Name: Viral Örneklerin Negatif Boyanması İçin Kapsüllerin Biyokontainment İçerisinde Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Öğrenin, biyokontainment ortamında viral örnekler için negatif boyama yöntemini. Bu teknik, TEM ızgaralarının güvenli ve etkili şekilde işlenmesini sağlayarak viroloji araştırmalarında virüs morfolojisinin incelenmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

John Carra ve Rowena Schokman&#39;a saflaştırılmış Ebola nano-VLP&#39;lerini sağladıkları için teşekkür ediyoruz, Dr. Rajini Mudhasani, Chikungunya virüsünü sağlıyor ve Dr. Charles (Jason) Shoemaker, Ebolavirüs glikoproteinlerini ifade eden Murin Lösemi VLP&#39;lerini sağlamaya teşekkür ediyoruz. Yaz Staj Programını (SIP) ve Bilim ve Mühendislik Çıraklık Programını (SEAP) ve Dr Catherine Wilhelmsen&#39;i laboratuvar güvenliği eğitimi için kolaylaştırdıkları için MAJ Carl Soffler&#39;a teşekkür etmek isteriz.

1. Virüs Örnekleri ile Çalışma Yapmadan Önce Bir BSL-2 Ortamında Deney Hazırlama <ol><li> Formvar ve karbon kaplı TEM bakır ızgaraları hazırlayın veya satın alın, genellikle 200-400 mesh&#39;dir. </li><li> Kaplanmış TEM ızgaralarını kapsüllere yerleştirin. <ol><li> Bu işlemi gerçekleştirmek kolaylaştırmak için büyütülmüş bir mercek kullanın. Her bir kapsüle bir veya iki ızgaralar takılabilir. İstenirse, bu adımı ortadan kaldırmak için önceden yüklenmiş kapsüller satın alınabilir. </li></ol></li><li> Eklenmiş TEM kaplamalı ızgaralı kapsülleri, diğer malzemeler ve reaktiflerle birlikte, virüslerin olumsuz olarak lekelenebileceği biyolojik kaplara aktarın. </li></ol> 2. Sulu Glutaraldehit ve% 1 Osmiyum Tetroksit Buharı İnaktivasyonu Kullanan Biyokontainment Sırasındaki Negatif Boyama İçin Kapsül Yöntemi <ol><li> Biyokontainment BSC içinde, pipetle takılı kapsüle 40 μL virüs süspansiyonu aspire edin. Not: pipet bağlı kalırE kapsülü tamamlanana kadar. Virüs hazırlığı bir önceki yayımıza 14 göre yapılır. </li><li> Yatay olarak yönlendirilmiş ızgaralar ile pipeti 10 dakika yan yatırın. Bu, virüs parçacıklarının kaplamalı ızgaralara eşit dağılımını sağlamaktır. </li><li> Biyokontainment BSC içindeki kapsül içindeki virüsü etkisiz hale getirin. <ol><li> Virüs solüsyonunu bir atık kabına boşaltmak için pipeti alıp pistona basınız. </li><li> Kapsüllere 40 μL% 2 glutaraldehit sabitleyici aspire edin. Dikkat: Glutaraldehit tehlikeli bir kimyasaldır ve uygun bir koruma gerektirir. Glutaraldehit, normal bir BSC&#39;de kısa süreli olarak kullanılabilir, ancak uzatılmış açık reaktif, kanallı bir BSC veya kimyasal duman davlumbazında çalışmayı gerektirir. </li><li> Pipeti 20 dakika boyunca yan yatırın. Bu, örneklerin iyi sabitlenmesini sağlamaktır. </li><li> Fiksatifi dışarı atın ve 40 μL dI suyun kapsüllere asılması için suyunu boşaltın.Katılan fiksatif maddeyi. Bu yıkama adımını toplam 3 durulama çevrimi için tekrarlayın. </li></ol></li><li> % 1 uranil asetat (UA) veya% 1 potasyum fosfotungstik asit (PTA) 40 uL&#39;yi kapsüllere aspire edin ve 30 saniye