Name: İnsan beyninin Formalin sabit bir doku arka plan Floresans ayirt mikroskopi için basit ortadan kaldırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 31 s
Description: Öğrenin, insan beyni dokularında otofloresansı LED fotobeyazlatma ile nasıl ortadan kaldırılır. Bu maliyet etkin yöntem, immünofloresans mikroskobisinde arka plan gürültüsünü azaltarak görüntü kalitesini artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma tamamen veya kısmen Kanada Konsorsiyumu ateş ve yaşlanma (CCNA), Kanada Enstitüsü, Sağlık Araştırma (CIHR), Kanada (ALS Kanada) ALS Derneği ve Alzheimer Derneği Kanada (ASC) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Sultan Darvesh ve Andrew Reid bankadan deniz beyin dokusu FTLD beyin dokuları sağlamak için Milan Ganguly Spatio-Temporal hedefleme ve radyasyon amplifikasyon yanıt (STTARR) programı ve onun bağlı teşekkür etmek istiyorum Ajanslar gömme ve Hizmetleri ve gelişmiş optik mikroskobu tesisi (mikroskopi aletleri sağlamak için AOMF) kesit doku için finansman. Kevin Hadley el yazması kritik inceleme için teşekkür etti.

Not: Uluslararası Konferansı üzerinde uyumlaştırılması (Ich), Konsey için uluslararası kuruluşlar, tıbbi Bilimler (CIOMS) de dahil olmak üzere tanınan uluslararası standartlara uygun olarak sunulan çalışma gerçekleştirildi ve Helsinki Bildirgesi ilkeleri. İnsan dokusu kullanımı üniversite sağlık ağ araştırma Etik Kurulu onayı ile oldu. İnsan beyni örnekleri deniz beyin doku Bankası bir parçası olarak toplanmıştır. Toplanması sırasında tüm hasta Onam alındı.
 1. photobleaching cihazları ve çözümleri inşaat <ol><li>hazırla hisse senedi çözümleri.
	<ol><li>Hazırlamak 1 L / 1 x 8,77 g NaCl ve 6,06 g Tris eriterek tarafından hisse senedi Tris tamponlu tuz (1 x TBS) çözüm (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) temel GKD 2 O 800 mL ve pH HCl. Bring sesi 1 L ve basınçlı kap kullanarak 7.4 için ayarlamak. < / li > <li>% 10 (200 x hisse senedi) sodyum azid sodyum azid 10 ml GKD 2 O (%10, 200 x hisse senedi) 1 g çözülerek hazırlayın.</li>
	</ol></li> <li>1-3 standart ölçü slaytlarını tek 100 mm x 100 mm şeffaf, kare petri kabına bir slayt odası kullanın. Bir tek slayt odası için 200 x sodyum azid stokunun 0.25 mL % 0.05 azid TBS çözüm yapmak için 1 x TBS için 50 mL ekleyin. Dikey olarak ek slaytları işlemek için 2-3 slayt chambers yığını. Her oda için bir ek 50 mL azid TBS çözeltisi hazırlamak.</li>
	<li>Böyle bir lamba başlığında altında sığabilecek slayt chamber(s) yükseltmek için bir iskele oluşturmak.
