Viral Örneklerin Negatif Boyanması İçin Kapsüllerin Biyokontainment İçerisinde Kullanımı
July 19th, 2017
Bu protokol, BSL-2, -3 veya -4 laboratuarlarında kolaylıkla kullanılabilen negatif boyama virüsü örnekleri için talimatlar sağlar. İletim elektron mikroskobu şebekesini koruyan ve biyokontainmenta giren daha çalkantılı ortamlarda kullanıcıya daha kolay taşıma olanağı sağlayan yenilikçi bir işleme kapsülü de dahildir.
Bu yöntemin genel amacı, biyolojik muhafaza içindeki viral numuneler için basit ve etkili bir TEM negatif boyama prosedürü sağlamaktır. Bu yöntem, araştırılan virüslerin morfolojisi ve yapıları hakkında virolojideki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, biyolojik sınırlama ortamlarında elektron mikroskobu ızgaralarının kolay ve etkili bir şekilde kullanılmasını sağlamasıdır.
Bu teknik, bilinmeyen bir virüsün TEM teşhisinin bir parçası olarak kullanılır, çünkü tüm ortamlarda viral örneklere kolayca uygulanabilir. Bu yöntemi öncelikle virüs TEM çalışmalarına yardımcı olmak için kullanmış olsak da, çok daha geniş bir uygulamaya sahiptir ve çoğu nanopartikülün EM araştırmasında kullanılabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü TEM ızgaralarının kapsüllerden yüklenip boşaltıldığında zarar görmemesini sağlamak biraz pratik gerektirir.
Bu yöntem için ilk olarak, biyolojik muhafazada küçük EM ızgaralarını ele almakta sorun yaşadığımızda aklımıza geldi. Bu prosedüre başlamak için viral ve karbon kaplı TEM bakır ızgaralar hazırlayın veya satın alın. Kaplanmış TEM ızgaralarını kapsüllere yerleştirin.
Ardından, yüklenen kapsülleri diğer malzemeler ve reaktiflerle birlikte biyolojik muhafazaya aktarın. Başlamak için kapsülü bir pipete takın. Kapsül içine 40 mikrolitre virüs genişlemesi aspire edin.
Pipeti, ızgaralar 10 dakika boyunca yatay olarak yönlendirilecek şekilde yan yatırın. Ardından, pipeti alın ve virüs solüsyonunu bir atık muhafazasına dağıtın. Kapsüllere 40 mikrolitre% 2 glutaraldehit fiksatifi aspire edin.
Pipeti 20 dakika yan yatırın. Bundan sonra, fiksatifi dışarı atın ve fiksatifi yıkamak için 40 mikrolitre deiyonize suyu kapsüle aspire edin. Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın.
Daha sonra, kapsülün içine 40 mikrolitre %1 uranil asetat veya %1 potasyum fosfotungstik asit aspire edin. Kapsülü 30 saniye bekletin. Ardından kapsülü pipetten çıkarın.
Kurulamak için ızgaraların kenarına bir parça filtre kağıdına dokunun. Filtre kağıdını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, filtre kağıdını% 1 osmiyum tetroksit çözeltisine batırın.
Kapsülü, kapağı açık olacak şekilde tüpün içine yerleştirin. Osmiyum tetroksit buharının tamamen nüfuz etmesini sağlamak için tüpü bir saat boyunca kapatın. Bundan sonra, tüpü dekontamine edin ve biyolojik muhafazadan BSL-2 EM tesisine aktarın.
Kapsülü santrifüj tüpünden çıkarın, ardından bir pipet üzerine yerleştirin. Kapsüle 40 mikrolitre deiyonize su aspire edin ve ardından suyu bir atık kabına boşaltın. Bu suyla yıkamayı üç kez tekrarlayın.
Ardından, kapsülü pipetten çıkarın. Filtre kağıdı kullanarak ızgaraları kurulayın. Izgaraların kurumasını bekleyin ve ardından TEM görüntülemesi yapmaya hazır olana kadar bir ızgara kutusunda saklayın.
