Viral Örneklerin Negatif Boyanması İçin Kapsüllerin Biyokontainment İçerisinde Kullanımı

Bu yöntemin genel amacı, biyogüvenli alanlardaki viral örnekler için basit ve etkili bir TEM negatif boyama prosedürü sağlamaktır. Bu yöntem, virolojide incelenen virüslerin morfolojisi ve yapıları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, biyogüvenli alan ortamlarında elektron mikroskobu ızgaralarının kolay ve etkili bir şekilde taşınmasını sağlamasıdır. Bu teknik, tüm ortamlardaki viral örneklere kolayca uygulanabildiği için bilinmeyen bir virüsün TEM teşhisinin bir parçası olarak faydalıdır. Bu yöntemi temel olarak virüs TEM çalışmalarına yardımcı olmak için kullanmış olsak da, yöntem çok daha geniş bir uygulama alanına sahiptir ve çoğu nanoparçacığın EM incelemesinde kullanılabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, TEM ızgaralarının kapsüllere yerleştirilmesi ve kapsüllerden çıkarılması sırasında zarar görmemelerini sağlamak için biraz pratik gerektiğinden zorluk yaşayabilirler.

Bu yöntemle ilgili ilk fikri, biyogüvenlik alanında küçük EM ızgaralarını kullanırken sorunlar yaşadığımızda edindik.

Bu prosedüre başlamak için, Formvar ve karbon kaplı TEM bakır ızgaralar hazırlayın veya satın alın. Kaplı TEM ızgaralarını kapsüllere yerleştirin. Ardından, yüklü kapsülleri diğer malzemeler ve reaktiflerle birlikte biyolojik güvenlik alanına taşıyın. Başlamak için, kapsülü bir pipete takın. Kapsülün içine 40 µL virüs süspansiyonu aspire edin. Pipeti, ızgaralar yatay konumda olacak şekilde 10 dakika boyunca yan tarafına yatırın. Ardından, pipeti kaldırın ve virüs solüsyonunu bir atık kabına boşaltın. Kapsüllere 40 µL %2 glutaraldehit fiksatifi aspire edin. Pipeti 20 dakika boyunca yan tarafına yatırın. Bundan sonra, fiksatifi dışarı atın ve fiksatifi yıkamak için kapsüle 40 µL deiyonize su aspire edin. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.

Ardından, kapsülün içine 40 µL %1 üranil asetat veya %1 potasyum fosfotungstik asit aspire edin. Kapsülü 30 saniye boyunca bekletin. Daha sonra, kapsülü pipetten çıkarın.

Kurulamak için filtre kağıdının bir ucunu ızgaraların kenarına değdirin. Filtre kağıdını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, filtre kağıdını %1'lik osmiyum tetroksit çözeltisinde bekletin.

Kapağı açık olan kapsülü tüpün içine yerleştirin. Osmiyum tetroksit buharının tamamen nüfuz etmesini sağlamak için tüpü bir saat boyunca kapalı tutun. Bundan sonra tüpü dekontamine edin ve biyogüvenlik alanından BSL-2 EM tesisine transfer edin.

Kapsülü santrifüj tüpünden çıkarın, ardından bir pipetin ucuna yerleştirin. Kapsülün içine 40 µL deiyonize su aspire edin ve ardından suyu bir atık kabına boşaltın. Bu suyla yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.

Ardından, kapsülü pipetten çıkarın. Filtre kağıdı kullanarak ızgaraları kurulayın. Izgaraların havada kurumasını bekleyin ve ardından TEM görüntüleme aşamasına gelene kadar bir ızgara kutusunda saklayın.

Başlamak için, %2 nihai glutaraldehit konsantrasyonuna ulaşmak amacıyla virüs süspansiyonunu eşit hacimde %4'lük glutaraldehit ile karıştırın. Sabitleyici kullanarak virüsü en az 24 saat boyunca inaktive edin. Tüpü dekontamine edin ve BLS-2 EM tesisine transfer edin. Bundan sonra, yüklü bir ızgara yakalayıcıyı pipete takın. Karışımı kapsül içine aspire edin. Pipeti, ızgaralar yatay konumda olacak şekilde yan tarafına 10 dakika boyunca yerleştirin.

Ardından, pipeti alarak virüs karışımını bir atık kabına boşaltın. Kapsül içerisine 40 µL deiyonize su aspire edin ve ardından suyu bir atık kabına boşaltın. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.

Bunun ardından, kapsül içine 30 saniye boyunca 40 µL %1 UA veya %1 PTA aspire edin. Kapsülü pipetten çıkarın. Filtre kağıdı kullanarak gridleri kurulayın.

Ardından, ızgaraların havada kurumasına izin verin.

Bu çalışmada, Zaire Ebola virüsü örnekleri, hem manuel damla yöntemi hem de kapsül yöntemi kullanılarak negatif boyamaya tabi tutulmaktadır. Bu yöntemlerle elde edilen TEM görüntüleri, viryonun merkezindeki nükleokapsid yapıları ve yüzeydeki görünür glikoproteinler ile net tanımlanmış detaylar göstermektedir. Böylece, kapsül yönteminin manuel damla yöntemiyle üretilenlerle benzer kalitede TEM görüntüleri üretebildiği görülmektedir. Ardından, Chikungunya virüsü kullanılarak farklı örnek inaktivasyon yöntemleri karşılaştırılmaktadır. Örnek inaktivasyonu, ya 2% glutaraldehit ile 20 dakika ve ardından 1% osmiyum tetroksit ile bir saat boyunca maruz bırakılarak hızlı bir şekilde ya da 2% glutaraldehit kullanılarak 24 saat boyunca gece boyu gerçekleştirilmektedir. Görüldüğü üzere, osmiyum tetroksit içermeyen daha uzun inaktivasyon süreci, daha fazla ultrastrüktürel detayın görülmesine olanak tanımaktadır.

Ardından, kapsül yöntemi kullanılarak, aldehit ile fikse edilmiş virüs benzeri partiküller kullanılarak iki boya karşılaştırılmıştır. Hem uranyl acetate hem de phosphotungstic acid, net tanımlanmış sınırları ve görünür glikoproteinleri ile yüksek kaliteli sonuçlar sergilemektedir.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, örnek sayısına bağlı olarak işlem yaklaşık bir buçuk saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, deneysel hedeflerinize uygun fiksatör ve boyama reaktiflerini seçmeyi unutmamak önemlidir. Virüs konsantrasyonlarının hesaplanarak ek soruların yanıtlanması amacıyla, bu prosedürün ardından partikül sayımı gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu teknik, virologların özellikle BSL-3 ve 4 seviyesindeki virüslerin morfoloji ve yapı bilgilerini çok daha kolay bir şekilde incelemelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik muhafaza alanında negatif boyama için TEM ızgaralarının nasıl kolayca yönetileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Aldehit, osmiyum tetroksit ve uranil asetat ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini; bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu donanım ve kimyasal çeker ocak gibi önlemlerin her zaman kullanılması gerektiğini unutmayın.