Name: Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Öğrenin, adresli damlacık mikrodiziler kullanarak tek hücrelerde p53 proteininin mutlak kopya sayısını belirleme yöntemini. Bu teknik, kanser biyolojisinde protein dinamiklerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ASR deneyleri, protokolleri tasarlanıp geliştirildi veri analiz. SC ve PS hücre boyutu deneyleri yürüttü. ASR ve OC el yazması yazdı. Yazarlar minnetle Prof. David R. Klug destek ekipman erişim sağlamak için kabul etmek istiyorum. Yazarlar Imperial College gelişmiş Hackspace imalat ve prototip oluşturma özellikleri erişim için teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single+cell+and+single+molecule+proteomics+for+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).</li>
<li>Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+tools+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis tools for drug discovery and development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).</li>
<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first+step+towards+practical+single+cell+proteomics%3A+a+microfluidic+antibody+capture+chip+with+TIRF+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection.</a> Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressable+droplet+microarrays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis.</a> Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).</li>
<li>Ramji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+kinase+signaling+assay+using+pinched+flow+coupled+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (3), 34104(2014).</li>
<li>He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+encapsulation+of+single+cells+and+subcellular+organelles+into+picoliter-+and+femtoliter-volume+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets.</a> Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).</li>
<li>Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+TIRF+microscopy+to+quantify+and+confirm+efficient+mass+transfer+at+the+substrate+surface+of+the+chemistrode%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode.</a> New J. Phys. 11 (31), 75017(2009).</li>
<li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+picoliter+droplet+array+for+parallel+real-time+polymerase+chain+reaction+based+on+double-inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing.</a> Lab Chip. 14 (18), 3603(2014).</li>
<li>Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28(2016).</li>
<li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li>
<li>Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floating+droplet+array%3A+An+ultrahigh-throughput+device+for+droplet+trapping%2C+real-time+analysis+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery.</a> Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).</li>
<li>Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Karthikeyan_Narayanan2/publication/257690809_Elucidating_drug_resistance_properties_in_scarce_cancer_stem_cells_using_droplet_microarray/links/554ac2700cf29752ee7c3360.pdf">Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray.</a> Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).</li>
<li>Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlelanding/2016/ra/c6ra06011k">Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings.</a> RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+nanoinjection+for+high-thoughput+chemiluminescence+immunoassay+on+multicapillary+glass+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate.</a> Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).</li>
<li>Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+protein+crystallization+and+screening+with+a+microfluidic+droplet+robot%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot.</a> Sci. Rep. 4, 5046(2014).</li>
<li>Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-in-oil+array+for+picoliter-scale+analysis+based+on+sequential+inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing.</a> Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).</li>
<li>Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22One+cell-one+well%22%3A+A+new+approach+to+inkjet+printing+single+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">"One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays.</a> ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).</li>
<li>Yusof, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet-like+printing+of+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+a+Chip+-+Miniaturisation+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inkjet-like printing of single-cells.</a> Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).</li>
<li>Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+2-dimentional+droplet+array+for+single-cell+reverse+transcription+quantitative+PCR+assay+with+a+microfluidic+robot%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot.</a> Sci. Rep. 5, 9551(2015).</li>
<li>Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23114283">Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications.</a> Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).</li>
<li>Kozak, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-volume+wall-less+immunoassays+using+patterned+planar+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates.</a> Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).</li>
<li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li>
<li>Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2072-666X/2/2/179/htm">Microvalves and Micropumps for BioMEMS.</a> Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).</li>
<li>Lai, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+use+of+laser-based+lysis+for+cell+analysis+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+advantages+and+constraints+in+miniaturized+capture+assays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis.</a> Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).</li>
<li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+single-cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Current techniques for single-cell lysis.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).</li>
<li>Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+effects+on+enzyme+activity+and+solubilization+of+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes.</a> BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).</li>
<li>Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/microfluidic-single-mammalian-cell-lysis-in-picolitre-droplets-2155-6210.S12-001.php?aid=14625">Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets.</a> J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).</li>
<li>Burgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+protein+copy+number+using+a+single-molecule-sensitive+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray.</a> Analyst. 139 (13), 3235(2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Adresli damlacık Microarrays kantitatif tek bir hücrede bulunan protein mutlak kopya sayısını belirlemek için hassas ve genişletilebilir bir yöntemdir.
Non-spesifik bağlama düzeyini sınırlama (NSB) bir sınır tespiti mümkün olduğunca düşük olarak ulaşmak için iletişim kuralına önemlidir. Protein ve diğer biyokimyasal türler özellikle sigara bağlamak için arabirimler damlacıkları içinde mevcut bir dizi — coverslip yüzey, antikor nokta ve yağ/su arabirimi. Proteinler arabirimi veya petrol kendisi...

