Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Bu prosedürün genel amacı, glioblastoma kök hücrelerinde astrogliyal farklılaşmayı teşvik eden ajanlar için küçük molekül kütüphanelerini taramaktır. Bu yöntem, glioblastoma kök hücrelerini farklılaşmamış durumda tutmak için gerekli olan sinyal yollarının neler olduğu gibi kanser kök hücre alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin uygun şekilde uygulanması, glioblastoma kök hücre farklılaşmasını destekleyen küçük moleküllerin doğrudan tanımlanmasına izin verir.

Bu tekniğin anlamı, Ehlers-Danlos glioblastoma tedavisine kadar uzanır, çünkü glioblastoma kök hücrelerinin yüzdesini azaltmak nüks olasılığını azaltabilir. Bu yöntem, diğer raportör yapıları kullanılarak diğer hücre soylarına farklılaşmayı ayarlamak için de uygulanabilir. Raporumuz, glioma kök hücrelerini farklılaşmaya zorlayan ajanları taramak için yüksek verimli bir yaklaşım oluşturan ilk rapordur.

Hastalardan elde edilen kanser hücrelerinde lentivirüs parçacıkları ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir. Bu nedenle, kan yoluyla bulaşan patojenlerle çalışmak için standart prosedür her zaman izlenmelidir. Başlamak için, altı oyuklu bir plakada iki mililitre tam nöral kök hücre büyüme ortamında bir milyon glioblastoma kök hücresi veya GSC'yi tohumlayın.

Daha sonra, hücreleri lentivirüs raportörü ile beşe eşit bir enfeksiyon çokluğunda transdüksiyon yapın. Hücre ve virüs karışımına, nihai konsantrasyon mililitre başına sekiz mikrogram olacak şekilde iki mikrolitre polibren ekleyin ve hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bağlanmamış virüsü çıkarmak için büyüme ortamını değiştirin.

Ve hücreleri beş dakika boyunca 360 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra orta ve plaka hücrelerini altı oyuklu bir plakaya dikkatlice aspire edin. Ve hücreleri 24 saat boyunca inkübe etmeye devam edin.

Toplam kültür hacminin 0,5 mililitresini hasat edin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 360 kez G'de santrifüjleme ile pelet hücreleri. Hücreleri 0.5 mililitre taze nöral kök hücre büyüme ortamında yeniden süspanse edin.

En az 72 saat genişlemeye izin vermek için plakayı inkübatöre geri yerleştirin. 200 mikrolitre ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda beş dakika inkübe edin. Hafifçe yukarı ve aşağı pippetleyerek hücreleri ayırın.

Ayrışmış hücrelere, minimum hücre bağlanmasını veya agregasyonunu sağlamak için 800 mikrolitre HBSS ekleyin. Daha sonra, her hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini 96 çok kuyulu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Akış sitometrisi ile yeşil floresan proteini eksprese eden hücrelerin yüzdesini belirleyin.

Her alımda en az 10.000 canlı hücre kaydedin. Tüm akış sitometrik analizlerinde, temel floresan oluşturmak için ebeveyn transdüksiyonsuz hücreler veya vektör transdüksiyonlu floresan olmayan hücreler kullanın. Tek tek alt klonları seçmek ve genişletmek için, 96 oyuklu bir plakada 100 mikrolitre nöral kök hücre ortamında oyuk başına 0.7 hücre yoğunluğunda tohum hücreleri.

Bu klonları 11 gün boyunca kültürde tutun. Çapı 100 mikrondan büyük olan nörosferlere dikkat edin. Nötrosferin kendi kendini yenileyen bir glioblastoma kök hücresinden kaynaklanıp kaynaklanmadığını geriye dönük olarak belirlemek için bu kesme boyutunu daha önce belirlemiştik.

Bu kesme boyutu, farklı glioblastoma hücre modelleriyle çalışırken optimizasyona ihtiyaç duyabilir. Hücreleri bir FITC filtresi ile donatılmış bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin ve hücrelerin yaklaşık% 1 ila% 5'inin GFP pozitif olduğu tek bir nörosfer içeren kuyuları işaretleyin. İşaretledikten sonra, akış sitometrisi analizi için yeterli sayıda hücre mevcut olana kadar tek tek klonları genişletin.