	<ol><li>İçin bir 100 mm x 100 mm slayt odası, alt ve bir 100 x 100 mm x 30 mm plastik gıda konteyner kenarlarında açıklıklar kesmek ve konteyner tersine çevirin. Yan açıklıklar ve alt açıklıklı öyle ki ışık ışık kaynağından örnek odası engel olmadan ulaşır kadar büyük olduğundan emin olun bir LED ışık kaynağı uygun büyüklükte olduğundan emin olun.</li>
		<li>İskele artış kavrama iskele ve örnek odası/benchtop arasında Elektrik bandı uygulamak. Güvenli bir şekilde slayt odası ışık örnek ulaşmasını engelleyen olmadan yükseltir sürece iskele oluşturmak için alternatif herhangi bir malzeme kullanın.</li>
	</ol></li> <li>Tüm Difüzörler ve opak plastik doğrudan örnek (mümkünse) ulaşmasını LED ışık engel ve LED dizi yukarı doğru yönlendirmek masa lambası kaldırın. LED dizi yukarıda iskele ve slayt chamber(s) yerleştirin. Bir lamba ile esnek bir boyun için kolayca idare kullanın.</li>
	<li>Yapı yansıtıcı bir kubbe cihazları için slayt odası ve İskele alüminyum folyo ile karşılamak için büyük bir kutu içine astar tarafından kapsar. Kullanma a 1 mL pipet ucu kutu için tek bir oda ya da bir 150 x 150 mm x 150 mm karton kutu birden çok, dikey olarak üst üste Chambers'ı.</li>
</ol> 2. Photobleaching ön arıtma doku bölümlerinin Not: doku bölümü hazırlık doku ve fiksasyon ve kullanılan yöntemler katıştırma kaynağına bağlı olarak farklı olabilir. Burada, beyin dokusundan FTLD-T Olgusu (orbitofrontal gyri) ~ 2 gün içinde formalin, sukroz degrade çalıştırmak, Ekim gömülü ve bir cryostat kullanarak 10 µm kalınlığında bölümlerine kesmek için tespit edildi.
<ol><li>Bir 4 ºC soğuk oda, soğuk dolap veya buzdolabı, iskele altında lamba yönlendirmek ve örnek odası iskele üzerinde yerleştirin. 50 mL azid TBS çözeltisi örnek odanın içine dökün.</li>
	<li>Submerge doku bölümler standart cam mikroskop slaytlar azid TBS temiz forseps kullanarak içeren slayt odasına monte. Birden çok slayt için slaytları tek bir katmanda odasında yerleştirilir emin olmak.</li>
	<li>Aparatı ile yansıtıcı kubbe kapak, LED Lamba açmak ve 4 ºC, 48 h için kuluçkaya.</li>
</ol> 3. Ayirt fosforile tau DAPI counterstain ve Alexa 488 - ve ikincil antikorlar Texas kırmızı Birleşik kullanarak doku leke, ilk çözümleri antijen alma, permeabilization, engelleme ve ilköğretim için hazırlamak için <ol><li> antikor bağlama.
	<ol><li>Hazırlamak 500 mL antijen alma arabellek (10 mM sitrik asit, 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit, % 0.05 arası 20; pH 6.2) 0,92 g sitrik asit ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 500 mL GKD 2 O. ayarlama pH 0.37 g eriterek tarafından 6.2 NaOH ile için ve ara 20 0.25 mL ekleyin.</li>
		<li>500 mL % 0,025 hazırlamak Triton X-100 Triton X-100 0,125 mL 500 mL 1 ekleyerek TBS çözüm (TBS-Triton) TBS. x</li>
		<li>Hazırlık %1 sığır serum albumin (BSA) çözeltilerine 0.1 g 10 ml TBS. BSA eriterek tarafından TBS (BSA-TBS arabellek)</li>
		<li>Engelleyen bir çözüm için 1,8 mL %1 0.2 mL normal keçi serum ekleyerek hazırlamak BSA/TBS.</li>
		<li>Her slayt için birincil antikor çözümü (1: 100 seyreltme) 150 µL tarafından anti-fosfo-PHF-tau pSer202 + Thr205 pipetting 1,5 µL hazırlamak (AT8) antikor 148,5 µL BSA-TBS tampon ve buz üzerinde bırakın % 1 içine</li>
	</ol></li> <li>Antijen alma gerçekleştirmek için dikey olarak antijen alma arabelleği 25 mL içeren bir slayt toplayıcı photobleached slaytları daldırın. Öyle ki toplayıcı su banyosu düşmek değil toplayıcısı teyp ve/veya dizeleri ile güvenli. Toplayıcı için 30 dk 90 ºC, bir su banyosu içinde ısı ve toplayıcı slaytları kaldırmadan önce oda sıcaklığında 30 dakika soğuması izin. Yapmak değil Kaldır slaytlar hemen olarak bölümler kurumasına neden olur.</li>
	<li>Slaytları TBS-Triton 30 mL ile dolu bir boyama kavanoza antijen alma toplayıcı aktarım ve nazik sallayarak ile bir orbital Çalkalayıcı üzerinde 5 min için bölümler yıkayın. Yıkama taze TBS-Triton ile bir kez yineleyin. Wick bir hav bırakmayan dokusu ve anahat hidrofobik kalem ile doku ile dış görev aşırı arabellek. Slaytlar kurumasına izin vermemeye özen.