Başlamak için, %2'lik bir nihai glutaraldehit konsantrasyonu elde etmek için virüs süspansiyonunu eşit hacimde %4 gluteraldehit ile karıştırın. Sabitleyici kullanarak, virüsü en az 24 saat etkisiz hale getirin. Tüpü dekontamine edin ve BLS-2 EM tesisine aktarın.
Bundan sonra, ızgara yüklü bir yakalamayı bir pipete takın. Karışımı kapsülün içine aspire edin. Pipeti, ızgaralar 10 dakika boyunca yatay olarak yönlendirilecek şekilde yan yatırın.
Ardından, pipeti alın ve virüs karışımını bir atık kabına atın. Kapsüle 40 mikrolitre deiyonize su aspire edin ve ardından suyu bir atık kabına atın. Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın.
Bundan sonra, 30 saniye boyunca kapsüle 40 mikrolitre% 1 QA veya% 1 PTA aspire edin. Kapsülü pipetten çıkarın. Filtre kağıdı kullanarak ızgaraları kurulayın.
Ardından, ızgaraların kurumasına izin verin. Bu çalışmada, Zaire Ebola virüsü örnekleri hem manuel damlacık yöntemi hem de kapsül yöntemi kullanılarak negatif boyamaya tabi tutulmuştur. Bu yöntemlerden elde edilen TEM görüntülerinin her ikisi de, varyasyonun merkezinde nükleokapsid yapıları ve yüzeyde görünür glikoproteinler ile açıkça tanımlanmış ayrıntıları gösterir.
Böylece kapsül yöntemi, manuel damlacık yöntemiyle üretilenlere benzer kalitede TEM görüntüleri üretebilmektedir. Daha sonra, Chikungunya virüsü kullanılarak farklı numune inaktivasyon yöntemleri karşılaştırılır. Numune inaktivasyonu, 20 dakika boyunca %2 glutaraldehit kullanılarak ve ardından bir saat boyunca %1 osmiyum tetroksite maruz bırakılarak veya gece boyunca 24 saat boyunca %2 glutaraldehit kullanılarak hızlı bir şekilde gerçekleştirilir.
Görülebileceği gibi, osmiyum tetroksit içermeyen daha uzun inaktivasyon süreci, daha fazla ultrastrüktürel detayın görülmesini sağlar. Daha sonra, kapsül yöntemi kullanılarak, aldehit ile sabitlenmiş virüs benzeri parçacıklar kullanılarak iki leke karşılaştırıldı. Hem uranil asetat hem de fosfotungstik asit, açıkça tanımlanmış sınırlar ve görünür glikoproteinler ile yüksek kaliteli sonuçlar gösterir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, numune sayısına bağlı olarak yaklaşık bir buçuk saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, deneysel hedefleriniz için uygun fiksatif ve boyama reaktiflerini seçmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, virüs konsantrasyonlarını hesaplayarak ek soruları yanıtlamak için partikül sayımı gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.
Bu teknik, virologların özellikle BLS-3 ve 4 seviye virüslerde virüs morfolojisini ve yapı bilgilerini daha kolay keşfetme şeklini geliştirir. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik muhafaza içinde negatif lekelenme için TEM ızgaralarının nasıl kolayca ele alınacağını iyi anlamış olmalısınız. Aldehit, osmiyum tetroksit ve uranil asetat ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman ve kimyasal davlumbaz gibi önlemlerin kullanılması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, biyolojik muhafaza içerisinde viral örnekler için basit ve etkili bir negatif boyama prosedürü sağlar. BSL-2, -3 veya -4 laboratuvarlarında elektron mikroskobu ızgaralarının kullanımını artıran yenilikçi bir işlem kapsülü içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Viroloji
- Elektron Mikroskobu
- Biyolojik Muhafaza Teknikleri
Arka Plan
- Negatíf boyama, virüs morfolojisinin incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
- Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) virolojide önemli bir araçtır.
- Biyolojik muhafaza içerisinde örneklerin kullanımı benzersiz zorluklar sunar.
- Bu yöntem bu zorlukları basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Viral örnekler için güvenilir bir TEM negatif boyama metodu sağlamak.
