Name: Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Öğrenin, glioblastoma kök hücrelerinde astroglial farklılaşmayı teşvik eden küçük molekülleri yüksek verimli tarama ile nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem, kanser kök hücre biyolojisinde yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser NIH R01CA187780 tarafından kısmen destekleniyor.

Not: Astroglial ve nöronal lentivirus muhabir sistemleri önceden, konsantre lentiviral hazırlıkları satın alındı. Akış Sitometresi tekniği temel bilgisi gereklidir. Ayrıca, bu iletişim kuralı tam kullanımı için kullanıcı Akış Sitometresi (96-şey plakaları örnek kaynağı olarak kabul eder) yüksek üretilen iş kapasitesi ile erişiminiz olmalıdır.
1. lentiviral transkripsiyon muhabir sistemi
Not: tüm akış sitometrik analizleri ebeveyn, Sigara transduced, hücreleri veya vektör transduced (floresan olmayan) hücreleri temel Floresans oluşturmak için kullanın. Tüm adımlar için mekanik toz çağrıldığı nazik ol da, unutmayın. Sert toz kırılgan GSCs önemli sayıda öldürmek ve Akış Sitometresi sonuçları etkiler.
<ol><li>6-multiwell plaka tam sinir kök hücre büyüme ortamının 2 mL 1 x 106 hücrelerde plaka.</li>
	<li>Hücreleri enfeksiyon (moi) 5'e eşit bir çokluğu, lentivirus muhabir ekleyerek transduce.</li>
	<li>Polybrene 8 µg/mL nihai bir konsantrasyon için 2 µL ekleyin.</li>
	<li>37 ° C ve % 5 CO2 hücreleri gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, ilişkisiz virüs kaldırmak için büyüme orta yerine. Plaka da kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 geri yerleştirin ve 24 saat kuluçkaya.</li>
	<li>Hasat toplam hacminin 0.5 mL; spin aşağı 15 mL konik tüp içinde oda sıcaklığında 5 min için 360 x g hücreleri ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. 0.5 mL taze nöral kök hücre büyüme ortamının kalan hücrelere ekleme ve plaka kuluçka makinesi sürekli genişleme için geri dönün.</li>
	<li>Ayrılma reaktif 200 µL ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya</li>
	<li>Hücreleri yukarı ve aşağı yavaşça pipetting tarafından ayırmak. Not: Sert toz GSCs önemli öldürülmesi neden olabilir, tam ayrılma genellikle 20 - 30 kere sonra elde edilir.</li>
	<li>Hücre eki veya toplama en aza indirmek için 800 µL, Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) 1 ml nihai bir birim için ekleyin.</li>
	<li>Her hücre süspansiyon, 200 µL 96-multiwell plaka bir kuyu için transfer.</li>
	<li>Bu yordam için benchtop Akış Sitometresi uyarma için mavi lazer yeşil flüoresan protein algılama yeteneği ile techiz 96-şey plaka özelliği ile kullanın. Akış sitometrik analizi ile en az 10.000 hücrelerin her satın alma için gerçekleştirin.</li>
	<li>GFP pozitif hücre yüzdesi Akış Sitometresi tarafından belirler.</li>
</ol>2. subclone seçim, genişleme ve doğrulama
<ol><li>Plaka hücrelerinde sinir kök hücre orta iyi bir 96-multiwell plaka başına 0,7 hücre yoğunluğu, 100 µL.</li>
	<li>37 ° C ve % 5 CO211 gün kültür klonlar. Bu adım çok hücre türü bağımlı olan ve büyük olasılıkla kullanılan hücre satır tabanlı bir ayarlama gerektirir. Genel bir kural olarak, bir küre çapı ≥ 100 µm neurospheres içinde klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar GSCs varlığı iyi bir göstergesidir.</li>
	<li>FITC filtre ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanarak, hücrelerin % ~ 1-5 GFP pozitif nerede tek bir neurosphere içeren wells işaretleyin. Not: GFP pozitif hücreler tam yüzdesini belirleme bu noktada çok kritik değildir. Her subclones biri daha sonra Akış Sitometresi tarafından değerlendirilecektir. Bu adımı toplam azaltmak için gerçekleştirilen farklılaşmamış klonlar tarafından kaynaklanan neurospheres vurgu ile çözümlenmesi için sayısı, GFAP'nin negatif, GSC.</li>
	<li>Hücreleri tarafından Akış Sitometresi Analizi için yeterli sayıda kadar seçili muhabir klonlar genişletin. 6-multiwell tabakta ≤ 1.5x105 hücre/mL içeren bir alt Konfluent kuyu hücreleri yeterli sayıda sağlamalıdır. Not: Kullanılabilir 17yalıtım ve GSCs genişlemesi için detaylı bir işlemdir.</li>
</ol>3. Akış Sitometresi tarafından GFAP:GFP ifade tespiti
<ol><li>Bir aliquot hücre (0.5 mL) her muhabir klon ve sigara transduced denetimlerden GFP pozitif hücreler tam yüzdesini belirlemek için hasat. ~ 1-%5 GFP pozitif hücre içeriyor muhabir klonlar düşünüyor.</li>
	<li>Senaryo Özeti 360 x g oda sıcaklığında 5 min için spin ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın.</li>
	<li>Her Pelet için hücre ayrılma reaktif 200 µL ekleyin ve 37 ° C'ye ayarla bir su banyosu tüplerde kuluçkaya</li>
	<li>Hücreleri nazikçe bir tek hücre süspansiyon (genellikle arasında 20'ye 30 kere) elde etmek için triturate.</li>
	<li>Hücre eki veya toplama en aza indirmek için 1 mL son bir hacim için 800 µL HBSS ekleyin.</li>
	<li>İyi bir 96-multiwell plaka başına 200 µL her hücre süspansiyon aktarın.</li>
	<li>Bu yordam için benchtop Akış Sitometresi 96-şey plaka özelliği ile kullanın. Akış sitometrik analizi ile en az 10.000 hücrelerin her satın alma için gerçekleştirin.</li>
</ol>4. ELDA kendini yenileme tahlil klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar kapasitesini değerlendirmek için
Not: denetimler için lentivirus transduced hücreleri, her iki ebeveyn, Sigara transduced, aynı zamanda GFP ifade GSC farklılaşma muhabir hatları içinden olduklarını özgün GSC kültürler için göreli klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar potansiyelini belirlemek için kullanılmalıdır türetilmiş.
<ol><li>Farklılaşma-muhabir subclones tek hücreli süspansiyonlar içine yukarıda açıklandığı gibi ayırmak.</li>
	<li>İyi başına 5 ila 500 hücreleri arasında değişen hücre yoğunluğu, tam sinir kök hücre büyüme ortamının 100 µL 96-multiwell levha plaka hücrelerde.</li>
	<li>Hücreleri CO237 ° C ve % 5, 9-11 gün kuluçkaya.</li>
	<li>Neurospheres hafif bir mikroskop altında doğrudan görselleştirme tarafından olumlu wells puan. Bir de "en azından bir tek büyük neurosphere içeriyorsa, pozitif" düşünülmelidir.</li>
	<li>Veri takın: Toplam analiz wells ve olumlu kuyu http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html kullanılabilir ELDA çevrimiçi arabirimini kullanarak sayısı.</li>
</ol>5. uyuşturucu Kütüphane seyreltme hazırlık
<ol><li>Depolama-80 ° C'de kitaplık plakaları kaldırmak için kapak alüminyum folyo ile (ışığa duyarlı bileşikler korumak). Yaklaşık 30 dakika bir saat oda sıcaklığında erimek.</li>
	<li>12 kanallı çok kanallı pipettor Kütüphane bileşenleri tam sinir kök hücre Orta 0.2 mm sulandırmak için kullanın. DMSO büyüme orta % 10 oranında seyreltin Not: DMSO son konsantrasyonu hücrelere eklendiğinde % 0,1 olmalıdır. DMSO daha yüksek bir konsantrasyon kültür toksisite neden olabilir. Bu nedenle, bu, daha önce kullanılan hücre doğrultusunda DMSO duyarlılık test etmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>Her plaka (sütun 1 ve 12; sol ve sağ sütunda bulunan hücreleri tedavi için araç kontrol DMSO kullanın Kuyu A ile H).</li>
	<li>Alüminyum folyo ile seyreltilmiş Kütüphane kuruyucu ve orijinal kitaplık plakaları-80 ° C dondurucu uzun süreli depolama için geri dönün.</li>
</ol>6. uyuşturucu testi
Not: DMSO tedavi hücreleri temel Floresans ayarla ve geçişi ayarlamak için kullanılır.
<ol><li>5 x 103 hücreleri 99 µL tam sinir kök hücre büyüme ortamının bir 96-multiwell plaka plaka.</li>
	<li>12 kanallı çok kanallı pipettor kullanarak, hücreleri DMSO (kontrol) veya 2 µM (0.2 mM ilaç hücre süspansiyon, 99 µL içine 1 µL) son bir konsantrasyon, seyreltilmiş Kütüphane bileşenleri ile tedavi. Tabaklar CO237 ° C ve %5 72 h için kuluçkaya.</li>
	<li>12 kanallı çok kanallı pipettor kullanarak her şey için hücre ayrılma reaktif 150 µL ekleyin ve 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Hücreleri tek hücre süspansiyon (genellikle arasında 20'ye 30 kere) elde kadar yavaşça 12 kanallı çok kanallı pipettor ile triturating tarafından ayırmak. Neurospheres tamamen ayırmak için gereken süreyi GSC satırları arasında değişir. Önerilen hücre ayrılma reaktif (malzemeleri görmek) güvenli ve kuluçka en fazla 45 dakika için test birden çok GSC satırlarında canlılığı üzerinde bir etkisi vardı iken, tarama kullanılmak üzere her GSC satır için doğrulayın. Not: Her son hacim de yaklaşık 250 µL (hücre süspansiyon, 100 µL + hücre ayrılma reaktif 150 µL) olmalıdır.</li>
	<li>GFAP:GFP muhabir Akış Sitometresi tarafından ifade hücreleri yüzdesini belirleyin. Standart gating stratejiyi kullanın. İlk olarak, hücre boyutunu ve canlılığı genel bir fikir edinmek için ön ve yan scatter arsa. Sonra bir kapı üzerinde uygun tek hücreli nüfus yer. Yeşil floresan (eGFP) belirlenecektir nüfus bu. Herhangi bir bileşik bir artış yüzde GFP pozitif sonuçlar üç standart sapmalar tarafından üzerinde kontrol hücreleri (DMSO tedavi) olumlu "hit" olarak kabul edilir Bu eşik belirli uygulama ve istenen sıkılık göre ayarlanmalıdır. Not: yüksek işlem hacmi için ekran tek GSC muhabir subclone kullanılması önerilir. Hit kimlik her ek muhabir subclones aynı GSC satırından karşı doğrulanması. Gerçek sayısı için güven artırmak için de tavsiye bileşikler muhabir subclones karşı test farklı GSC neurospheres satırları izole.</li>
</ol>