Raportör klonların %1 ila %5 oranında GFP pozitif hücre içerdiğini varsayarsak, GFP pozitif hücrelerin tam yüzdesini belirlemek için eşit miktarda dönüştürülmemiş kontrol hücresi ile birlikte her klondan 0,5 mililitre hasat edin. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 360 kez G'de peletledikten sonra, süpernatanı aspire edin. Her pelete 200 mikrolitre ayrışma reaktifi ekleyin ve tüpleri 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri yaklaşık 20 ila 30 kez ezin. Ardından, minimum hücre bağlanmasını veya toplanmasını sağlamak için 800 mikrolitre HBSS ekleyin. Şimdi her hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini 96 çok kuyulu bir plakanın kuyularına aktarın.

Son olarak, her edinimde en az 10.000 canlı hücre kaydederek akış sitometrisi yapın. Klonojenik kapasiteyi değerlendirmek için, hücreleri yaklaşık 20 ila 30 kez tritüre ederek farklılaşma raportör alt klonlarının tek hücreli süspansiyonlarını hazırlayın. Daha sonra bu hücreleri, 96 çok kuyulu plakalarda kuyu başına yaklaşık beş ila 500 hücre yoğunluğunda 100 mikrolitre tam nöral kök hücre büyüme ortamında plakalayın.

Bu hücreleri dokuz ila 11 gün boyunca kültürde tutun. Işık mikroskobu altında nörosferleri arayın. En az bir tek büyük nörosfer içeren bir kuyu pozitif olarak kabul edilir.

Ebeveyn transdüksiyonsuz hücreler ve GFP pozitif lentivirüs ile transdüksiyonlu hücreler kontrol girişi olarak dikkate alındığında, analiz edilen toplam kuyucuklar ve ELDA çevrimiçi arayüzündeki pozitif hücre sayısı dikkate alınmıştır. Taramaya başlamak için, 96 oyuklu bir plakada 99 mikrolitre tam nöral kök hücre büyüme ortamında 5000 hücreyi plakalayın. Daha sonra 12 kanallı bir pipetleyici ile hücreleri iki mikromolar nihai seyreltilmiş kütüphane bileşiği konsantrasyonu veya DMSO kontrolü ile tedavi edin.

Hücreleri 72 saat inkübe edin. Şimdi her bir oyuğa 12 kanallı bir pipetör kullanarak 150 mikrolitre hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar 12 kanallı bir pipetleyici kullanarak her bir oyuktaki hücreleri yaklaşık 20 ila 30 kez nazikçe ezin.

Şimdi akış sitometrisi yapın ve GFAP:GFP raportörünü ifade eden hücrelerin yüzdesini belirleyin. İlk olarak, ön ve yan saçılmalardan hücre boyutunu ve canlılığını belirleyin ve canlı hücre popülasyonunu kapılayın. Daha sonra canlı hücre popülasyonu içindeki GFP pozitif hücreleri belirleyin.

GFP-pozitif hücrelerin yüzdesinin kontrollere göre üç standart sapma ile artması, kullanıcının sıkılık tercihine uyacak şekilde ayarlanabilen pozitif bir isabet olarak kabul edilir. Düşük ve yüksek GFAP:GFP seviyelerini ifade eden HSR-GBM1 GSC alt klonlarının temsili görüntüleri gösterilmektedir. GFAP:GFP ekspresyonu için pozitif olan alt klonlar, hasta kaynaklı nörosfer hattı için akış sitometrisi ile seçildi.

Burada, düşük GFAP:GFP, klondaki hücrelerin %5'inden daha azının GFP pozitif olduğunu gösterirken, yüksek GFAP:GFP, klondaki hücrelerin %75'inden fazlasının GFP pozitif olduğunu gösterir. Bu sonuçlar, GFAP-düşük alt klonların in vitro kendini yenileme kapasitesinin, ELDA tarafından belirlenen GFAP-yüksek muadillerinden daha yüksek olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, GH alt klonları, GL alt klonlarından daha farklıdır.

Son olarak, GSC'lerde astrogliyal farklılaşmayı indükleyebilen ajanları belirlemek için ilaç kütüphaneleri tarandı. 12 ilacın GFAP: GFP raportörünü eksprese eden hücrelerin yüzdesini önemli ölçüde arttırdığı bulundu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa birkaç hafta içinde yapılabilir.

Bu işlemi takiben, seçici ilaçların in vitro hücresel proliferasyon ve klonojenite üzerine etkisi ve in vivo olarak tümörjenite gibi ek soruları yanıtlamak için alamarBlue testi, yarı katı ortamda klonojenik test, yan veya intrakraniyal ksenograf enjeksiyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, glioblastoma kök hücrelerinde astroglial farklılaşmayı indükleyebilen bileşiklerin nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.