	<ol><li>Her slayt için doku doku üzerine çözüm engelleme pipetting 200 µL tarafından blok ve slayt oksijen bir odaya koyun. Odası ıslak kağıt havlu içeren bir pipet ucu kutusunun içinde bir slayt raf yerleştirerek oluşturmak. Bir yüzeyin 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya. Engelleme çözüm tam olarak doku kapsar olun.</li>
	</ol></li> <li>Aspirasyon tarafından engelleme çözümü kaldırmak ve 100-150 µL birincil antikor çözüm doku üzerine pipette. Yeterli miktarda antikor mevcuttur ve bölüm antikor çözüm bir yana havuzu oluşturma önlemek için bir yüzeyin üzerinde olduğundan emin olun. Oksijen odasında gecede 4 ºC, kuluçkaya.</li>
	<li>İkincil antikor karışımı ve DAPI nükleer counterstain hazırlayın.
	<ol><li>Her slayt için karışımı keçi Anti-fare Alexa 488 1,5 µL ve keçi Anti-fare BSA-TBS 147 µL Texas kırmızı 1,5 µL ekleyerek ikincil antikor (1: 100 dilutions) 150 µL hazırlamak ve buz üzerinde bırakın</li>
		<li>Hazırlama 0,1 µg/mL DAPI seri seyreltme tarafından counterstain. Hisse senedi çözüm iyice karıştırın ve 1 µL olarak hisse senedi 5 mg/mL 5 µg/mL solüsyon 1 mL yapmak TBS 999 DAPI oranında seyreltin. Her slayt için seyreltik 3 µ5 µg/mL solüsyon L ile TBS 147 µL son konsantrasyonu olarak 0.1 µg/mL. 
		Dikkat: DAPI bilinen bir alkil olduğunu ve dikkatle ele alınmalıdır.</li>
	</ol></li> <li>Aspirasyon tarafından birincil antikor kaldırın. TBS-Triton ve nazik bir orbital Çalkalayıcı karıştırma ile 5 min için yıkama 30 mL içeren kavanoz boyama bir cam slayt daldırın. Taze TBS-Triton ile yıkama adımı yineleyin. Dış görev aşırı TBS-Triton fitil ve 100-150 µL her slayt için ikincil antikor karışımı pipet.
	<ol><li>Emin olun doku tarafından antikor karışım tamamen kaplıdır. Karanlıkta oksijen odasında oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.</li>
	</ol></li> <li>Ve slayt içeren TBS (Triton) 30 mL kavanoz boyama cam içine transfer aspirasyon tarafından ikincil antikor karışımı çıkarın. Nazik bir orbital Çalkalayıcı karıştırma ile 5 dakika yıkayın. Taze TBS. yıkama adımla 0.1 µg/mL DAPI counterstain 100-150 µL her slayta uygulamak ve karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya Yinele.</li>
	<li>Slaytları bir cam kavanoz TBS içeren boyama transfer ve 3 kez nazik 5 min her, taze TBS her yıkama için kullanarak için karıştırma ile yıkayın. Fitil uzakta aşırı arabellek.</li>
	<li>Sulu montaj orta doku olarak uygulamak 3 damla. Forseps kullanarak, bir temiz cam coverslip bir kenar ile başlayan ve yavaş yavaş diğer kenarına hava kabarcıkları yakalama önlemek için düşürücü dokusu üzerine yavaşça indirin. Coverslip hemen Imaging Eğer çıkarmak değil için dikkat ediniz. Aksi takdirde, karanlıkta 4 ºC, saklamadan önce kuru montaj orta izin.</li>
</ol> 4. Floresans mikroskobu <ol><li>dönüş floresan lamba, mikroskop hem de bilgisayarda ve 15 dk. lekeli doku slaytlar floresan mikroskop aşamasında yer için ısıtmak lamba sağlar. 10 x büyütme oranında dokuyu bulmak için parlak alan görüntü kullanın.</li>
	<li>Bir damla GKD 2 O coverslip yüzeye uygulamak ve bir 20 x su daldırma objektif lens kullanmak (NA = 1,0). 4-line ortalama uçak tarama ayarı seçin. İğne deliği boyutu ~ 3 mikron optik bir dilim veren 1 havadar birimini ayarlayın. Lazer uyarma ve emisyon dalga boylarında her fluorophore için en iyi sinyal için ayrı parça seçin. 