- Virüs yapılarının incelenmesini kolaylaştırmak.
- Yüksek muhafaza ortamlarında örneklerin kullanımını iyileştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Viral örneklerin negatif boyaması.
- Izgara kullanımı için bir işlem kapsülünün kullanılması.
- BSL-2, -3 veya -4 laboratuvarlarında uygulama.
- Izgara hasarını en aza indirgemek için yeni kullanıcılar için eğitim.
Ana Sonuçlar
- Biyolojik muhafaza içerisinde TEM ızgaralarının etkili kullanımı.
- Çeşitli viral örneklere başarılı uygulama.
- Nanopartikül araştırmalarında daha geniş kullanım potansiyeli.
- İşlem kapsülü ile iyileştirilmiş kullanıcı deneyimi.
Sonuçlar
- Bu yöntem, güvenli ortamlarda virüslerin incelenmesini geliştirir.
- Virolojide araştırmacılar için pratik bir çözüm sunar.
- Optimal kullanım için daha fazla eğitim gerekebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Handling electron microscopy grids in high-containment laboratories presents significant operational challenges due to environmental turbulence and restricted dexterity from personal protective equipment. This capsule-based method improves sample preparation reliability and throughput for virology discovery workflows in BSL-3 and BSL-4 settings. By minimizing manual grid manipulation, the technique supports consistent ultrastructural characterization of viral targets, enabling more confident go/no-go decisions in early-stage antiviral target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables morphological interrogation of viral targets to confirm structural integrity and support hypothesis-driven target selection.
- Operational Value: Reduces grid handling errors in biocontainment, improving data quality for downstream target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-contrast TEM specimens suitable for quantitative morphology assessment in screening cascades.
- Operational Value: Streamlines sample preparation for nanoparticle and macromolecule analysis, increasing assay readiness and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by providing reliable ultrastructural data from discovery through preclinical evaluation of viral candidates.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration between virology, microscopy, and toxicology teams through standardized, transferable sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling reliable negative staining of viral samples after inactivation and prior to imaging, supporting hypothesis testing and lead confirmation stages.
- Discovery Biology: Supports viral target validation by providing clear ultrastructural readouts that help clarify morphology and inform mechanistic understanding.
- Screening: Enhances assay standardization by producing consistent, artifact-minimized TEM grids for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Generates quantitative morphometric outputs (e.g., particle size, shape, surface features) that enable objective comparison of viral variants or treatment effects.
- Translational Research: Ensures sample preparation continuity from BSL-3/4 discovery to BSL-2 imaging, maintaining data integrity across containment levels.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform capability applicable to diverse specimens including viruses, nanoparticles, and macromolecules, maximizing infrastructure utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by reducing variability in ultrastructural data acquisition.
- Operational Value: Increases reproducibility and scalability of TEM workflows in high-containment environments through encapsulated grid handling.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by minimizing false negatives from grid damage or staining inconsistency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of viral targets based on reliable structural data, reducing late-stage attrition due to unexpected morphology.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic grid loading and unloading to prevent capsule or grid damage.
- Dependent on access to TEM-compatible capsules, pipettes, and biocontainment-approved reagents (glutaraldehyde, stains, osmium tetroxide).
- Necessitates standardized timing and orientation protocols across users to ensure uniform staining and washing.
- Requires adaptation of wash and staining times based on specimen density and contaminant load.
- Limited by the need for post-staining decontamination and transfer protocols to move samples from BSL-3/4 to BSL-2 imaging facilities.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Experiment Preparation in a BSL-2 Environment Prior to Working with the Virus Samples (Biocontainment Procedures were Filmed in BSL-4 Training Lab)
1:45
The Capsule Method for Negative Staining in Biocontainment Using Aqueous Glutaraldehyde and 1% Osmium Tetroxide Vapor Inactivation
4:24
The Capsule Method for Inactivation in Biocontainment 2% Glutaraldehyde Followed by Negative Staining in BSL-2 Laboratory
5:50
Results: Analyzing the Capsule Method of Negative Staining Viral Samples
7:14
Conclusion