<ol><li>Maher, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+glioma%3A+genetics+and+biology+of+a+grave+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).</li>
<li>Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+maintenance+in+glioblastoma%3A+a+social+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network.</a> Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Sul, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+gliomas%3A+new+translational+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Malignant gliomas: new translational therapies.</a> Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).</li>
<li>Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+promotes+medulloblastoma+survival+via+Bc%2FII%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II.</a> Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).</li>
<li>Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+inhibition+of+glioblastoma+xenograft+initiation+and+clonogenic+growth+following+in+vivo+Notch+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade.</a> Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).</li>
<li>Schreck, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+target+Hes1+directly+modulates+Gli1+expression+and+Hedgehog+signaling%3A+a+potential+mechanism+of+therapeutic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance.</a> Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).</li>
<li>Warrell, R. P. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+therapy+of+acute+promyelocytic+leukemia+with+tretinoin+%28all-trans-retinoic+acid%29%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid).</a> N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).</li>
<li>Piccirillo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+inhibit+the+tumorigenic+potential+of+human+brain+tumour-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells.</a> Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).</li>
<li>Bar, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopamine-mediated+hedgehog+pathway+inhibition+depletes+stem-like+cancer+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.</a> Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).</li>
<li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2FCD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).</li>
<li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+monocarboxylate+transporter-4+depletes+stem-like+glioblastoma+cells+and+inhibits+HIF+transcriptional+response+in+a+lactate-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner.</a> Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEB1+Promotes+Invasion+in+Human+Fetal+Neural+Stem+Cells+and+Hypoxic+Glioma+Neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres.</a> Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).</li>
<li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).</li>
<li>Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atracurium+Besylate+and+other+neuromuscular+blocking+agents+promote+astroglial+differentiation+and+deplete+glioblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Öncelikle onları define işaretleri üzerinde duruldu GSCs önceki çalışmaların en, bu çalışmada geriye doğru yaklaşım almaya karar verdik. Öncelikle GSCs (örneğin, astroglial ve nöronal işaretleri ifade hücreleri) tarafından oluşturulan farklılaştırılmış ettiklerinizden odaklanmak. Burada eleme sistemi, insan GFAP'nin organizatörü bağımlı ifade GFP ve üzerinde temel alan bir hücre tabanlı yüksek üretilen iş ilaç kullanımını göstermektedir. Neurosphere hasta kaynaklı glioblastoma hücre hatları kullanan tüm deneyler yapıldı....

Son yıllarda yapılan çalışmalarda tümör küçük bir nüfus içerir göstermiştir kanser kök hücreleri (CSCs) veya tümör başlatılıyor hücreleri, hücrelerinin tümör ilerleme, metastaz ve direnç kemoterapi ve radyo terapi 1, sorumlu olan 2. kanser kök hücreleri ve onların daha farklılaştırılmış ettiklerinizden içinde tümör varlığı intratumoral heterojenlik teşvik önemli bir faktör olarak kabul edilir ve böylece kanser3tedavisinde büyük bir engel temsil eder. Tümör hücre sıradüzeni, kanser kök hücre teorisi tarafından sağlanan kanserleri 4tedavisi için yeni strateji geliştirme ilham kaynağı olmuştur. Kanser kök hücreleri hedefleme için bir yaklaşım tanımlamak ve etkilenen organ embriyonik gelişim sırasında gerekli olduğu bilinmektedir sinyal yolları inhibe etmektir. Nitekim, biz ve diğerleri daha önce birden fazla kağıtları sinirsel kök hücre ile ilgili sinyal yollar Sonic Kirpi ve çentik glioblastoma5,6,7devam eden gereksinimini açıklayan yayımlanmıştır. Bu eser birkaç GBM klinik deneyler için gerekçe güçlendirilerek yardımcı oldu. Kanser kök hücreleri hedefleme için ikinci bir yaklaşım kendi farklılaşma teşvik etmektir. Bu yaklaşım retinoik asit (ATRA, A vitamini analog) ile akut promyelötik lösemi tedavisinde preklinik ve klinik çalışmalar çok olumlu sonuçlar nedeniyle destek aldı. Burada ATRA olgunlaşma blok kaldırmak ve kanser hücre farklılaşması8teşvik bulundu. Daha yakın zamanlarda, Piccirillo ve meslektaşları zarif BMP-4 GSC farklılaşma astrocytes önemli anti-GBM etkileri vitro ve in vivo9içine teşvik göstermiştir.
Çalışmada için gerekçe GSCs hedefleme için "tersine mühendisliği" yaklaşımı temel alır. GBM ve kanser işaretlerinden biri olan zavallı farklılaşma ile mevcut geniş heterojenite göz önüne alındığında, biz daha olumlu bir fenotip - farklılaşma içine bir astrocyte gibi devlet teşvik istedi. Burada, biz önceden bilgi sahibi bir belirli tümör numune GSCs korumak, ancak oldukça istenen fenotip (örneğin GFAP'nin pozitifliği) elde etmek amacı sinyal yolları yok.
Bu rapor GSC farklılaşma muhabir-satırlarından GSC zenginleştirilmiş kültürlerin iletim GSC klonal seçim kurmak için kullanılan yordamları açıklar. Kullanılan glioblastoma neurosphere çizgiler Laboratuvarı Profesör Angelo Vescovi hastaların hastane San Raffaele - Milano, İtalya, birincil glioblastoma tanısı ile kuruldu. Bu satırları çeşitli yayınları 6,10,11,12,13,14' te kapsamlı bir şekilde inceledik. Onların laboratuvarda bu teknikleri uygulamak için ilgi duyan bireyler muhabir kanser kök hücre kendini yenileme kapasite çalışmaya planladıkları hücrelerdeki alaka düzeyi belirlemek önerilir (Bu herhangi bir muhabir için geçerlidir). Detaylı bir iletişim kuralı alanında kabul vitro klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar deneyleri biri için bu15,16gerçekleştirmek için sağlanmıştır. Son olarak, farklılaşma muhabir satırlarında bir Akış Sitometresi dayalı uyuşturucu testi kullanımını açıklayan ayrıntılı bir protokol vasıl belgili tanımlık son sağlanır. Belirtmek gerekirse benzer şekilde burada, açıklanan astroglial farklılaşma sistemi biz başarıyla kurulan ve bir MAP2:GFP (Nöronal Farklılaşma) muhabiri entegre GSC muhabir satırları doğrulanmış. Bu nedenle, bu yöntemleri tarif kağıt çeşitli hücre soy içine hücresel başkalaşım çalışmaya uygulanan.
Bu rapordaki rakamlar bazıları son yayında bulunabilir: "Atracurium besilat ve diğer nöromüsküler engelleyici ajanlar astroglial farklılaşma teşvik ve glioblastoma kök hücre18tüketmek.

<table><tbody><tr><td>ESGRO Complete Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SF006</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>İnsan GFAP Farklılaşma Raportörü (pGreenZeo, Virüs)</td> <td>SBI (System Biosciences)</td> <td>SR10015VA-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml steril tek kullanımlık reaktif rezervuarlar</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Biolite T25 cm&sup2; Şişe Bacalı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130189</td><td></td></tr><tr><td>Biolite T75 cm&sup2; Şişe Bacalı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Santrifüj tüpleri</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Çok Kanallı Pipet, 12 Kanallı, 0.5 - 20uL</td><td>VistaLab Technologies</td><td>1060-0020</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Çok Kanallı Pipet, 12 Kanallı, 5-250uL</td><td>VistaLab Teknolojiler</td><td>1060-0250</td><td></td></tr><tr><td>Çoklu 12 kanallı pipet uçları 25 &mu; l</td><td>VistaLab Technologies</td><td>4060-1002</td><td></td></tr><tr><td>Çoklu 12 kanallı pipet uçları 250 &mu; l</td><td>VistaLab Technologies</td><td>4060-9025</td><td></td></tr><tr><td>Guava easyCyte 5HT Masaüstü Akış Sitometresi</td><td>EMD Millipore</td><td>0500-4005</td><td></td></tr><tr><td>NIH Klinik Koleksiyonları 1 ve 2 küçük molekül kütüphanesi</td><td>Evotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>><güçlü> Nöral kök hücre ortamının hazırlanması için (500 mL)< / güçlü ></td><td></td><td></td> <td>< güçlü > Nihai konsantrasyon< / güçlü ></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBio.com</td><td>A-421-250</td>% <td>0.20</td></tr> <tr><td>DMEM / F12 10X</td><td>Corning</td><td>90-091-PB</td><td>1X</td></tr><tr><td>Heparin sodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>0.0002%</td></tr> <tr><td>HEPES 1M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4036</td><td>5.4 mM</td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS -G) (100X)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>41400-045</td><td>1X</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td>14.5 mM</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) 100X</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1X</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td>16 nM</td></tr><tr><td>Putresin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5780</td><td>4.8 ve mikro; M</td></tr><tr><td>Basic FGF (FGF2), İnsan</td><td>GoldBio</td><td>1140-02-50</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF, İnsan</td><td>GoldBio</td><td>1150-04-100</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Şişe Üstü Filtre, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind</td><td>Corning</td><td>431160</td><td>Sterilize ortamı filtrelemek için kullanın</td></tr></tbody></table>