	Not: Alexa 488: λ ex 488 nm (argon lazer) λ em = 493-570 nm; = λ Texas kırmızı: ex 561 = nm (DPSS 561 nm lazer), λ em 601-635 nm; = λ DAPI: ex = 405 nm (diyot 405 lazer), λ em 410-507 nm =.
	<ol><li>Lazer güç ayarlamak ve sinyal şiddeti her parça için en iyi duruma getirmek için ayarları kazanç. Bileşik görüntü toplayabilir ve kaydedebilirsiniz. Floresans yoğunluklarda farklı bir slayt içinde karşılaştırmak için aynı lazer ayarları kullanın.</li>
	</ol></li> <li>Floresan yoğunluğu her kanaldaki görselleştirme için RGB profil araçları makro ImageJ 10 için yükleyin. Makroyu Microsoft Web sitesinden (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt) metin dosyası olarak kaydedin. ImageJ menüde Eklentiler - &#62; makrolar - &#62; yüklemek; RGB profillerini aracını yüklemek için metin dosyasını seçin.
	<ol><li>İçinde ImageJ confocal görüntü dosyasını açın ve bileşik görüntüler 3 yığınları RGB'ye aşağıdakileri gerçekleştirerek dönüştürmek: görüntü - &#62; renk - &#62; kanal aracı. Seçin &#34; kompozit &#34; açılır menü ve onay tüm üç kanal. Sonra görüntü - seçin &#62; türü - &#62; RGB renk.</li>
		<li>RGB profil Araçları simgesini seçin ve profiled için görüntünün bölümünde arasında bir çizgi çizin. Komplo için bir elektronik tablo olarak yoğunluğu verileri kaydetmek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Med%22%5BJournal%5D)">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).</li>
<li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin .</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).</li>
<li>Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+fixation%2C+exciting+light+and+section+thickness+on+the+primary+fluorescence+of+samples+for+microfluorometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Appl+Histochem%22%5BJournal%5D)">Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis.</a> Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).</li>
<li>Ottis, P., Koppe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rat+brain+lipofuscin+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human and rat brain lipofuscin proteome.</a> Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).</li>
<li>Sun, Y., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+elimination+of+lipofuscin+fluorescence+from+formalin-fixed+brain+tissue+by+white+phosphor+light+emitting+diode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array.</a> Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).</li>
<li>Davis, A. S., Richter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+its+applications+in+live+cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and its applications in live cell microscopy.</a> FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).</li>
<li>Duong, H., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multispectral+LED+array+for+the+reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).</li>
<li>Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+diode+flashlights+as+effective+and+inexpensive+light+sources+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).</li>
<li>Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+neuropathology+of+frontotemporal+dementia%3A+insights+into+disease+mechanisms+from+postmortem+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies.</a> J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).</li>
<li>Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticobasal+degeneration%3A+a+pathologically+distinct+4R+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy.</a> Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu el yazması açıklanan dokuların photobleaching ön arıtma kapalı bileşenleri kullanarak autofluorescence etkili eleme için sağlar. Protokol ayirt görüntüleme fosforile tau toplamları insan beyninin formalin sabit doku ikincil antikorlar Alexa 488 ve Texas kırmızı, DAPI bir nükleer counterstain olarak Birleşik kullanarak açıklar. Diğer dokulara yöntemi uygulamak için bir başlangıç noktası olarak örnek bir 48 h photobleaching ön arıtma yapmak tavsiye. Photobleaching sonra için iletişim kuralı özellikleri üreticinin öneril...

