Birincil fare malzemelerin yalıtım ve Vana interstisyel hücreleri: Aort Kapak kalsifikasyon eğitim için yeni bir Model

Bu protokolün genel amacı, kalsifik aort kapak hastalığının mekanizmalarını incelemek için sıçan kapak interstisyel hücrelerini veya VIC'leri izole etmektir. Bu yöntem, VIC'lerin neden kireçlendiği ve bu hücrelerin kireçlenmesini önlemek için ne yapabileceğimiz gibi valf kalsifikasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, erişilebilirlik ve daha ileri çalışmalar için hücre hatlarına dönüşme potansiyelidir.

Numunelerin ve reaktiflerin sterilitesini sağlamak için tüm diseksiyonları daha önce% 70 etanol ile dezenfekte edilmiş havalandırmalı bir başlıkta gerçekleştirin. Diseksiyon aletlerini otoklavlayarak sterilize edin, ardından kullanmadan önce aletlerin uçlarını %70 etanol içeren bir behere daldırın. Hayvan veya dokularla temas etmeden önce diseksiyon aletlerini yıkama tamponu beherlerine batırın.

Sıçanları metin protokolünde anlatıldığı gibi itlaf ettikten sonra, hayvanı sırtüstü bir cam diseksiyon tahtasına yerleştirin ve cildi% 70 etanol püskürterek dezenfekte edin. Kalbi incelemek için, karın boşluğunu ortaya çıkarmak için diseksiyon makası yardımıyla farenin orta hattında dört santimetrelik bir kesi yapın ve kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini ve akciğerleri dikkatlice çıkarın. Kalbi bir çift keskin makasla çıkarın.

Diseke edilmiş kalbi, sıçanların tüm brüt diseksiyonları tamamlanana kadar buz gibi soğuk yıkama tamponunda saklayın. Her bir kalbi mikrodiseksiyon yapmak için, diseke edilmiş kalbi yıkama tamponu ile kaplı bir Petri kabına aktarın. Kalp kasını, çıkan aortu ve aort kökünü çevreleyen küçük bir alan olacak şekilde sola doğru bir çift yaylı düz makasla kesin.

Aynı yaylı düz makası kullanarak, çıkan aortu sol ventriküle doğru dikkatlice kesin ve aort kapak yaprakçıklarını ortaya çıkarın. Daha sonra, açılmış aortu Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi ile doldurulmuş taze steril bir Petri kabına aktarın. Aortun tabanında benzersiz U şekli ile işaretlenmiş aort kapak yaprakçıklarını bir çift Vannas makası ile inceleyin.

Tüm diseksiyonlar tamamlanana kadar tüm broşürleri bir mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponunda 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde saklayın. Tüm broşürler toplandıktan sonra, yıkama tamponunu çıkarmak için dört santigrat derecede bir dakika boyunca 100 g'da santrifüjleyin. Valf endotel hücrelerini veya VEC'leri çıkarmak için, broşürleri mililitre Kollajenaz II başına 100 mikrolitre 425 birim içinde 37 santigrat derecede beş dakika boyunca sindirin.

200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek sindirimi bozun. Broşürleri peletlemek için 100 g'da 30 saniye santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice attıktan sonra, broşürleri 500 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın ve hücreleri 30 saniye boyunca 100 g'da santrifüjleme ile yeniden peletleyin.

VIC'leri broşürlerden hasat etmek için, 100 mikrolitre Kollajenaz II ile 37 santigrat derecede 1,5 ila iki saat sindirin. Ardından, 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek VIC'leri serbest bırakın. Kollajenaz II'yi 19 mililitre kültür ortamında seyreltin ve VIC'leri ve kalan valf broşürü kalıntılarını peletlemek için beş dakika boyunca 670 g'da santrifüjleyin.