akış sitometresi tabanlı uyuşturucu glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Glioblastoma (GBM) yaklaşık 14.000 ölümlerin her yıl ABD tek başına neden erişkinlerde en sık görülen ve en ölümcül birincil beyin tümörü olduğunu. Medyan sağkalım tanı takip maksimal cerrahi rezeksiyon, radyasyon ve temozolomide kemoterapi ile 15 aydan daha az oldu. Daha etkili GBM tedaviler geliştirmede içsel sorunları giderek açık olmuştur ve onun inatçı invasiveness, dayanıklılığı, standart tedaviler, genetik karmaşıklığı ve moleküler uyum ve GBM altgrupları şunlardır normal kök hücre, fenotipik benzerlikleri hücrelerle glioblastoma kök hücreler (GSCs) burada anılacaktır. GSCs tümör büyüme ve ilerleme için gerekli olduğundan, farklılaşma tabanlı terapisi bu tedavi edilemez neoplazmlar için uygun tedavi yöntemi temsil eder.
Aşağıdaki iletişim kuralı çeşitli GSC astroglial farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlaması amaçlı platform eleme yüksek üretilen iş kurmak için yordamlar açıklanır. Sistemin özünde gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) ayrımında muhabir yapıdır. İletişim kuralı aşağıdaki genel yordamlar vardır: (1) GSC farklılaşma muhabir satırları; kurulması (2) doğrulama sınama?; / muhabir alaka GSC öz-yenileme/klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar kapasitesi ve (3) yüksek kapasiteli Akış Sitometresi uyuşturucu tarama tabanlı.
Tarama platform GSCs farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlamak için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlar. Ayrıca, kitaplıkları FDA tarafından onaylanan ilaçların kullanımı daha hızlı güvenilemez ajanların tanımlanması için bir potansiyele sahiptir. Ayrıca, kanser kök hücre farklılaşması teşvik terapiler sinerjik hedef ve öncelikle daha fazla farklı kanser hücrelerinin ortadan kaldırmak için gösterilen geçerli "bakım standart" terapileri ile çalışması öngörülür.

Üç bağımsız hasta kaynaklı neurospheres çizgi erimiş yeşil-floresan protein (GFP) içinde-çerçevesi için bir Zeocin direnç kaset ile kodlama lentivirus astroglial muhabir ile transduced ve insan GFAP'nin organizatörü unsuru ( tahrik Şekil 1). Sonraki bireysel klonlar 96 iyi plaka (Şekil 2) bir kuyu başına 0,7 hücre kaplama tarafından izole, bu akış sitometrik belirlenmesi GFP (şekil 3) ifade hücre yüz...

Bir verimli tarama Protokolü glioblastoma kök hücreler (GSCs) astroglial farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için sunulmaktadır. Tahlil sayede gelişmiş GFP (eGFP) ifade insan GFAP'nin düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir bir kök hücre farklılaşması muhabir temel alır.

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Bu prosedürün genel amacı, glioblastoma kök hücrelerinde astroglial farklılaşmayı teşvik eden ajanlar için küçük molekül kütüphanelerini taramaktır. Bu yöntem, glioblastoma kök hücrelerinin farklılaşmamış durumda tutulması için hangi sinyal yolaklarının gerekli olduğu gibi, kanser kök hücresi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin doğru uygulanması, glioblastoma kök hücre farklılaşmasını teşvik eden küçük moleküllerin kolayca tanımlanmasını sağlar.Bu tekniğin önemi, glioblastoma kök hücrelerinin yüzdesini azaltmanın nüksetme olasılığını düşürebileceği nedeniyle Ehlers-Danlos glioblastoma tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, diğer raporlayıcı konstrüktlar kullanılarak diğer hücre soyuna farklılaşmayı belirlemek için de uygulanabilir. Çalışmamız, glioma kök hücrelerini farklılaşmaya zorlayan ajanları taramak için yüksek kapasiteli bir yaklaşım geliştiren ilk rapordur.Hastalardan türetilen kanser hücrelerinde lentivirüs partikülleriyle çalışmak son derece tehlikeli olabilir. Bu nedenle, kan yoluyla bulaşan patojenlerle çalışma konusundaki standart prosedürlere her zaman uyulmalıdır. Başlamak için, altı kuyucuklu bir plakaya, iki mililitre tam nör

flow-cytometry-based-drug-screening-system-for-identification-small

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video protokol hücre bölünmesi sıklığına göre insan glioblastoma hücreleri farklı alt-popülasyonlarının belirlenmesi ve ayrılması için floresan boya carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) uygulamasını gösterir.

Karboksi Flöresein sukkinimidil ester (KAKE) Kullanarak İnsan Glioblastoma Yavaş-bölme Hücreleri Tanımlama ve İzolasyonu

Bu videoda, ilaçların hassas ve hızlı taranması için biyolüminesans testinin faydasını vurgulayan bir yöntemi açıklıyoruz. Bu ilaçlar, etki şekillerindeki sinerjizmi değerlendirmek için tek başına veya kombinasyon halinde test edilebilir.

Hücresel Biyolüminesans Tabanlı Test: Kombinatoryal İlaç Taraması için Yüksek Verimli Bir Yöntem

Bu video, glioblastoma kök hücrelerinin (GSC'ler) astrogliaya farklılaşmasını tanımlamak için bir glioblastoma kök hücre raportör hattı oluşturma tekniğini göstermektedir. GSC'lerin tohumlanması, bunların GFP'yi kodlayan bir lentivirüs ile dönüştürülmesi ve akış sitometrisi yoluyla GFP raportör ekspresyonunun belirlenmesi ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Bir glioblastoma kök hücre farklılaşma raportör hattı oluşturmak için bir Lentiviral transkripsiyonel raportör sistemi

Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Klinik öncesi testlerden insan denemelerine geçiş yapan yeni ilaç hedeflerinin belirlenmesi bilimsel bir önceliktir. Bu amaçla, burada, gen tükenmesinin kanser hücre hattı sferoidleri üzerindeki etkisini incelemek için işlevsel bir genomik yaklaşımı tanımlıyoruz, bu da insan kanserlerini in vivo olarak daha uygun bir şekilde modelliyor.

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Glioma kök hücreleri (GSC' ler), en yaygın ve yıkıcı primer beyin tümörü olan glioblastomda (GBM) tümör başlatma, anjiogenez ve ilaç direncinde önemli roller oynayan kanser hücrelerinin küçük bir kısmıdır. GSC'lerin varlığı GBM'yi hedeflenen ajanların çoğu için çok refrakter hale getirir, bu nedenle potansiyel etkili kombinasyon terapötiklerini tanımlamak için yüksek verimli tarama yöntemleri gerekir. Protokol, sinerjik etkileşim ile potansiyel kombinasyon tedavisi için hızlı tarama sağlamak...

Hasta Kaynaklı Glioma Kök Hücreleri Kullanarak GBM için Potansiyel Kombinasyon Tedavisini Belirlemek için Hızlı Tarama İş Akışı

Burada, üç boyutlu (3D) glioma sferoidlerini ve hücre dışı akı analizi yoluyla görüntülemeye dayalı normalizasyonu entegre eden bir metabolik profilleme platformu oluşturuyoruz. Bu yaklaşım, ilaç tedavilerine tümör metabolik yanıtlarının daha doğru değerlendirilmesini sağlar ve potansiyel direnç mekanizmaları hakkında bilgi sağlar.

İlaç Taraması için Üç Boyutlu Beyin Tümörü Sferoidlerinin Metabolik Profillemesindeki Gelişmeler

Yeni teşhis edilen ve tekrarlayan tümörlerden üretilen hastadan türetilen manyetik gliomakürleri kullanarak 3D glioblastoma göç modeli sunuyoruz. Bu platform, hastaya özgü göç dinamiklerinin görselleştirilmesine ve terapötik etkinliğin değerlendirilmesine olanak tanır. Test, protein lokalizasyonu ve ifade desenlerini değerlendirmek için göç sonrası çoklu eklenebilir.

Hipoksik Koşullarda Manyetik Nanopartikül Aracılı Sferoid Lokalizasyon ile Tekrarlanabilir 3D Glioblastoma Göç Testi

Öğrenin, glioblastoma kök hücrelerinde astroglial farklılaşmayı teşvik eden küçük molekülleri yüksek verimli tarama ile nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem, kanser kök hücre biyolojisinde yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi (Video) | JoVE Journal

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Daha fazla video keşfet