Bu yöntemin amacı bereket bir hedef proteinin hücre popülasyondaki özneleri, tek hücre çözünürlük varyasyon tespit etmektir. Tek hücre Analizi birçok geleneksel ensemble biyokimyasal yöntemlerle kullanılamaz avantaj sağlar. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 öncelikle, tek hücre düzeyinde çalışan nüfusunun geleneksel ensemble biyokimyasal teknikleri ile oluşan sayı ortalaması alınarak kaybeden bir hücre zengin heterojenite yakalayabilirsiniz. Genellikle yapmak gibi çoğu iş-at biyokimyasal Yöntemler ile toplu, gerektiren, milyonlarca hücre bir sonucu elde etmek için çalışır. Tabii ki, tüm hücre popülasyonlarının değerlendirme sonuçlarını bağlı bir dizi faktöre, örneğin, heterojenite protein ifadesindeki nerede bazı önemli özellikleri protein bereket dağılımı özledim. Pratik bir bakış açısından, tek hücre teknikleri gerekli hassasiyeti onları çalışmaya bile daha duyarlı toplu teknikleri için yetersiz biyolojik malzeme miktarları ile çalışma yeteneğine sahip olun. Bu anahtar bir örnek gibi tümör hücreleri (CTCs) nerede kötü prognostik outlook olan hastalar için bile 10 CTCs bir tek 7.5 mL kan mevcut olabilecek daha az çizmek dolaşan nadir hücre tipleri çalışmadır. 6 burada tek hücre proteini ölçümleri antikor tabanlı tahlil petrol şapkalı damlacıkları istihdam bir antikor Mikroarray baskılı azaltılmış bir birim için gerçekleştirmek için gereken yöntemi mevcut.
Mikrosıvısal damlacık platformlarına yüksek işlem hacmi, damlacıkları ikinci ve yetenekli yalıtma ve hatta kültür, tek hücre başına binlerce bireysel damlacıkları biyokimyasal testleri geniş bir dizi gerçekleştirmek için elde edebilecektir. Damlacık tabanlı teknikleri de tek hücre analizi,7,8,9 ile hangi büyük ölçüde gücüyle destekli DropSeq1110 ve inDrop, dahil olmak üzere önemli son örnek için uygundur güçlendirme teknikleri. Malzeme sınırlı miktarda amplifikasyon hiçbir yöntem proteinler için yapmak ve tek hücre proteomik özellikle zorlu.
Damlacıkları birkaç yöntem tarafından analiz edilecek ve floresans mikroskobu yaygın olarak kullanılmıştır. Toplam iç yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi gibi tek molekül teknikleri ile eşsiz sinyal-gürültü oranı görüntülenmeyecektir floresan molekülleri sağlar. 12 fani alan üstel çürümesi nedeniyle, TIRF iyi bir strateji karmaşık bir karışımı bir hedef molekül küçük miktarlarda saptamada yapma sadece fluorophores (sırasıyla 100nm) yüzeyine yüksek birbirine heyecanlı mısın. Zaman ve karmaşıklık sınırları tahlil ve TIRF doğal optik parça gücünü de yıkama adımları önlemek için yardımcı olur. Ancak, TIRF düzlemsel yüzeyler gerektirir ve bir düzlemsel yüzeyine hangi görüntü oluşumu damlacıkları akışı uygulanan TIRF mikroskobu örnekleri içerir. 13 bu amaçla, tek hücre proteomik teknikler kez mikrosıvısal çip çevresinde yüzey immobilize yakalama ajanlar bir Mikroarray biçimde tasarlayın. 4 , 14
Damlacıkları, kendilerini, düzlemsel yüzeylerde, sözde damlacık microarrays dizilerde oluşmuş. 15 , 16 , 17 dağınık şekilde organize damlacıkları dizilerden onlara uygun dizine, kolayca zaman içinde izlenen, ayrı ayrı ele alınması ve gerekirse, alındı sağlar. Damlacık microarrays yüksek yoğunluklu mikro-reaktörler müstakil veya microwell yapıları tarafından desteklenen elemanları küçük parça başına binlerce elde edebilirsiniz. 18 , 19 , 20 oluşturdular tarafından sıvı işleme robotlar, mürekkep püskürtmeli spotters, sıralı ifade tarafından microarrayers21,22,23,24,25, iletişim 26 ya da kendi kendine bir araya superhydrophillic gibi yüzeylerde lekeler desenli bir superhydrophobic yüzeye. 27 , 28 , 29
Bunu göz önünde bulundurarak, adresli damlacık Microarrays (ADM'ler) çok yönlülük, kayma adreslenebilirliği ve damlacık microarrays düşük hacimli teminatlarının tek molekül TIRF Mikroskopi için duyarlılık ile birleştirmek için tasarlanmıştır protein bereket ölçmek. 5 daha sonra buharlaşma önlemek için yağ ile kaplıdır bir antikor Mikroarray üzerinde tek hücreleri içeren bir damlacık Mikroarray oluşturan tek hücre Analizi ADM'ler etkinleştirin. Damlacıkları hacimleri üstünde-küçük parça içinde sürekli akışı Havacilik valving tarafından elde örnek kaybını önlemek için ayrı. 30 hedef protein tek bir hücreden mutlak miktarı son derece küçüktür; Ancak, damlacıkları azaltılmış hacmi için nispeten yüksek yerel yoğunlaşması sağlar bir sandviç antikor tahlil kullanarak algılanır - antikor ayrı bir bölgede ya da nokta, hangi sırayla bağlayan protein yakalar bir yüzey üzerinde immobilize umulur ki için bir fluorescently etiketli algılama antikor damlacık hacmindeki mevcut. Bir etiket içermeyen bir yaklaşım (yani protein hedefler doğrudan etiketli gerek yok), ADM'ler işlenmiş kan gibi birincil kaynakları hücrelerinden analiz için genellikle tabidir, iyi örnekleri ve Disosiye tümör biyopsi yanı sıra kültür hücrelerden gerekir ve onların lysates.
Buna karşılık, örneğin, heterojen bir ilaç belirlemede önemlidir varyasyon protein bolluk içinde bir hücre nüfus arasında ölçme ve hücresel işlevler ve yollar, altgrupları değerlendirme sağlamada yardımcı olacak ve onların Aksi takdirde toplu yöntemlerle maskeli nadir olayları tanımlayın yanı sıra davranış. Bu iletişim kuralı üretmek ve adresli damlacık microarrays kantitatif transkripsiyon faktörü p53 insan kanser hücrelerinin içinde bolluk belirlemek için nasıl kullanılacağını açıklar ve p53 kemoterapötik ilaçlara yanıt rolünü araştırmak için kullanılabilir olur. Hedef protein yakalama ve algılama antikorları seçimi ile belirlenir ve daha fazla veya farklı hedefleri içerecek şekilde değiştirilmiş. Genel Laboratuvar sarf malzemeleri el ile yağ ile şapkalı 10 nL damlacıkları dizi için gelen eş merkezli bir meme birleştiren bir basit aparatı oluşturmak için yönergeler sağlanmıştır. Her damlacık sonra sonra lysed tek bir hücre TIRF mikroskobu kullanılarak tek molekül çözümleme ile belirlenen protein ifade dolu olan sayede tam deneysel işlemi açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Hücre kültürü</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Serum (PBS)</td><td>DMEM</td><td></td> yüksek glikoz 10010015 <td></td>Yaşam</tr><tr><td></td><td>Teknolojileri Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>hücre kültürü şişeleri</td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, İngiltere</td><td>OmniGrid Mikro</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokontak pin</td><td>ArrayIt, ABD</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Lameller (Nexterion)</td><td>Schott, Avrupa</td><td>1098523</td><td>Boyut (mm): 65.0 x 25.0; Kalınlık (mm) 0.17</td></tr><tr><td>p53 yakalama antikoru</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53 tespit antikoru, Alexa Fluor 488 etiketli</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>stok konsantrasyonu 200&mu; g / mL</td></tr><tr><td>Tuzlu su-sodyum sitrat tamponu</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Betain</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>384 kuyu plakası (düşük hacimli)</td> <td>Sigma</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>Azot gazı silindiri</td><td>BOC</td><td>Endüstriyel sınıf, oksijensiz</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü></td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipülator</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Manuel Mikroenjektör</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td>Mikropipet</tr><tr><td></td><td>Origio, Danimarka</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompaları</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L şırınga</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>Gaz geçirmez, PTFE Luer kilidi</td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>Gaz geçirmez, PTFE Luer kilidi</td></tr><tr><td>Silikon izolatör</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>Yapışkanlı 6x4 kuyulu silikon izolatör</td></tr><tr><td>Lazer kesici</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 CO2 Lazer 3W</td><td>Özel izolatörlerin lazer kesimi için</td></tr><tr><td>1 mm kalınlığında akrilik levha</td><td></td><td>Özel izolatörlerin lazer kesimi için</td>Weatherall-UK <td>Clarex Hassas Levha 001</td></tr><tr>Özel <td>izolatörleri mikrodizili lamellere yapıştırmak için kullanılan</td><td>yapışkan levha</td><td>3M</td><td></td></tr><tr><td>Süper yapıştırıcı</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 & mu; m Kimliği/360 ve mu; m OD erimiş silika boru</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm ID / 1/16 " OD PFA boru</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014 " Kimlik/0.062" OD PTFE boru</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm ID / 2.0 mm OD FEP boru</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf su</td><td>Millipore, Almanya</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Şirket</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mikroskopi & Kodlanmış XY aşamalı optik</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF mikroskobu</td><td>Nikon, Japonya</td><td>Nikon Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Teknolojileri, İrlanda</td><td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td>Lazer uyarma kaynağı</td><td>Vortran, ABD</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>Optik lizis lazer kaynağı</td><td>Continuum, ABD</td><td>Sürelit SLI-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop TIRF</td><td>Chroma, ABD</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>Optik Lizis</td><td>Lazer 2000</td> için mikroskop filtre küpü, İngiltere <td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı <</td> <td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Açık Kaynak</td><td></td><td>Görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>sürüm 7.14 veya üstü</td><td>Görüntü analiz yazılımı</td></tr></tbody></table>

proteinler adresli damlacık microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Sık sık hücresel davranış ve hücresel yanıt nerede birçok hücre yanıtları birlikte zengin tek hücre davranış karmaşık bir nüfus içinde maskeleme ortalama bir sonucu olarak havuza nüfus düzeyinde analiz edilir. Tek hücre proteini algılama ve miktar teknolojileri son yıllarda kayda değer bir etki yapmış. Burada bir pratik ve esnek tek hücre Analizi platform adresli damlacık microarrays üzerinde tabanlı açıklayın. Bu çalışma nasıl hedef proteinler mutlak kopya sayısına tek hücre çözünürlük ile ölçülen açıklar. Tümör baskılayıcı p53 ile toplam kanser vakalarının bir sigara sağlıklı p53 ifade deseni sergileyen % 50'den fazla insan kanseri en sık mutasyona uğramış gen var. Protokolü ile tam ifade değişkenlik belirlemek için tek molekül kararlılık içinde olan tek insan kanser hücreleri izole edilmiştir ve p53 protein kopya sayısı ölçülen 10 nL damlacıkları oluşturmak için adımları açıklar. Yöntem ilgi herhangi bir hedef proteinler mutlak kopya sayısını belirlemek için birincil malzeme dahil olmak üzere herhangi bir hücre türüne uygulanabilir.

P53 mutlak bazal protein kopya sayısı bir insan kolon kanseri hücre kültürünü, BE hücreleri tek hücre çözünürlük ile tespit edilmiştir. Biz nasıl p53 ifade büyüklükte birkaç emir üzerinde değişir ve hücre boyutu ve protein kopya sayısı içinde dinlenme BE hücre nüfus arasında bir zayıf pozitif korelasyon göstermek göstermek.
Sulu damlacıkları antikor spot yerlerde reçete ve yağ ile şapkalı adresli damlacık Microarrays oluşur. Bur...

Burada adresli damlacık microarrays (ADM'ler), bir damlacık array tabanlı yöntemi mutlak protein bolluk içinde tek hücreleri belirlemek mümkün mevcut. Biz heterojenite tümör baskılayıcı protein p53 bir insan kanser hücre satırı ifade derecesinin ADM'ler kapasitesini göstermek.

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Bu deneyin genel amacı, hedef bir proteinin mutlak protein kopya sayısını tek hücre çözünürlüğüyle belirlemektir. Tek hücre teknikleri, bir proteinin santral dogma ile ilişkili davranışının daha iyi anlaşılmasını sağlayacak ve kontrollü gen ekspresyonunun doğru şekilde nicelendirilmesine yardımcı olacaktır. Tek hücre düzeyinde çalışmak, geleneksel biyokimyasal tekniklerle gerçekleşen ortalamalar nedeniyle kaybolacak olan hücre popülasyonunun zengin heterojenliğini yakalayabilir.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, tek hücreli analizlerin hassasiyeti veya her hücredeki protein miktarının sınırlı olması nedeniyle zorluk yaşarlar. Bu yöntem fikri ilk olarak, ilerleyen aşamalardaki analizler için kolayca örnekleme yapılabilen bir tek hücreli protein analizi gerçekleştirme isteğimizle ortaya çıktı. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklanan şekilde çipleri hazırlayarak ve antikor mikro dizilerini basarak başlayın.Cihazı hazırlamak için, 100 mm uzunluğunda, 150 µm iç çaplı ve 360 µm dış çaplı ergimiş silika tüpü, 40 mm uzunluğunda, 1 mm iç çaplı ve 1/16 inç dış çaplı PFA tüpün içine iki milimetre dışarı çıkana kadar yerleştirin. Bu işlem, konsentrik nozülü oluşturacaktır. 10 µL pip

counting-proteins-in-single-cells-with-addressable-droplet-microarrays

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Bu protokol hücre sinyal çalışmalar ve biyolojik belirteç tespiti potansiyel uygulamalar ile büyük ölçekli imalat, mültipleksli iki boyutlu DNA veya antikor dizisi, özetlemektedir.

Yüksek yoğunluklu Barkod Antikor Mikroarray Akışı-desen Rehberli Fabrikasyon

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.

Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

Bu iletişim kuralı genel işlemlerini açıklar ve kalite kontrol sağlıklı yetişkin memeli tek hücreleri damlacık-esaslı, yüksek üretilen iş tek hücre RNA-Seq hazırlıkları hazırlanması için gerekli denetler. Sıralama parametreleri, okuma hizalama ve aşağı akım tek hücreli bioinformatic analiz da sağlanır.

Damlacık tek hücre barkodlama tabanlı Transcriptomics yetişkin memeli dokuların

Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Protokolün genel amacı, hücre içermeyen protein sentezi için kullanılabilecek 1 cm2 düzlemsel substrat üzerinde bir milyondan fazla sipariş, üniforma, kararlı ve biyouyumlu femtolitre damlacıkları hazırlamaktır.

Tek DNA Moleküllerinden Kitlesel Paralel Protein Sentezi için Femtolitre Damlacık Dizisi

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

Bu yöntem, koloni oluşturma birimlerine (CFU'lar) plaka oluşturmak için 96 kuyucuklu bir plaka formatı kullanarak mikrobiyal bolluğu ölçer ve tüm sinek homojenat numunelerinde Drosophila mikrobiyomuna uygulanır. CFU'lar, burada sağlanan otomatik bir görüntü analiz yazılımı ile sayılır.

Drosophila Mikrobiyomuna Uygulanan 96 Delikli Plaka Formatında Hızlı Koloni Oluşturma Birimi Sayımı

Öğrenin, adresli damlacık mikrodiziler kullanarak tek hücrelerde p53 proteininin mutlak kopya sayısını belirleme yöntemini. Bu teknik, kanser biyolojisinde protein dinamiklerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Daha fazla video keşfet