boyunca bekletin. NOT: Boyama zamanı, virüs numunesine göre 10 saniyeden 1 dakikaya kadar değişebilir. Dikkat: UA, bir alfa yayıcı ve birikimli toksindir. Uygun koruma ile tutun. </li><li> Kapsül pipetten çıkarın ve ızgaralar kapsülde kalırken ızgaranın kenarına bir filtre kağıdına dokunarak ızgaraları kurutun. </li><li> Osmium Tetroksid Buhar inaktivasyon prosedürü. <ol><li> Kapsülü, kapak açıkken,% 1 osmiyum tetroksit solüsyonuna batırılmış filtre kağıdı içeren 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Dikkat: Osmiyum tetroksit, düşük buhar basıncı ile son derece toksiktir. Kanallı BSC veya kimyasal duman davlumbazında kullanılmalıdır. Uygun koruma ile tutun. Mesaj uyarısıÇalışma alanında bilgi. </li><li> Osmiyum tetroksit buharı tamamen nüfuz edebilmek için 50 ml&#39;lik santrifüj tüpünü 1 saat boyunca mühürle. Ardından, biyokontainmentten tüpü dezenfekte edin ve BSL-2 EM tesisine aktarın. </li></ol></li><li> EM ızgaraları kapsülden çıkarın. <ol><li> BSL-2 EM tesisinde, kapsülü santrifüj borusundan çıkarın ve pipet üzerine yerleştirin. </li><li> Kap içine 40 uL dI su emdirin ve suyu üç kez bir atık kabına boşaltın. </li><li> Kapsül pipetten çıkarın ve ızgaraların kenarına dokunmak için ızgaraları filtre kağıdı ile kurutun. </li><li> Hava ile kurutulduktan sonra, ızgaraları sonraki TEM görüntüleme için saklayın. </li></ol></li></ol> 3. Bir BSL-2 Laboratuvarında Negatif Boyanmayı takiben% 2 Glutaraldehit ile Biyokontainment&#39;ta İnaktivasyon Kapsül Yöntemi <ol><li> Virüs inaktivasyon prosedürü. <ol><lI&gt; Biyokontainment BSC&#39;nin içinde,% 2 glutaraldehid&#39;in nihai konsantrasyonunu sağlamak için virüs süspansiyonunu aynı hacimde% 4 glutaraldehit ile iyice karıştırın. Dikkat: Glutaraldehit tehlikeli bir kimyasaldır ve uygun bir koruma gerektirir. Glutaraldehit, normal bir BSC&#39;de kısa süreli olarak kullanılabilir, ancak uzatılmış açık reaktif, kanallı bir BSC veya kimyasal duman davlumbazında çalışmayı gerektirir. </li><li> Virüsleri, paketlemeden önce en az 24 saat fiksatif ile etkisiz hale getirin, dekontaminasyon ve BSL-2 EM tesisine aktarın. </li></ol></li><li> BSL-2 EM tesisinde, virüs ve sabitleyici karışımı bir pipetle bağlı iki TEM ızgarasını içeren kapsüle aspire edin. </li><li> Izgaralar yatay yönlendirilmiş olarak pipeti yatay olarak 10 dakika yerleştirin. NOT: Bu, TEM ızgaralarına virüs partiküllerinin eşit dağılımını sağlamak içindir. </li><li> Virüsü atık kabına atmak için pipeti alıp pistona bastırın. 40 uL dI aspiratSuyunu kapsüller içine boşaltın ve 3 durulama döngüsü için atık kabına atın. </li><li> 30 μs boyunca kapsüllere% 1 UA veya% 1 PTA&#39;dan 40 μL aspire edin. NOT: Boyama süresi, virüs numunesine göre 10 saniyeden 1 dakikaya kadar değişir. Dikkat: UA, bir alfa yayıcı ve birikimli toksindir. Uygun koruma ile tutun. </li><li> Kapsül pipetten çıkarın ve ızgaranın kenarına bir filtre kağıdına dokunarak ızgaraları kurutun. Izgaraları havayla kurutun ve sonraki TEM görüntüleme için saklayın. </li></ol>

<ol><li>Gentile, M., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+rapid+viral+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update.</a> New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).</li>
<li>Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helmut+Ruska+and+the+visualisation+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helmut Ruska and the visualisation of viruses.</a> Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).</li>
<li>Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+transmission+electron+microscopy+to+the+clinical+study+of+viral+and+bacterial+infections%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future.</a> Micron. 37 (2), 91-106 (2006).</li>
<li>Goldsmith, C. S., Miller, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+uses+of+electron+microscopy+for+detection+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Modern uses of electron microscopy for detection of viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).</li>
<li>Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microsc+Rev%22%5BJournal%5D)">Negative staining of proteins.</a> Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).</li>
<li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+of+thinly+spread+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative staining of thinly spread biological samples.</a> Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).</li>
<li>Bradley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+bacteriophage+and+bacteriocins%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins.</a> Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+two+negative+staining+methods+on+the+Chinese+atypical+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus.</a> Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).</li>
<li>Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/services/aop-cambridge-core/content/view/S1431927615004407">Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules.</a> Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721(2015).</li>
<li>Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-today/article/capsulebased-processing-and-handling-of-electron-microscopy-specimens-and-grids/43059411AA8B965E6EA870B9ED9DFAC5">Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids.</a> Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).</li>
<li>Goodman, S. L., Kostrna, M. S. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-and-microanalysis/article/reducing-reagent-consumption-and-improving-efficiency-of-specimen-fixation-and-embedding-grid-staining-and-archiving-using-mprep-capsule-processing/BD909A4213DA1D65217A9CDDE93AB2C0">Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing.</a> Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).</li>
<li>Monninger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viral+samples+within+biocontainment+for+ultrastructural+analysis%3A+Utilization+of+an+innovative+processing+capsule+for+negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining.</a> J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).</li>
<li>Rossi, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ViroCyt%28R%29+Virus+Counter+for+rapid+filovirus+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation.</a> Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).</li>
<li>Carra, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermostable%2C+chromatographically+purified+Ebola+nano-VLP+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine.</a> J Transl Med. 13, 228(2015).</li>
<li>Rein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+viruses%3A+objects+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia viruses: objects and organisms.</a> Adv Virol. , 403419(2011).</li>
<li>Barland,, Rojkind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+with+osmium+tetroxide+vapour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative staining with osmium tetroxide vapour.</a> Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).</li>
</ol>

Makalede belirtilen görüş, yorum, sonuç ve tavsiyeler yazarların görüşleri olup, ABD Ordusu ya da Savunma Bakanlığı tarafından onaylanmayabilir.

Negatif boyama, virüsleri, protein komplekslerini ve nanoparçacıkları değerlendiren ve boyutlandıran değerli bir TEM tekniğidir. Bu örneklerin reaktiften negatif lekelere manuel olarak hareket ettirilmesiyle damlacık hazırlanması, yarım yüzyıla kıyasla klasik bir protokoldür. Bu basit bir süreçtir, ancak başarıyla tamamlanması için eğitim yoluyla edindiği uzmanlığı gerektirir. Mükemmel negatif boyama hala pek çok TEM laboratuarında son teknoloji beceri seti olarak düşünülmektedir. Kapsül yöntemi, özellikle biyokonsolida...

İletim elektron mikroskopisi (TEM), geleneksel ışık mikroskopu 1 , 2 , 3 , 4 ile görülemeyecek kadar küçük olan biyolojik örneklerin morfolojisini ve altyapısını görüntülemek için etkili bir araçtır. Elektronların ışıktan çok daha kısa bir dalga boyuna sahip olduğu için TEM&#39;ler, elektronları çok ince bir numuneyle vurarak daha yüksek çözünürlüklü bir görüntü üretir. Elektronları kirleten veya bloke eden örneklerin bölgeleri karanlık, elektron lucent olan bölgeler beyaz renktedir. Elektron yoğun maddelerin olmaması, virüsleri bir TEM altında görmek zorlaştırır, çünkü elektronları dağıtamazlar. Negatif boyama, TEM ile kontrast oluşturmak ve virüsleri görüntülemek için kullanılan en yaygın yöntemdir. İlk negatif boyama prosedürü Hall (1955) ve Huxley&#39;in (1957) gözlem yaptığı bir deney temelli 1959&#39;da Brenner ve Horne tarafından önerildiBir elektron-yoğun bir madde 5 batırıldığında ters aksine biyolojik yapıların görünüşünü ved. Negatif boyama süreci, son yarım asır boyunca neredeyse hiç değişmedi. Negatif boyama kısaca virüsü 6 infiltre olmadan yoğun bir malzeme ile virüs çevreleyen için bir girişimde bir TEM ızgara üzerinde bir numuneye bir ağır metal tuzu çözeltisi uygulanmasını kapsar. Bu, koyu bir kenar oluşturur ve parçacığın şeklini ortaya çıkarır 5 . Bu çalışma negatif boyama için iki reaktif, uranil asetat (UA) ve potasyum fosfotungstik asit (PTA) kullanmaktadır. Bu lekelerin her ikisi de, virüsler, protein kompleksleri ve nanopartiküller 7 , 8 , 9 gibi küçük biyolojik örnekleri olumsuz şekilde lekelemek için sıklıkla kullanılır. Geleneksel negatif boyama tekniği manuel damlacık negatif boyama teknolojisiNezaket 7 . Bu yöntem küçük miktarlarda virüs örneği, leke ve durulama uygulamak için forsepsle hassas, küçük, kırılgan TEM ızgaralarını kullanmayı gerektirir. Tipik hazırlama protokolü, bir film kaplı TEM şebekesinin yüzeyine örnek süspansiyon damlacıklarının uygulanmasını içerir ( Şekil 1A ). Numunenin film yüzeyine tutturulmasından sonra, ızgara yapışkan olmayan virüsleri gidermek için durulandı ve numunenin türüne bağlı olarak birkaç saniye ila bir dakika için UA veya PTA ile boyandı. Aşırı sıvı, ızgaranın kenarına bir filtre kağıdına dokunarak ızgaradan uzaklaşır. Manuel damlacık yöntemi, her bir ızgaranın ayrı ayrı yapılması gerekliliğini belirtir. Dikkatle ele alınmazsa, kaplamalı TEM ızgaraları kolayca delinir, bükülür veya kontamine olur. Birden çok numunenin işlenmesi, ızgaraları izlemek ve her numune için tutarlı boyamayı sağlamakta zorluklara neden olabilir. Bu elle boyama prosedürü çok daha fazla dBu ortamlar için gerekli olan kişisel koruyucu ekipman (KKD) nedeniyle biyogüvenlik seviyesi (BSL) -3 ve -4 biyolojik kontaminasyon laboratuvarlarında yürüttüklerinde güçlük çekmektedir. KKD hantaldır ve biyokontainment ortamı düzenli bir laboratuara kıyasla çok daha çalkantılıdır. BSL-3 biyolojik kontaminasyon laboratuarlarında çalışan personelin 2 çift eldiven giymesi ve biyogüvenlik kabininde (BSC) çalışması gerekiyor. Bu çift kat eldiven dokunma duyarlılığını azaltır ve ince motor hareketini kısıtlar. Kullanıcıyı koruyan ve numunenin kirlenmesini önlemeye yardımcı olan BSC&#39;nin hava akışı, örneklerin ve lekelerin çok çabuk kurumasına ve böylece leke kalitesinin bozulmasına neden olabilir. BSC&#39;deki güçlü türbülanslı hava akışı, iyi korunmayan bir ızgarayı da çabucak uzaklaştırabilir. BSL-4 biyolojik kontaminasyon laboratuarlarında ek güvenlik gereklilikleri vardır. Personelin, fiziksel hareketi ve açıkça görme ve manipüle etme kabiliyetini kısıtlayan pozitif basınç giymeyi giymesi gerekiyorUlate ızgaraları. BSL-4&#39;te çalışan teknisyen de en az 2 çift eldiven giyiyor; dış çift eldiven ve dokunsal duyumu büyük ölçüde azaltan kalın eldiven. Son olarak, TEM ızgaralarını tutan forsepsler keskin olduğundan, teknisyene eldivenlerini delme yetenekleri nedeniyle bir risk oluşturuyor. Izgara içeren kapsüller ile, forseps gerekli değildir, böylece biyolojik kontaminasyonda ızgaraları manipüle etmek için forsepsten muaf bir alternatif sağlar. Son olarak, kapsüller aynı zamanda işleme, osmiyum buhar dekontaminasyonu ve depolama sırasında ızgaraları depolamak için etkili bir yol sağlar; Böylece ızgaraları düzenli ve hasar görmeden muhafaza eder. Bu raporda, mPrep / g kapsüller, ızgara kullanım ve 10, 11, 12 lekelenmesi için bir kapsül bazlı cihaz kullanan biyolojik sınırlama laboratuarlarında negatif boyama TEM ızgaraların için yeni bir yöntem sunar. Kapsül kayitlariİki TEM ızgarasını değiştirir, direkt kullanımını en aza indirir ve ızgara hasarı olasılığını azaltır. Kapsül, içinde bulunan ızgaralara çeşitli sıvıların uygulanmasına izin verecek şekilde, bir pipet ucu gibi doğrudan tek veya çok kanallı bir pipete bağlanır. Bu, çoğaltılmış ızgaralarla birden çok numunenin aynı anda hazırlanmasını sağlar ( Şekil 1B ). Kapsüllü negatif lekeye virüs örneği kapsül içine aspire edilir ve virüslerin ızgaralı yüzeylere adsorbe olmasını sağlamak için 10 dakika bekletilir. Adsorbe edilen virüslü ızgaralar daha sonra deiyonize (dI) su ile yıkanır ve birkaç saniye ila 1 dakika boyunca UA veya PTA ile boyanır. Bu işlem, manuel damlacık yöntemi ile aynı protokol adımlarını ve reaktifleri kullanır; Fark, tüm işlerin ızgaraların fiziksel olarak ele alınması olmadan kapsül içinde gerçekleşmesidir. ( Şekil 1C , 1D ). Bu çalışmanın amacı, kapsüllerinBiyokontainment ortamlarında virüs örneklerinin negatif boyanması için yeni bir yöntem. Bu çalışma ayrıca, iki farklı virüs inaktivasyon prosedüründen üretilen TEM görüntülerinin kalitesini inceledi: 1)% 1 osmiyum tetroksit buharı ile hızlı inaktivasyon ve 2)% 2 glutaraldehitle 24 saat inaktivasyon. Her ikisi de kapsülleri kullanarak gerçekleştirildi. Son olarak, yaygın olarak kullanılan negatif lekeleri, UA ve PTA&#39;yi kapsülde kullanmak için değerlendirdik. 13

<table><tbody><tr><td>Formvar/karbon kaplı TEM ızgaraları</td><td>SPI</td><td>3420C-MB</td><td>200 gözlü Cu Pk/100</td></tr><tr><td>mPrep/g kapsüller</td><td>EMS</td><td>85010-01</td><td>kutu</td></tr><tr><td>mPrep/f kuplörler</td><td>EMS</td><td>85010-11</td><td>standart 16/Pk</td></tr><tr><td>glutaraldehdyde</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>%50 çözelti, EM sınıfı</td></tr><tr><td>Osmiyum Tetroksit</td><td>EMS</td><td>19190</td><td>%4 sulu çözelti</td></tr><tr><td>Uranil Asetat</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>toz</td></tr><tr><td>Potasyum fosfotungstik asit</td><td>EMS</td><td>19500</td><td>toz</td></tr><tr><td>filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>1450-090</td><td>boyut 50</td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu</td><td>JEOL</td><td>JEM-1011</td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

viral Örneklerin negatif boyanması İçin kapsüllerin biyokontainment İçerisinde kullanımı

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

İletim elektron mikroskobu (TEM), virüslerin ve diğer mikrobik patojenlerinin nanometrenin çözünürlüğünü gözlemlemek için kullanılır. Çoğu biyolojik materyal, elektron saçarak görüntüyü oluşturmak için yoğun elementler içermez; Bu nedenle, yoğun ağır metal tuzlarını numune etrafına yerleştiren negatif bir leke gereklidir. Askıdaki virüsleri TEM altında görselleştirmek için sadece nanometre kalınlığında şeffaf bir yüzeye sahip küçük ızgaralara uygulanmalıdır. Küçük boyutları ve kırılganlıklarından dolayı, bu ızgaraları tutmak zordur ve hava akımlarıyla kolayca taşınırlar. İnce yüzey kolayca hasar görebilir ve numuneyi görüntü zorlaştırır ya da imkansız hale getirir. Bulaşıcı virüsler, biyogüvenlik kabininde (BSC) ele alınmalı ve bazıları biyolojik kontaminasyon laboratuar ortamına ihtiyaç duymaktadır. Biyogüvenlik düzeyleri (BSL) -3 ve -4&#39;deki boyama virüsü, özellikle bu ortamlar daha çalkantılı olduğu ve teknisyenlere ihtiyaç duymaları nedeniyle zorlayıcıdır.• Kişisel becerileri azaltan kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin. Bu çalışmada, biyolojik kontaminasyonda negatif boyama virüslerine yardımcı olacak yeni bir cihaz değerlendirildi. Cihaz, özel bir pipet ucu olarak çalışan bir kapsüldür. Izgaralar kapsüle yüklendikten sonra, kullanıcı virüsleri ve lekeleri kapsüllenmiş ızgaraya dağıtmak için reaktifleri kapsüle aspire eder, böylece ızgaraların kullanıcı tarafından taşınmasını ortadan kaldırır. Bu teknik BSL-3 veya -4 biyokontainment için özel olarak tasarlanmış olmasına rağmen, virüsün kolay negatif boyanmasını sağlayarak herhangi bir laboratuar ortamında numune hazırlamayı kolaylaştırabilir. Aynı yöntem, nanoparçacıkların, makromoleküllerin ve benzeri örneklerin negatif boyalı TEM numunelerini hazırlamak için de uygulanabilir.

Kapsül yöntemi, TEM görüntüleme için kaliteli negatif boyama üretir: Birincisi, manuel damlacık yöntemi ve negatif Zeire ebolavirüs lekelenmesi için kapsül yöntemleri kullanılarak üretilen görüntülerin kalitesini değerlendirdik. Ebolavirüsler Marburg virüsü ile birlikte Filoviridae ailesinin üyeleridir. Ebolavirüs genellikle çapı 80 ila 100 nm arasında olup 1000 nm&#39;nin üzerinde olabilir. Ebolavirüs BSL-4 biyolojik ko...

Bu protokol, BSL-2, -3 veya -4 laboratuarlarında kolaylıkla kullanılabilen negatif boyama virüsü örnekleri için talimatlar sağlar. İletim elektron mikroskobu şebekesini koruyan ve biyokontainmenta giren daha çalkantılı ortamlarda kullanıcıya daha kolay taşıma olanağı sağlayan yenilikçi bir işleme kapsülü de dahildir.

Viral Örneklerin Negatif Boyanması İçin Kapsüllerin Biyokontainment İçerisinde Kullanımı

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Bu yöntemin genel amacı, biyogüvenli alanlardaki viral örnekler için basit ve etkili bir TEM negatif boyama prosedürü sağlamaktır. Bu yöntem, virolojide incelenen virüslerin morfolojisi ve yapıları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, biyogüvenli alan ortamlarında elektron mikroskobu ızgaralarının kolay ve etkili bir şekilde taşınmasını sağlamasıdır. Bu teknik, tüm ortamlardaki viral örneklere kolayca uygulanabildiği için bilinmeyen bir virüsün TEM teşhisinin bir parçası olarak faydalıdır. Bu yöntemi temel olarak virüs TEM çalışmalarına yardımcı olmak için kullanmış olsak da, yöntem çok daha geniş bir uygulama alanına sahiptir ve çoğu nanoparçacığın EM incelemesinde kullanılabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, TEM ızgaralarının kapsüllere yerleştirilmesi ve kapsüllerden çıkarılması sırasında zarar görmemelerini sağlamak için biraz pratik gerektiğinden zorluk yaşayabilirler.Bu yöntemle ilgili ilk fikri, biyogüvenlik alanında küçük EM ızgaralarını kullanırken sorunlar yaşadığımızda edindik.Bu prosedüre başlamak için, Formvar ve karbon kaplı TEM bakır ızgaralar hazırlayın veya satın alın. Kaplı TEM ızgaralarını kapsüllere yerleştirin. Ardından, yüklü kapsülleri diğer malzemeler ve reaktiflerle birlikte biyolojik güvenlik alanına taşıyın. Başlamak için, kapsülü bir pipete takın. Kapsülün içine 40 µL virüs süspansiyonu aspire edin. Pipeti, ızgaralar yatay konumda olacak şekilde 10 dakika boyunca yan tarafına yatırın. Ardından, pipeti kaldırın ve virüs solüsyonunu bir atık kabına boşaltın. Kapsüllere 40 µL %2 glutaraldehit fiksatifi aspire edin. Pipeti 20 dakika boyunca yan tarafına yatırın. Bundan sonra, fiksatifi dışarı atın ve fiksatifi yıkamak için kapsüle 40 µL deiyonize su aspire edin. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.Ardından, kapsülün içine 40 µL %1 üranil asetat veya %1 potasyum fosfotungstik asit aspire edin. Kapsülü 30 saniye boyunca bekletin. Daha sonra, kapsülü pipetten çıkarın.Kurulamak için filtre kağıdının bir ucunu ızgaraların kenarına değdirin. Filtre kağıdını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, filtre kağıdını %1'lik osmiyum tetroksit çözeltisinde bekletin.Kapağı açık olan kapsülü tüpün içine yerleştirin. Osmiyum tetroksit buharının tamamen nüfuz etmesini sağlamak için tüpü bir saat boyunca kapalı tutun. Bundan sonra tüpü dekontamine edin ve biyogüvenlik alanından BSL-2 EM tesisine transfer edin.Kapsülü santrifüj tüpünden çıkarın, ardından bir pipetin ucuna yerleştirin. Kapsülün içine 40 µL deiyonize su aspire edin ve ardından suyu bir atık kabına boşaltın. Bu suyla yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.Ardından, kapsülü pipetten çıkarın. Filtre kağıdı kullanarak ızgaraları kurulayın. Izgaraların havada kurumasını bekleyin ve ardından TEM görüntüleme aşamasına gelene kadar bir ızgara kutusunda saklayın.Başlamak için, %2 nihai glutaraldehit konsantrasyonuna ulaşmak amacıyla virüs süspansiyonunu eşit hacimde %4'lük glutaraldehit ile karıştırın. Sabitleyici kullanarak virüsü en az 24 saat boyunca inaktive edin. Tüpü dekontamine edin ve BLS-2 EM tesisine transfer edin. Bundan sonra, yüklü bir ızgara yakalayıcıyı pipete takın. Karışımı kapsül içine aspire edin. Pipeti, ızgaralar yatay konumda olacak şekilde yan tarafına 10 dakika boyunca yerleştirin.Ardından, pipeti alarak virüs karışımını bir atık kabına boşaltın. Kapsül içerisine 40 µL deiyonize su aspire edin ve ardından suyu bir atık kabına boşaltın. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.Bunun ardından, kapsül içine 30 saniye boyunca 40 µL %1 UA veya %1 PTA aspire edin. Kapsülü pipetten çıkarın. Filtre kağıdı kullanarak gridleri kurulayın.Ardından, ızgaraların havada kurumasına izin verin.Bu çalışmada, Zaire Ebola virüsü örnekleri, hem manuel damla yöntemi hem de kapsül yöntemi kullanılarak negatif boyamaya tabi tutulmaktadır. Bu yöntemlerle elde edilen TEM görüntüleri, viryonun merkezindeki nükleokapsid yapıları ve yüzeydeki görünür glikoproteinler ile net tanımlanmış detaylar göstermektedir. Böylece, kapsül yönteminin manuel damla yöntemiyle üretilenlerle benzer kalitede TEM görüntüleri üretebildiği görülmektedir. Ardından, Chikungunya virüsü kullanılarak farklı örnek inaktivasyon yöntemleri karşılaştırılmaktadır. Örnek inaktivasyonu, ya 2% glutaraldehit ile 20 dakika ve ardından 1% osmiyum tetroksit ile bir saat boyunca maruz bırakılarak hızlı bir şekilde ya da 2% glutaraldehit kullanılarak 24 saat boyunca gece boyu gerçekleştirilmektedir. Görüldüğü üzere, osmiyum tetroksit içermeyen daha uzun inaktivasyon süreci, daha fazla ultrastrüktürel detayın görülmesine olanak tanımaktadır.Ardından, kapsül yöntemi kullanılarak, aldehit ile fikse edilmiş virüs benzeri partiküller kullanılarak iki boya karşılaştırılmıştır. Hem uranyl acetate hem de phosphotungstic acid, net tanımlanmış sınırları ve görünür glikoproteinleri ile yüksek kaliteli sonuçlar sergilemektedir.Bu teknikte uzmanlaşıldığında, örnek sayısına bağlı olarak işlem yaklaşık bir buçuk saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, deneysel hedeflerinize uygun fiksatör ve boyama reaktiflerini seçmeyi unutmamak önemlidir. Virüs konsantrasyonlarının hesaplanarak ek soruların yanıtlanması amacıyla, bu prosedürün ardından partikül sayımı gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu teknik, virologların özellikle BSL-3 ve 4 seviyesindeki virüslerin morfoloji ve yapı bilgilerini çok daha kolay bir şekilde incelemelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik muhafaza alanında negatif boyama için TEM ızgaralarının nasıl kolayca yönetileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Aldehit, osmiyum tetroksit ve uranil asetat ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini; bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu donanım ve kimyasal çeker ocak gibi önlemlerin her zaman kullanılması gerektiğini unutmayın.

utilization-capsules-for-negative-staining-viral-samples-within

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Kaynak: Feltwell, T., et.al. süreksiz bir yoğunluk gradyanı kullanarak bakterileri kapsül miktarına göre ayırmak. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, değişen kapsül üretimine sahip bakteri suşlarının hazırlanmasını ve karakterizasyonunu göstermektedir. Kapsülle ilişkili genlerde farklı mutasyonlar taşıyan patojenik suşlar kültürlenir, sıvı ortamda büyütülür ve kapsül fenotiplerini pelet yoğunluğuna göre ayırt etmek için santrifüjlemeye tabi tutulur. Tampon işlemi, kapsül yapılarını korurken hücreleri...

Kapsül Oluşturan Patojenik Bakteri Suşlarının Kültürlenmesi ve İzole Edilmesi

Bu videoda, biyolojik muhafaza ortamında bir işleme kapsülü kullanarak zarflı virüs örneklerinin negatif boyanmasını gösteriyoruz. Negatif lekeli virüsler, viral yapıyı ve morfolojiyi nanometre çözünürlüğünde araştırmak için transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.

TEM Izgaraları Üzerinde Virüs Örneklerinin Kapsül Bazlı Negatif Boyanması: Zarflı Virüslerin Üst Yapısını Görselleştirmek İçin Bir Ağır Metal Boyama Tekniği

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Bu teknik polisakkarit kapsülü ve vücut yarıçaplarını ölçmek için tasarlanmış bir otomatik batch Image processor açıklar. Başlangıçta Cryptococcus neoformans kapsül ölçümleri için tasarlanmış iken otomatik görüntü işlemci dairesel nesneler diğer dayalı kontrast tespiti için de uygulanabilir.

Otomatik ölçüm Cryptococcal türler polisakkarit kapsülü ve hücre vücut

Polisakkarit kapsülü Cryptococcus neoformans, birincil virülans faktörü olduğunu ve onun büyüklüğü zorlanma virülans ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kapsül çapı ölçümleri fenotipik test ve tedavi edici etkinliği ölçmek için kullanılır. Burada kapsül indüksiyon için standart bir yol sunulmaktadır ve boyama ve çapı ölçmek için iki yöntem karşılaştırılır.

Size Matters: Cryptococcus neoformans kapsül çap ölçümü

Negatif leke EM makromoleküllerin yapısı görselleştirme için güçlü bir tekniktir, ancak farklı boyama teknikleri bir örnek bağımlı şekilde değişen sonuçlar üretebilir. Burada birkaç negatif boyama yaklaşım zorlu sistemleri görselleştirme mücadele için ilk bir iş akışı sağlamak için ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Negatif varyasyonlarında leke elektron mikroskobu yöntemleri: sistemleri zorlu mücadele için Araçlar

Bakteriyel nüfus kapsül üretim temel alarak ayırmak için kesintili yoğunluk gradyanlar kullanımını göstermektedir. Bu yöntem kapsül kültürler arası karşılaştırmak, belirli bir kapsül fenotip mutantlarla yalıtmak veya kapsül düzenleyiciler belirlemek için kullanılır. Burada açıklanan en iyi duruma getirme ve tahlil çalıştırılmasını olduğunu.

Kapsül tutarı kesintili yoğunluk Gradient kullanarak bakterilerin ayıran

Burada, enfekte amiplerin ayrılması için tek bir hücreli mikro-aspirasyon yöntemini tanımlıyoruz. Faustovirüsler ve bilinmeyen dev virüsler tarafından enfekte Vermamoeba vermiformis viral alt popülasyonları ayırmak için, aşağıda ayrıntılı protokolü geliştirdi ve iki düşük bolluk yeni dev virüs ayırma yeteneğini gösterdi.

Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon

Solunum sinsitial virüsünün (RSV) RNA sentezinin derinlemesine mekanistik analizi için, virüse özgü nükleokapsidlerin (NC) sonraki in vitro montajı için RNA içermeyen nükleoproteinin (N0)birlikte ifade edilmesi için refakatçi fosfoprotein (P) kullanma protokolünü rapor ediyoruz.

Solunum Sinsitial Virüsünün Virüse Özgü Nükleopapsidlerinin Üretimi ve Montajı

Öğrenin, biyokontainment ortamında viral örnekler için negatif boyama yöntemini. Bu teknik, TEM ızgaralarının güvenli ve etkili şekilde işlenmesini sağlayarak viroloji araştırmalarında virüs morfolojisinin incelenmesine yardımcı olur.

Viral Örneklerin Negatif Boyanması İçin Kapsüllerin Biyokontainment İçerisinde Kullanımı

Daha fazla video keşfet