik Kapsamlı Profilleme

Bu video, fare beyinlerinden toplanan sinaptozomlarda dopamin alımının değerlendirmesini göstermektedir. Dopamin taşıyıcıları aracılığıyla dopamin alımı için sinaptozomları hazırlamak, bunları değişen konsantrasyonlarda radyoaktif işaretli dopamin ile tedavi etmek, sinaptozomları izole etmek ve dopamin alımını ölçmek için radyoaktiviteyi ölçmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

Radyo İşaretli Dopamin Kullanarak Fare Beyin Sinaptozomlarında Dopamin Alımının Ölçülmesi

Genel olarak Parkinson hastalığı, hareket bozuklukları, hassas ve güvenilir bir davranış testleri yeni potansiyel terapötikler test etmek için gereklidir. Burada, nigrostriatal sistemine zarar derecelerine ve klinik öncesi çalışmalar için yararlı duyarlı olan fareler için duyu testler yönetilebilir bir pil açıklanmaktadır.

Parkinson Hastalığı Fare Modeller Duyusal Motor Fonksiyon Değerlendirilmesi

Burada dopaminerjik (DA) nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kurulmuştur iki deneyleri...

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Lipoksijenaz (LOX) izozimler nöroinflamatuarasyonu ve nörodejenerasyonu artırabilecek veya azaltabilecek ürünler üretebilir. Gen-çevre etkileşimi çalışması LOX izozime özgü etkileri tanımlayabilir. İki LOX izozim eksikliği olan transgenik çizgilerde nigrostriatal hasarın 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidromiridin (MPTP) modelinin kullanılması, LOX izozimlerinin dopaminerjik bütünlük ve inflamasyona katkısının karşılaştırılmasını sağlar.

Parkinson Hastalığında Maskeyi Düşürme Duyarlılık Mekanizmalarına Gen-Çevre Etkileşim Modelleri

Bu kağıt dopamin ve Glutamat yüksek zamansal çözünürlük ile serbest bırakılması sırasında doğal tatmin edici davranışlara ölçmek için karbon fiber elektrotlar ve enzimatik Biyoalgılayıcı teknoloji kullanarak sabit potansiyel amperometric kayıtları kullanımı detayları kadın hamster.

Doğal olarak kadın Suriye hamster davranışları ödüllendirme sırasında hücre dışı nörotransmitter ölçüm Vivo içinde değişimler

Biz aynı anda üç monoamin nörotransmitter belirlenmesi ve iki onların metabolitleri bebekler idrar için yüksek basınçlı sıvı Kromatografi (HPLC) elektrokimyasal algılama (ECD) ile birleştiğinde uygun bir katı fazlı çıkarma mevcut. Biz Ayrıca metaboliti MHPG beyin hasarı erken tanısı için potansiyel bir biyomarker olarak bebekler için tanımlar.

Ayıklama ve çözümleme katekoiamin nörotransmitter ve onların metabolitleri yüksek basınçlı sıvı Kromatografi ile uygun bir yöntem

Dopamin D1-Alfa reseptör nucleus accumbens tanımlaması D1 reseptör disfonksiyonu bir merkezi sinir sistemi hastalığı sırasında açıklığa kavuşturulması için önemlidir. Biz bir belirli beyin bölgesinde tek RNA molekülleri görselleştirmek için bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil yapılır.

Dopamin D1-Alfa reseptör kemirgen Nucleus Accumbens bir yenilikçi RNA Situ içinde hafiye teknoloji tarafından içinde tanımlaması

Bu yöntem, akut beyin dilimleri kullanılarak endojen monoamin salınımının tespiti için basit bir teknik sunar. Kurulum, monoamin salınımı için bir doku tutucu içeren 48 kuyulu bir plaka kullanır. Serbest bırakılan monoamin, elektrokimyasal algılama ile birlikte HPLC tarafından analiz edilir. Ek olarak, bu teknik ilaç keşfi için bir tarama yöntemi sağlar.

Akut Beyin Dilimlerinde Endojen Monoamin Salınımının Ölçümü için Plaka Bazlı Bir Tahlil

Öğrenin farelerde dopamin homeostazını değerlendirmek için sinaptosomal dopamin alımı ve yüksek performanslı sıvı kromatografi analizi yöntemlerini. Bu teknikler dopamin taşıyıcı fonksiyonunu ve doku içeriğini ölçmenizi sağlar.

Dopaminerjik Homeostasis farelerde yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi ve Synaptosomal dopamin alımı kullanımı tarafından değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Dopaminerjik Homeostasis farelerde yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi ve Synaptosomal dopamin alımı kullanımı tarafından değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet