Name: Anti-Neu5Gc IgGyi İnsan Serasında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Keşfedin sialoglikan mikroarray testi ile insan serumlarında Anti-Neu5Gc IgG profilleme yöntemini. Bu yüksek verimli teknik, kanser ve kronik inflamasyon gibi hastalıklarda glikoimmünoloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen İsrail Kanser Araştırma Fonu&#39;ndan Ar-Ge Kariyer Geliştirme Ödülü, İsrail Ulusal Nanoteknoloji Girişimi ve Helmsley Bağışlı Güven&#39;den Kişiselleştirilmiş Teröristler için Nano Dedektifler (VP-K) için bir Odaklı Teknoloji Alanından hibe tarafından desteklendi ve Ulusal Sağlık yardımı enstitüleri R01GM076360 (XC&#39;ye).

<ol><li>Padler-Karavani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aiming+at+the+sweet+side+of+cancer%3A+Aberrant+glycosylation+as+possible+target+for+personalized-medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine.</a> Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).</li>
<li>Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+in+immune+recognition+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Glycans in immune recognition and response.</a> Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).</li>
<li>Häuselmann, I., Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+tumor-cell+glycosylation+promotes+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis.</a> Front Oncol. 4, (2014).</li>
<li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li>
<li>Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+uptake+and+incorporation+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+into+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells.</a> J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+specificity%2C+abundance%2C+and+composition+of+anti-Neu5Gc+antibodies+in+normal+humans%3A+potential+implications+for+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease.</a> Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+xeno-autoantibodies+against+a+non-human+sialic+acid+serve+as+novel+serum+biomarkers+and+immunotherapeutics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer.</a> Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).</li>
<li>Cao, H., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+consideration+on+sialic+acid+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">General consideration on sialic acid chemistry.</a> Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).</li>
<li>Deng, L., Chen, X., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+sialic+Acid+diversity+and+biology+using+sialoglycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays.</a> Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).</li>
<li>Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoside+Arrays%3A+New+Synthetic+Strategies+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Curr+Chem%22%5BJournal%5D)">Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications.</a> Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).</li>
<li>Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+of+fluorescently-tagged+natural+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans.</a> Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).</li>
<li>Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays%3A+powerful+tools+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery.</a> Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).</li>
<li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+analysis+of+glycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation and analysis of glycan microarrays.</a> Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).</li>
<li>Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/cs/c2cs35401b#!divAbstract">Carbohydrate microarrays.</a> Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).</li>
<li>Struwe, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+sample+preparation+guidelines+for+reliable+reporting+of+glycomics+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets.</a> Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+improving+the+standards+for+reporting+glycan+microarray-based+data%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data.</a> Glycobiology. , (2016).</li>
<li>Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mono-O-acetylated+N-acetylneuraminic+acids+in+human+and+rat+sera+by+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography.</a> Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-comparison+of+protein+recognition+of+sialic+acid+diversity+on+two+novel+sialoglycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays.</a> J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).</li>
<li>Padler-Karavani, V., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+impact+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+on+transplant+rejection+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk.</a> Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).</li>
<li>Samraj, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+meat-derived+glycan+promotes+inflammation+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).</li>
<li>Pearce, O. M., Läubli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acids+in+cancer+biology+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sialic acids in cancer biology and immunity.</a> Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).</li>
<li>Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+risk+of+diseases+associated+with+red+meat+intake%3A+Analysis+of+current+theories+and+proposed+role+for+metabolic+incorporation+of+a+non-human+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid.</a> Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).</li>
<li>Pearce, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+hormesis+of+cancer+growth+mediated+by+narrow+ranges+of+tumor-directed+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).</li>
<li>Pham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+novel+human-specific+xeno-auto-antibody+response+against+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium.</a> Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).</li>
<li>Reuven, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immunogenic+Neu5Gc+in+bioprosthetic+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves.</a> Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).</li>
<li>Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+presence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+recombinant+therapeutic+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Başarılı bir glikan mikroarray üretimi dikkatli planlama gerektirir ve protokolde birkaç önemli adımı içerir. Bunlar arasında şunlar bulunur: (1) sonraki tüm parametreleri tanımlayan blok ve plaka düzenlerini planlama ( ör. Mesafeler, aralık, numune miktarı ve baskı); (2) piksellerin temizlenmesi ve nokta homojenliğini kontrol etmek için kritik olan pin bütünlüğünün sağlanması; (3) baskı esnasında yüksek nem oranının korunması, spot homojenliğinden ödün verebilecek uzun basılmalar sırasında numunenin buharlaşma...

Sias, hücre yüzeyi glikoproteinleri üzerindeki glıkan zincirlerini ve omurgalılardaki glikolipitleri kapsayan asidik şekerlerdir. Sia kanser hücrelerinde 1 değiştirilebilir ve ilerlemesi ve / veya metastaz 2, 3 ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Memelilerdeki başlıca Sia formlarından ikisi Neu5Ac ve onun hidroksillenmiş formu Neu5Gc 2&#39;dir . İnsanlar CMAH enzimini kodlayan genin belirli bir inaktivasyonu nedeniyle Neu5Gc&#39;yi sentezleyemez. Bu insan dışı Sia metabolik diyet Neu5Gc zengin besinler (örneğin kırmızı et) den &quot;kendini,&quot; menşeli 4, 5 gibi insan hücrelerine sahiptir. Neu5Gc, insan epitelinin ve endotelin hücre yüzeylerinde düşük seviyelerde bulunur, ancak özellikle karsinomalarda birikir. Neu5Gc, insan humoral bağışıklık sistemi 2 , 6 tarafından yabancı olarak tanınır.Neu5Gc-glıkanların antijenik karmaşıklığı, insanlardaki anti-Neu5Gc antikor cevabının karmaşıklığı tarafından yansıtılan, Neu5Gc modifikasyonu, bağlanma, altta yatan glıkanlar ve iskeleler ve bunların yoğunluğu da dahil olmak üzere çoklu seviyelerde ortaya çıkabilir 6 . Bu antikorlardan bazıları karsinom biyolojik belirteçleri ve potansiyel immünoterapötikler 7 olarak kullanılır . Farklı sialoglikanlar 8&#39;in kemoenzimatik sentezinin ortaya çıkışı, bu tür antikorların daha derinlemesine analizine yol açtı, bu da glıkan mikroarray teknolojisi 9 , 10 kullanılarak kolaylaştırıldı. Bu nedenle, doğal ve sentetik karbonhidratların büyük kütüphanelerinin kolaylaştırılmış hazırlanması ve manipülasyonu ile, glıkan mikrodizileri karbonhidratların sayısız biyomoleküllerle olan etkileşimlerini araştırmak için güçlü, yüksek verimli bir teknoloji haline geldi 10 , 11 , </sup12 , 13 . Bir dizi formatında, az miktarda malzeme kullanılır ve biyolojik olarak ilgili glıkanların bu çok-değerli gösterimi, tek bir deneyde binlerce bağlanma etkileşiminin araştırılmasını sağlar. Önemli olan, bu teknoloji aynı zamanda biyomarkır bulguları ve çeşitli numunelerde 7 , 12 bağışıklık yanıtlarını izlemek için de uygulanabilir. Başarılı glıkan mikrodizi imalatı, üç önemli hususu göz önüne alır: yazıcı robot tipi, glikan konjugasyon kimyası ve tespit optiği. Baskı aleti konusuna gelince, iki teknik mevcuttur: temaslı ve temassız yazıcılar. Temas baskıda, 1-48 çelik pim, glikan solüsyonu içeren çok iyi kaynak plakasına daldırılır ve cam sürgü yüzeyine doğrudan temas ederek işlevselleştirilmiş cam slaytlar üzerinde lekelenir. Çözelti miktarı deSlayta gömülmüş olan, slayt yüzeyinde kalıcı sürenin bir fonksiyonudur. Genellikle, numuneler önce kaygan yüzey üzerine basılmadan önce bir cam blok üzerine (homojen noktalere ulaşmak için) önceden lekelenir. Temassız yazıcılarda ( örn., Piezo elektronik yazıcı), glikanlar, kontrollü elektrik sinyalleri kullanılarak bir cam kılcalından basılır. Kontak baskıya kıyasla daha hassas baskı elde etmek için elektrik sinyali hassas bir şekilde kalibre edilebilir. Noktaların boyutu ve morfolojisi de nispeten daha homojen. Ek bir avantaj, numunenin baskıdan sonra kaynak plakasına geri döndürülmesidir. Bununla birlikte, piezo elektronik yazıcıların en büyük dezavantajı baskı ucu sınırlaması (4 veya 8) olup, kayma kararlılığı, sıcaklık, nem ve numunenin buharlaşmasına özel dikkat gerektiren çok uzun bir yazdırma süresi sağlar. Temassız inkjet yazıcı 14 daha büyük numune hacimleri gerektirir. <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; Yazdırma yöntemleri için mevcut sınırlı seçeneklerin aksine, glikan konjugasyon kimyası, daha pek çok seçeneğe sahip daha karmaşık bir sorundur. Seçilen immobilizasyon kimyası, hem glikanlardaki aktif grupları hem de slayt yüzeyinin reaktivitesini açıklamak zorundadır. Belirli bir mikrodizinin yüzeyinde, sentetik olarak sentezlenen veya doğal olarak izole edilen glikanlar, hepsi aynı reaktif grubu gerektirir. Buna ek olarak, glikanlar saf ve homojen olmalı. Öte yandan, immobilizasyon yüzeyi ve kimyası tekrarlanabilirlik ve güvenilir bağlanma yoğunluğu sağlamalıdır. Çoklu immobilizasyon yöntemleri, kovalent veya kovalent olmayan (fiziksel absorpsiyon) ataşman 10 , 11 , 12 , 13 ile geliştirilmiştir . Baskın glikan mikroarray teknolojisi ile ilgili son derece detaylı bilgi almak içinD araştırmacı, bu mükemmel değerlendirmeleri 13 , 15 bakın . Önemlisi, bir Glikomik Deney (MIRAGE) inisiyatifi için gereken son Minimum Bilgi, numune hazırlama 16 için ve bu büyüyen alanda standartları iyileştirmek için glıkan mikrodizi analizleri 17&#39;den veri raporlama talimatlarını açıklar. Burada, 16 yuvalı bir formatta belirli bir kontaklı nano-yazıcı kullanarak sialoglikan mikrodizilerinin imalatı için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Glikanlardan her biri, epoksi ile aktive edilen cam slaytlarına kovalent bağlantısına aracılık eden bir birincil amin içerirler. Ayrıca çeşitli insan sera örneklerini, antikorları ve Sia bağlayıcı bitki lektinlerini kullanarak bir slaytın gelişimini ve analizini açıklıyoruz. Siyaloglikan mikroarray tahlilleri, dizi imalatı, işlenmesi, geliştirilmesi ve analizi içeren birkaç ana aşamayı içerir. Dizi üretiminde armanın planlanması gerekirRay düzeni, glikanlar ve kaynak plakası hazırlanması, nano yazıcının programlanması ve slaytların basılması. Daha sonra, slaytlar işlenir, geliştirilir ve analiz edilir ( Şekil 1 ).

<table><tbody><tr><td>Sialoglikan içeren birincil amin</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, ABD (http://www.glycohub.com/services)</td><td>Bileşik talepleri için info@glycohubusa.com ile iletişime geçin</td><td>Basılı glikanlar</td></tr><tr><td>Monosodyum fosfat monohidrat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Baskı tamponu bileşeni</td></tr><tr><td>Disodyum fosfat heptahidrat</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>Baskı tamponu bileşeni</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507 / 500D</td><td>Baskı tamponu / inkübasyon / yıkama tamponu</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Slayt engelleme reaktifi</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G-7893</td><td>Baskı tamponu bileşeni</td></tr><tr><td>Etanolamin</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>Slayt engelleme reaktifi</td></tr><tr><td>Ovalbumin (Sınıf V)</td> <td>Sigma</td><td>A5503</td><td>Slayt Engelleme proteini</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Slayt yıkama deterjanı</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hidrazid</td><td>Thermo-Fisher Bilimsel</td><td>A20501MP</td><td>Dizi ChromPure İnsan IgG üzerinde işaretleyici</td></tr><tr><td>, tüm molekül</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>Baskı bileşeni</td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş- SNA</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>B-1305</td><td>Bitki Lektin &ndash; bağlayıcı Sia-alfa2&ndash; 6 bağlantılı</td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş-MALII</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>B-1265</td><td>Bitki Lektin &ndash; bağlayıcı Sia-alpha2&ndash; 3 bağlantılı</td></tr><tr><td>Tavuk-anti Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>Birincil tespit</td></tr><tr><td>Cy3-Streptavidin</td><td>Jackson İmmünoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>Biyotin bağlayıcı</td></tr><tr><td>Cy3-anti İnsan IgG Jackson</td><td>İmmünoresearch</td><td>109-165-088</td><td>İnsan IgG'ye karşı ikincil tespit</td></tr><tr><td>Cy3-anti Tavuk IgY</td><td>Jackson İmmünoaraştırma</td><td>703-165-155</td><td>İkincil Tavuk IgY'ye karşı tespit</td></tr><tr><td>İnsan serum örnekleri</td><td>İsrail Kan Bankası</td><td></td><td>Birincil algılama</td></tr><tr><td>Sıkıştırılmış Azot (Derece 5)</td><td></td><td></td><td>Genel toz alma/kurutma aleti</td></tr><tr><td>Epoksi kaplı slaytlar</td><td>Corning</td><td>40044</td><td>Slaytlar</td></tr><tr><td>Epoksi kaplı slaytlar</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>Slayt. Bu tip slaytlarda yüzey daha hidrofobiktir (Karot slaytlarına kıyasla), bu nedenle glikanların Baskı Tamponunun 100 & mikro elde etmek için% 0.005 Tween-20 ile desteklenmesi gerekir; m boyutunda lekeler.</td></tr><tr><td>384 kuyulu mikrotitre plakası</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>Baskı plakası</td></tr><tr><td>VWR laboratuvar işaretleyicisi</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>Slayt etiketleme</td></tr><tr><td>Boyama Tüpü</td><td>ArrayIt</td><td>MST</td><td>Slayt geliştirme aracı</td></tr><tr><td>Boyama banyosu</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>Slayt geliştirme aracı</td></tr><tr><td>Slaytlar cam tutucular</td><td>VWR</td><td>631-9321</td><td>Slayt geliştirme aracı</td></tr><tr><td>GenePix Tarayıcı</td><td>Moleküler cihazlar</td><td>4000B</td><td>Slayt tarayıcı</td></tr><tr><td>LM-60 NanoPrinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td>Dizi yazıcı</td></tr><tr><td>Pinleri</td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>Baskı pimleri</td></tr><tr><td>ProPlate Modülü</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>Slayt geliştirme modülü</td></tr><tr><td>Damıtılmış su</td><td>Arrayer ve nemlendirici için</td> gerekli <td>Bio-Lab</td><td>2321020500</td></tr><tr><td>Elektronik Çoklu Pippete, 8 Kanal, ses aralığı 2-125 &mu; L</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td> <td>MA-2131 Impact2 Ekolayzer 384 384</td><td>oyuklu plakaya numune ayırma için çoklu pippete</td></tr></tbody></table>

anti-neu5gc igg&#39;yi İnsan sera&#39;sında sialoglikan mikroarray testi ile görüntüleme

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay 

Hücreler, kanserde yaygın şekilde değişen ve sialik asit (Sia) ifadesinde değişiklikler içeren karbonhidrat zincirleri (glikanlar) paketi ile kaplıdır. Bunlar, 9-karbon omurgasına sahip olan ve hücre yüzeylerinde omurgalı glıkanları kaplayan asidik şekerlerdir. Memelilerin başlıca Sia formlarından ikisi N- asetilnöraminik asit (Neu5Ac) ve onun hidroksillenmiş formu, N- glikolilneuraminik asit (Neu5Gc) &#39;dir. İnsanlar, sitidin 5&#39;monofosfat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hidroksilaz (CMAH) kodlayan genin inaktivasyonu nedeniyle endojen Neu5Gc üretemez. Yabancı Neu5Gc, kırmızı et ve sütten besin tüketimi yoluyla insan hücreleri tarafından edinilir ve ardından çoğunlukla karsinomalar üzerine biriken hücre yüzeyindeki çeşitli glıkanlarda görülür. Sonuç olarak, insanlar kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı hastalıklarda çeşitli rol oynayan ve potansiyel tanı ve terapötik ta olan dolaşımdaki anti-Neu5Gc antikorlarına sahiptirler.rgets. Burada, bu tür anti-Neu5Gc antikorlarını insan serumunda değerlendirmek için yüksek verimli bir sialoglikan mikroarray deneyi tarif ederiz. Neu5Gc içeren glikanlar ve bunların her biri bir çekirdek primer amin içeren eşleştirilmiş kontrol çiftleri (Neu5Ac içeren glikanlar), epoksi kaplı cam slaytlara kovalent olarak bağlanır. Baskı başına 896 diziye kadar çıkabilen özel bir nano-yazıcı kullanarak 16 slayt formatında 56 slaytın baskısını örnekledik. Her slayt, anti-Neu5Gc antikor özgüllüğünün, yoğunluğunun ve çeşitliliğinin değerlendirilmesi için 16 farklı insan serum örneğini taramak için kullanılabilir. Protokol, bu sağlam aracın karmaşıklığını tanımlar ve bir dizi formatında farklı klinik örneklerde Neu5Gc diyet karbonhidrat antijenine cevabı araştırmayı amaçlayanların temel bir kılavuz sağlar.

Dizi Baskı, Geliştirme ve Analiz: Birden fazla glikan numunesi ve insan IgG STD eğrileri ile 16 farklı bloktaki bir sialoglikan mikroarrayi basmak, tüm numunelerin, slayt başına ve tüm slaytlara aynı baskıda 16 blokta mümkün olduğunca eşit şekilde basılmasını sağlamak için kapsamlı kalibrasyona ihtiyaç duyar. Bu nedenle, spesifik baskı parametreleri belirlenmeden önce, her bir numune türü için tampon kompozisyonu, slayt tipi ve i...

İnsan serasındaki anti-Neu5Gc antikorlarını değerlendirmek için bir siyaloglikan mikroarray testi kullanılabilir, böylece kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı insan hastalıkları için yüksek verimli bir tanı testi haline getirilir.

Anti-Neu5Gc IgG&#39;yi İnsan Sera&#39;sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

Sialoglikan mikroarray testinin genel amacı, insan serumlarında Anti-Neu5Gc IgG'yi çeşitli sialoglikan koleksiyonuna karşı yüksek verimli bir şekilde değerlendirmektir. Bu yöntem, Anti-Neu5Gc antikorlarının kanser, kalp hastalıkları ve ksenotransplantasyon dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarıyla nasıl ilişkili olduğu gibi glikoimmünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sayısız sialoglikan antijenine karşı Anti-Neu5Gc antikorlarının yüksek verimli profillenmesine izin vermesidir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Sharon Yehuda olacak. Dizi imalatının ve düzeninin dikkatli ve ayrıntılı bir şekilde planlanması, başarıyı sağlamak için önemlidir. Bu işlem metin protokolünde ve ek bilgilerde detaylandırılmıştır.Mikrosantrifüj tüplerinde toplam 100 mikrolitre glikan baskı tamponu hacminde her glikanı 100 mikromolar ile seyreltin. Daha sonra, işaretleyici tampon ile milimetre başına bir miligrama kadar floresan boya içeren birincil amin hazırlayın. Ardından, bir mililitre toplam hacimde mililitre başına bir mikrograma seyreltin.Metin protokolünde açıklandığı gibi insan IgG standart eğrisi seyreltmelerini hazırlayın. 384 kuyulu plakayı buzun üzerine yerleştirin. Elektronik bir çoklu pipet kullanarak, metin protokolünde bulunan plaka düzenine göre her bir glikan, işaretleyici ve stardard eğrisi IgG'den yedi mikrolitre alikot.Plakayı parafilm ile örtün ve 250 kez g ve 12 santigrat derecede iki dakika döndürün. Baskı, %60 ila 70 nem oranına sahip tozsuz bir alanda yapılmalıdır. Burada tüm adımlar, koruma için uygun eldiven ve giysilerle temiz bir odada gerçekleştirilir. Nano yazıcı makinesini ve nemlendiriciyi açın.Baskı makinesini metin protokolünde açıklandığı gibi programladıktan sonra, aliquoted samples ile 384 kuyulu plakayı arrayer güvertesindeki konumuna yerleştirin ve parafilm kapağını çıkarın. Bu noktada, yazdırmaya başlayın. Slaytları alkole dayanıklı solvente dayanıklı bir işaretleme kalemiyle numaralandırın ve karanlıkta vakumla kapatılmış bir kutuda saklayın.Dizileri işlemek için, önce vakumla kapatılmış kutudan bir sürgü çıkarın ve fazla sıvıyı buharlaştırmak için dizi yukarı bakacak şekilde beş dakika boyunca kimyasal bir davlumbaza yerleştirin. Ardından, slaytı deiyonize suyla doldurulmuş bir boyama tüpüne yerleştirerek nemlendirin. Tüpü folyo ile örtün ve oda sıcaklığında yavaş ve yumuşak bir şekilde çalkalayarak beş dakika inkübe edin.Slayt üzerindeki reaktif epoksi gruplarını bloke etmek için, slaytı önceden ısıtılmış etanolamin bloke etme çözeltisi ile doldurulmuş 50 mililitrelik boyama tüpüne daldırın. Tüpü folyo ile örtün ve oda sıcaklığında yavaş ve nazikçe çalkalayarak 30 dakika inkübe edin. Etanolamin bloke edici çözeltiyi uygun biyolojik tehlike çöp kutusuna atın.Ardından, slaytı 50 santigrat derece deiyonize su ile doldurulmuş yeni, temiz bir boyama tüpüne yerleştirin. Tüpü folyo ile örtün ve oda sıcaklığında yavaş ve hafifçe çalkalayarak 10 dakika inkübe edin. Suyu atın ve slaytları bir cam leke tutucusuna aktarın.Cihazı sallanan bir plaka tutucuya yerleştirin ve sürgüyü kurulayın. Ardından, slaytı 16 oyuklu bir bölücüye yerleştirin. Kuyuları önceden ıslattıktan sonra, 200 mikrolitre PBST'yi slayt kuyucuklarına ayırmak için çoklu pipet kullanın.Ardından, kapalı, nemli bir odaya koyun ve beş dakika çalkalayın. Temiz bir kağıt havluya hafifçe vurarak ve hafifçe vurarak PBST'yi çıkarın. Daha sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre PBS-Ovalbümin bloke edici tampon ekleyin.Slaytları nemli bir odaya yerleştirin ve hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi PBS-OVA engelleme tamponunda seyreltilmiş birincil algılamayı hazırlayın. PBS-OVA bloke edici tamponu slayttan kaydırın ve oyuk başına 200 mikrolitre birincil antikor ekleyin.Slaytları nemli bir odada iki saat inkübe edin. Ardından, birincil algılamayı sürgüden kaydırın ve PBST ile üç kez yıkayın. PBST ile son bir kez yıkamadan önce slaydı nemli bir odada beş dakika PBST'de inkübe edin.Ardından, PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, ikincil antikoru metin protokolünde açıklandığı gibi PBS'de hazırlayın. PBS'yi slayttan kaydırın ve 200 mikrolitre ikincil antikor ekleyin.İkincil antikoru slayttan çıkarın ve daha önce olduğu gibi PBST ile dört kez yıkayın. Çerçeveyi dikkatlice çıkarın, ardından slaytları PBS ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir slayt boyama tüpüne yerleştirin ve beş dakika çalkalayın. Ardından, iki slayt boyama banyosunu deiyonize su ile doldurun.Slaytı sürgü tutucuya yerleştirin ve sürgüyü ilk banyoya daldırın. Slaytı hızla on kez daldırın. Ardından, slaytı ikinci banyoya aktarın ve on kez daha daldırın.Daldırdıktan sonra, slaytı çalkalayarak oda sıcaklığında on dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından suyu atın ve slaytı bir cam boyama tutucusuna aktarın. Cam boyama tutucusunu sallanan bir plaka tutucuya yerleştirin ve sürgüyü kurulayın.Tarayıcı kapağını açın ve sürgüyü dizi aşağı bakacak şekilde içeriye yerleştirin. Bu noktada, taramayı başlatın. Taranan slaytları TIFF dosyası olarak kaydedin.Bir slaytı analize hazırlamak için Dizi Listesini Yükle"yi seçin ve slayttaki her bloktaki dizileri eşleyen uygun GAL dosyasını yükleyin. Her blokta bir tane olmak üzere 16 farklı birincil algılama parçası ile slaytlar geliştirilmiştir. Lektin SNA bitkisi a2-6 bağlı sialik asidi bağlar.Lektin MALII bitkisi ise a2-3 bağlı sialik asidi bağlar. Poliklonal Anti-Neu5Gc IgY, Neu5Gc içeren sialoglikanları bağlar ancak Neu5Ac içeren sialoglikanları bağlamaz. Anti-Neu5Gc IgG'nin profilini çıkarmak için, sağlıklı insan donörlerinden alınan 12 serum, basılı sialoglikan mikrodizisi üzerinde analiz edildi ve mikrolitre başına nanogramlara normalize edilmiş floresan etiketli anti-insan IgG kullanılarak geliştirildi.Test edilen tüm insan serumları, eşleşen Neu5Ac içeren sialoglikan çiftlerinin neredeyse hiç tanınmadığı çeşitli seviyelerde Anti-Neu5Gc IgG içeriyordu. Ayrıca, Anti-Neu5Gc IgG tanıma paternleri, bu 12 farklı serum arasında hem yoğunluk hem de çeşitlilik açısından oldukça çeşitlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bir glikan mikroarray sistemi kullanarak çeşitli insan örneklerinde Anti-Neu5Gc antikorlarının yüksek verimli bir şekilde nasıl profilleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

profiling-anti-neu5gc-igg-human-sera-with-sialoglycan-microarray

Research

JoVE Journal

Behavior

Davranış

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Bu video, fare serumunda dolaşımdaki anti-glikan antikorlarını analiz etmek için basılı glikan dizisi teknolojisini göstermektedir. Serumdaki antikorlar, çip üzerindeki spesifik glikanlarla etkileşime girer ve bu, immün boyama ve ardından floresan taraması ile doğrulanır.

Basılı Glikan Dizisi ile Dolaşımdaki Anti-Glikan Antikorlarının Saptanması

Basılı bir glikan mikrodizi stratejisi kullanılarak, influenza A virüsü hemaglutinin aviditesi ve sialik asit içeren reseptörler için özgüllüğünün analizi için geleneksel bir 96 oyuklu plaka testi minyatürleştirildi.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Burada, insanlardan ve farelerden serum IgG ve IgM otoantikorlarının aynı anda tespiti için kullanılabilecek özelleştirilebilir antijen mikrodizileri oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu diziler, ilgilenilen herhangi bir antijene veya epitopa karşı antikorların yüksek verimli ve kantitatif tespitine izin verir.

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray&#39;ler Üretimi

N- glukanlardir bağlantı için bir alüminyum oksit kaplı cam sentezi için modüler bir yaklaşım olarak geliştirilen glycan Mikroarray ve geniş antikor nötralize bir HIV profil oluşturma için kullanımı gösterilmiştir (ACG slayt) kaydırın.

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

Bu eser basılı glycan dizi (PGA) teknoloji küçük hayvanlarda Anti-karbonhidrat antikorlar dolaşan analiz için potansiyelini gösterir.

Basılı Glycan dizi: Anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği

Biz farklı virüs suşları 250 üzerinde antijenler karşı birden fazla antikor izotürler için aynı anda prob serum nitroselüloz kaplı slaytlar üzerine baskı grip antijenleri tarafından inşa edilen bir protein mikroarray kullanmak için bir protokol sunuyoruz, böylece virüs alt türleri arasında serum antikorları genişliği ölçümü izin.

Virüs subtypes arasında serum antikorların genişliğini ölçmek için bir Influenza antijen microarray kullanımı

İmmünoglobulin G (IgG) N-glikan hidrofilik etkileşim kromatografiu UPLC ile karakterizedir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır. Burada sunulan yaygın araştırma ortamlarında kullanılabilir, böylece bu deneysel yönteme bir giriştir.

Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi

Bir antikorun glikozilasyon paterni klinik performansını belirler, bu nedenle glikozilasyonu kontrol etmek için endüstriyel ve akademik çabalar devam eder. Tipik glikomühendislik kampanyaları zaman ve emek yoğun olduğundan, geçici susturma kullanarak glikozilasyon genlerinin etkisini karakterize etmek için hızlı bir protokolün oluşturulması yararlı olacaktır.

Çin Hamster Yumurtalık Hücrelerinde Hızlı Antikor Glikomühendisliği

Mikroarray polimer profilleme (MAPP), biyolojik numunelerdeki glikanların bileşimsel analizi için yüksek verimli bir tekniktir.

Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)

Keşfedin sialoglikan mikroarray testi ile insan serumlarında Anti-Neu5Gc IgG profilleme yöntemini. Bu yüksek verimli teknik, kanser ve kronik inflamasyon gibi hastalıklarda glikoimmünoloji araştırmalarına katkı sağlar.

Anti-Neu5Gc IgG'yi İnsan Sera'sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Daha fazla video keşfet