Süpernatanı attıktan sonra, broşürleri ve VIC'leri kültür plakalarına veya şişelerine aktarın. VIC'leri% 5 CO2 varlığında 37 santigrat derecede birleşmeye ulaşılana kadar kültür ortamında beş ila yedi gün boyunca kültürleyin ve ortamı 72 saat sonra değiştirin. Birincil sıçan VIC'lerini in vitro kalsifikasyon deneyleri için hazırlamak için, hücreleri altı oyuklu plakalarda kuyu başına 150.000 hücre yoğunluğunda tohumlayın.

Hücreleri% 90'dan fazla birleşme olana kadar kültür ortamında tutun. VIC'leri kontrol ortamına karşı kalsifikasyon ile tedavi edin ve 72 saat daha% 5 CO2 varlığında 37 santigrat derecede inkübe edin. Sonraki aşağı akış analizleri için kalsifiye edilmiş birincil sıçan VIC'lerini incelemek için, kalsifikasyonu veya kontrol ortamını çıkarın.

Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi sıçan VIC karakterizasyonunu gerçekleştirmeden önce bağlı olmayan kalsiyum ve fosfat iyonlarını çıkarmak için tek katmanları yıkama tamponu ile yıkayın. Sıçan VIC kalsifikasyon çalışmaları için, hücre tek katmanlarını %5 Alizarin Red S solüsyonu ile boyayın, 20 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe sallayın. Daha sonra, her seferinde beş dakika boyunca damıtılmış suyla üç kez yıkayın.

Kalsiyum birikimini ölçmek için bir biyokimyasal kalsiyum tahlil kiti kullanın. Hafif çalkalama ile dört santigrat derecede 24 saat boyunca 0.6 molar hidroklorik asit kullanarak sülük kalsiyum iyonları. Süpernatanı hasat edin ve üreticinin yönergelerini izleyerek bir kalsiyum tahlil kiti kullanarak kalsiyum konsantrasyonunu ölçün.

Son olarak, kalsiyum konsantrasyonunu, metin protokolünde açıklandığı gibi toplam hücresel proteinin bir kısmı olarak hesaplayın. İzole edilen hücrelerin VIC fenotipi, immünofloresan, VIC belirteçleri, vimentin ve alfa düz kas aktini için araştırma yoluyla doğrulandı. Ek olarak, VIC büyüme düzenleyicisi olan doku büyüme faktörü beta-1 ve 2'nin ekspresyonu PCR analizi kullanılarak doğrulandı.

Sıçan VIC'lerinin endotel hücre belirteci CD 31 için negatif olduğunu doğrulamak için Western blot analizi de yapıldı ve köpek mitral VEC'leri pozitif kontrol olarak kullanıldı. Sıçan VIC'leri, patolojik hiperkalsemi ve hiperfosfatemi durumlarını taklit eden yüksek kalsiyum ve fosfat seviyelerine maruz bırakıldı. Hidroklorik asit liçini takiben kalsiyum seviyelerinin kolorimetrik tayini ve kalsiyum birikimi için Alizarin Kırmızı boyama ile belirlendiği gibi, VIC'lerin kalsiyum ve fosfatın neden olduğu kalsifikasyon ile muamelesi.

VIC'lerin kalsiyum ve fosfat ile tedavisi, osteojenik belirteçler MSX2, ALPL ve PHOSPHO1'nin mRNA ekspresyonunda önemli bir artışa neden olmuştur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, 18 valf broşürü için sindirim hariç, bir ila iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, diseksiyon ve sindirim sırasında steriliteyi sağlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, primer sıçan VIC'lerinin nasıl izole edileceğini ve bunları VIC kalsifikasyonunun arkasındaki mekanizmaları araştırmak için nasıl kullanacağınızı iyi anlamalısınız. Bu prosedürü takiben, VIC fizyolojisini ve davranışını incelemek için akış sitometrisi ve mikroskopi analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kardiyovasküler araştırma alanındaki araştırmacıların, sıçan modelini kullanarak insanlarda aort kapak sınıflandırmalarının mekanizmalarını keşfetmelerinin önünü açabilir.