Anti-Neu5Gc IgG'yi İnsan Sera'sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Sialoglikan mikroarray testinin genel amacı, insan serumlarında Anti-Neu5Gc IgG'yi çeşitli sialoglikan koleksiyonuna karşı yüksek verimli bir şekilde değerlendirmektir. Bu yöntem, Anti-Neu5Gc antikorlarının kanser, kalp hastalıkları ve ksenotransplantasyon dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarıyla nasıl ilişkili olduğu gibi glikoimmünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sayısız sialoglikan antijenine karşı Anti-Neu5Gc antikorlarının yüksek verimli profillenmesine izin vermesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Sharon Yehuda olacak. Dizi imalatının ve düzeninin dikkatli ve ayrıntılı bir şekilde planlanması, başarıyı sağlamak için önemlidir. Bu işlem metin protokolünde ve ek bilgilerde detaylandırılmıştır.

Mikrosantrifüj tüplerinde toplam 100 mikrolitre glikan baskı tamponu hacminde her glikanı 100 mikromolar ile seyreltin. Daha sonra, işaretleyici tampon ile milimetre başına bir miligrama kadar floresan boya içeren birincil amin hazırlayın. Ardından, bir mililitre toplam hacimde mililitre başına bir mikrograma seyreltin.

Metin protokolünde açıklandığı gibi insan IgG standart eğrisi seyreltmelerini hazırlayın. 384 kuyulu plakayı buzun üzerine yerleştirin. Elektronik bir çoklu pipet kullanarak, metin protokolünde bulunan plaka düzenine göre her bir glikan, işaretleyici ve stardard eğrisi IgG'den yedi mikrolitre alikot.

Plakayı parafilm ile örtün ve 250 kez g ve 12 santigrat derecede iki dakika döndürün. Baskı, %60 ila 70 nem oranına sahip tozsuz bir alanda yapılmalıdır. Burada tüm adımlar, koruma için uygun eldiven ve giysilerle temiz bir odada gerçekleştirilir. Nano yazıcı makinesini ve nemlendiriciyi açın.

Baskı makinesini metin protokolünde açıklandığı gibi programladıktan sonra, aliquoted samples ile 384 kuyulu plakayı arrayer güvertesindeki konumuna yerleştirin ve parafilm kapağını çıkarın. Bu noktada, yazdırmaya başlayın. Slaytları alkole dayanıklı solvente dayanıklı bir işaretleme kalemiyle numaralandırın ve karanlıkta vakumla kapatılmış bir kutuda saklayın.

Dizileri işlemek için, önce vakumla kapatılmış kutudan bir sürgü çıkarın ve fazla sıvıyı buharlaştırmak için dizi yukarı bakacak şekilde beş dakika boyunca kimyasal bir davlumbaza yerleştirin. Ardından, slaytı deiyonize suyla doldurulmuş bir boyama tüpüne yerleştirerek nemlendirin. Tüpü folyo ile örtün ve oda sıcaklığında yavaş ve yumuşak bir şekilde çalkalayarak beş dakika inkübe edin.

Slayt üzerindeki reaktif epoksi gruplarını bloke etmek için, slaytı önceden ısıtılmış etanolamin bloke etme çözeltisi ile doldurulmuş 50 mililitrelik boyama tüpüne daldırın. Tüpü folyo ile örtün ve oda sıcaklığında yavaş ve nazikçe çalkalayarak 30 dakika inkübe edin. Etanolamin bloke edici çözeltiyi uygun biyolojik tehlike çöp kutusuna atın.

Ardından, slaytı 50 santigrat derece deiyonize su ile doldurulmuş yeni, temiz bir boyama tüpüne yerleştirin. Tüpü folyo ile örtün ve oda sıcaklığında yavaş ve hafifçe çalkalayarak 10 dakika inkübe edin. Suyu atın ve slaytları bir cam leke tutucusuna aktarın.

Cihazı sallanan bir plaka tutucuya yerleştirin ve sürgüyü kurulayın. Ardından, slaytı 16 oyuklu bir bölücüye yerleştirin. Kuyuları önceden ıslattıktan sonra, 200 mikrolitre PBST'yi slayt kuyucuklarına ayırmak için çoklu pipet kullanın.

Ardından, kapalı, nemli bir odaya koyun ve beş dakika çalkalayın. Temiz bir kağıt havluya hafifçe vurarak ve hafifçe vurarak PBST'yi çıkarın. Daha sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre PBS-Ovalbümin bloke edici tampon ekleyin.

Slaytları nemli bir odaya yerleştirin ve hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi PBS-OVA engelleme tamponunda seyreltilmiş birincil algılamayı hazırlayın. PBS-OVA bloke edici tamponu slayttan kaydırın ve oyuk başına 200 mikrolitre birincil antikor ekleyin.

Slaytları nemli bir odada iki saat inkübe edin. Ardından, birincil algılamayı sürgüden kaydırın ve PBST ile üç kez yıkayın. PBST ile son bir kez yıkamadan önce slaydı nemli bir odada beş dakika PBST'de inkübe edin.

Ardından, PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, ikincil antikoru metin protokolünde açıklandığı gibi PBS'de hazırlayın. PBS'yi slayttan kaydırın ve 200 mikrolitre ikincil antikor ekleyin.

İkincil antikoru slayttan çıkarın ve daha önce olduğu gibi PBST ile dört kez yıkayın. Çerçeveyi dikkatlice çıkarın, ardından slaytları PBS ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir slayt boyama tüpüne yerleştirin ve beş dakika çalkalayın. Ardından, iki slayt boyama banyosunu deiyonize su ile doldurun.

Slaytı sürgü tutucuya yerleştirin ve sürgüyü ilk banyoya daldırın. Slaytı hızla on kez daldırın. Ardından, slaytı ikinci banyoya aktarın ve on kez daha daldırın.

Daldırdıktan sonra, slaytı çalkalayarak oda sıcaklığında on dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından suyu atın ve slaytı bir cam boyama tutucusuna aktarın. Cam boyama tutucusunu sallanan bir plaka tutucuya yerleştirin ve sürgüyü kurulayın.

Tarayıcı kapağını açın ve sürgüyü dizi aşağı bakacak şekilde içeriye yerleştirin. Bu noktada, taramayı başlatın. Taranan slaytları TIFF dosyası olarak kaydedin.

Bir slaytı analize hazırlamak için Dizi Listesini Yükle"yi seçin ve slayttaki her bloktaki dizileri eşleyen uygun GAL dosyasını yükleyin. Her blokta bir tane olmak üzere 16 farklı birincil algılama parçası ile slaytlar geliştirilmiştir. Lektin SNA bitkisi a2-6 bağlı sialik asidi bağlar.

Lektin MALII bitkisi ise a2-3 bağlı sialik asidi bağlar. Poliklonal Anti-Neu5Gc IgY, Neu5Gc içeren sialoglikanları bağlar ancak Neu5Ac içeren sialoglikanları bağlamaz. Anti-Neu5Gc IgG'nin profilini çıkarmak için, sağlıklı insan donörlerinden alınan 12 serum, basılı sialoglikan mikrodizisi üzerinde analiz edildi ve mikrolitre başına nanogramlara normalize edilmiş floresan etiketli anti-insan IgG kullanılarak geliştirildi.

Test edilen tüm insan serumları, eşleşen Neu5Ac içeren sialoglikan çiftlerinin neredeyse hiç tanınmadığı çeşitli seviyelerde Anti-Neu5Gc IgG içeriyordu. Ayrıca, Anti-Neu5Gc IgG tanıma paternleri, bu 12 farklı serum arasında hem yoğunluk hem de çeşitlilik açısından oldukça çeşitlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bir glikan mikroarray sistemi kullanarak çeşitli insan örneklerinde Anti-Neu5Gc antikorlarının yüksek verimli bir şekilde nasıl profilleneceğini iyi anlamış olmalısınız.