Floresans mikroskobu antikorlar spesifik proteinlerin hedefleme kullanarak düzenli olarak proteinler hücre kültürü ve dokuların ilgi görselleştirmek için kullanılır. Ayirt açık ve kesin Albümdeki edinimi için büyük bir komplikasyon endogenously memeli dokusunda yaş pigment lipofuscin ve elastin ve kolajen1gibi proteinler tarafından neden olabilir autofluorescence olduğunu, 2. Autofluorescence ile ilgili diğer kaynakları aldehid fiksasyon3gibi örnek hazırlama adımlarda tanıttı olabilir. Lipofuscin granül, öncelikle oxidatively değiştirilmiş protein ve lipit bozulması artıkları, oluşan uzun-canlı hücreler artan yaş2birikir. Olarak lipofuscin floresan emisyon yelpazesi geniş ve değişken, genellikle ortak fluorophores için kullanılan emisyon dalgaboyu ile rastlayan bu beyin ve kalp veya iskelet kasları gibi postmitotic doku Imaging'de zorluğa neden oluyor 4etiketleme. Bu faktörler insan beyin dokusundan özellikle zor durumlarda da lobar dejenerasyonu (FTLD) gibi geç başlangıçlı nörodejeneratif hastalıkların görüntüleme olun.
Autofluorescence azaltmak için içinde biz beyaz bir ışık yayan diyot (LED) dizi bir ev Resepsiyon lamba5kullanarak slayt monte doku bölümleri ışınlatayım bir teknik geliştirmiştir. Bu basit tekniği kullanmak CuSO4 gibi kimyasal quenchers amonyum asetat, veya piyasada bulunan boyalar Sudan Siyah B ve Eriochrome siyah T6gibi Şoklama teknikleri bir alternatif sağlar. Önemli maliyet tasarrufu bitti spektral have LED Lamba photobleaching teknikleri ve komplikasyonlar ve spektral un karıştırma7,8gibi dijital autofluorescence kaldırma yöntemleri üretilen eserlerin önler. Beyaz fosfor photobleaching kromofor5,9çeşitli için kapalı bir bileşeni olarak idealdir geniş emisyon spektrumlu, yüksek parlaklık ve düşük üretim maliyeti, LED var.
Bu iletişim kuralı, biz erişilebilir bileşenler kullanarak bir photobleaching aparatı inşaatı göstermek ve photobleaching FTLD dokusu fosforile tau ilişkin bir antikor özel kullanarak tau-pozitif kapanımlar (FTLD-T) içeren olgusu uygulanır. Biz iki yaygın olarak kullanılan kromofor istihdam fluorescently etiketli antikorlar Imaging üzerindeki etkisi photobleaching göstermek: Alexa 488 ve Texas kırmızı. Photobleaching tedavi edilmeyen bölümleri karşı etkisini veya ticari bir kimyasal içki ile tedavi sayılabilir ve karşılaştırıldığında. Bu photobleaching ön arıtma autofluorescence bir biyolojik örnek kaldırmak için herhangi bir standart ayirt boyama Protokolü içine dahil edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Koloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Caledon Laboratuvar Kimyasalları</td><td>1506656</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azide</td><td>BioShop Canada</td><td>SAZ001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri çanak</td><td>Sarstedt</td><td>82.9923.422</td><td>Foto ağartıcının tüm bileşenleri kullanılabilirliğe bağlı olarak değiştirilebilir</td></tr><tr><td>6 W LED Kısılabilir Masa Lambası</td><td>DBPower</td><td>DS501</td><td>Foto ağartıcının tüm bileşenleri kullanılabilirliğe bağlı olarak ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Sitrik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2404</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit&nbsp;( EDTA)</td><td>BioShop Canada</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>BioShop Canada</td><td>SHY700.1</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Haake Fisons</td><td>K15</td><td></td></tr><tr><td>Slayt toplayıcı</td><td>FisherScientific</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Boyama Kavanozu</td><td>FisherScientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Çalkalayıcı</td><td>Bellco Cam</td><td>&nbsp; 7744-08115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7878</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>FisherScientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Aurion</td><td>905.002</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik kalem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z672548-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-Tau (Ser202, Thr205) Monoklonal Antikor (AT8)</td> <td>ThermoFisher</td><td>MN1020</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare İkincil Antikoru, Texas Red-X</td><td>ThermoFisher</td><td>T862</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare İkincil Antikoru, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>ThermoScientific</td><td>28-600-42</td><td></td></tr><tr><td>Cam kayma</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme yazılımı ZEN 2012 Black Edition 11.0</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td>Yazılımı, Konfokal Mikroskop</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>RGB Profil Araçları makrosu</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt</td></tr><tr><td>Ticari kimyasal söndürücü</td> ile birlikte gelir<td>Biyotum</td><td>23007</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan beyninin formalin sabit bir doku arka plan floresans ayirt mikroskopi için basit ortadan kaldırılması

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Ayirt hücre altı bölmeleri görselleştirmek ve doku örneği içinde belirli proteinlerin yerelleştirme belirlemek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Yüksek kaliteli ayirt görüntüler edinimi için büyük bir engel lipofuscin gibi yaşlanma pigmentler veya aldehit fiksasyonu gibi genel örnek hazırlık süreçlerini neden doku endojen autofluorescence var. Bu protokolü nasıl arka plan Floresans büyük ölçüde beyaz fosfor ışık yayan diyot (LED) diziler önce tedavi ile floresan problar kullanarak photobleaching ile giderilebilir açıklar. Beyaz fosfor geniş spektrumlu emisyon LED fluorophores emisyon doruklarına aralığında beyazlatma için izin verir. Photobleaching aparatı çok düşük maliyetle kapalı bileşenlerden oluşturulması ve piyasada bulunan kimyasal quenchers için erişilebilir bir seçenek sunar. Photobleaching ön arıtma geleneksel ayirt boyama tarafından takip doku görüntü arka plan autofluorescence ücretsiz oluşturur. Göre kurulan soruşturma yanı sıra arka plan azaltılmış kimyasal quenchers sinyalleri, photobleaching tedavi etkili arka plan ve lipofuscin floresan azaltılmış sonda floresan yoğunluğu üzerinde bir etkisi vardı. Photobleaching ön arıtma için daha fazla zaman gerektirir, ancak daha yüksek yoğunluklu LED diziler photobleaching süresini azaltmak için kullanılır. Bu basit yöntem doku, beyin gibi lipofuscin birikir özellikle postmitotic doku ve kardiyak veya iskelet kasları çeşitli için potansiyel olarak uygulanır.

Photobleaching ön arıtma adım standart ayirt protokolü hemen önce antijen alımı ve immunostaining (şekil 1A) eklenebilir. Derleme photobleaching cihazları da çeşitli, kullanarak gerçekleştirilebilir ucuz, kapalı bileşenleri (şekil 1B). Beyaz fosfor emisyon spektrum LED'ler kapsar geniş menzilli photobleaching için uygundur dalga boyu geniş bir yelpazesi ile önceki raporlar (şekil 1 c)<sup class="xref...

Arka plan autofluorescence biyolojik örneklerin kez Floresans tabanlı görüntüleme teknikleri, özellikle yaşlı insan postmitotic doku zorlaştırmaktadır. Bu protokolü nasıl autofluorescence bu örnekler üzerinden etkin bir şekilde kaldırılabilir açıklar bir ticari olarak mevcut ışık yayan diyot ışık kullanarak örnek immunostaining önce photobleach için kaynak.

İnsan beyninin Formalin sabit bir doku arka plan Floresans ayirt mikroskopi için basit ortadan kaldırılması

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

İmmünofloresan mikroskopide yaygın bir sorun, sinyalinize müdahale edebilecek endojen arka plan floresansının varlığıdır. Birçok durumda, bu otofloresans sonuçlarınızın yorumlanamaz hale gelmesine neden olabilir. Bu protokolde, ticari bir LED masa lambası ile fotobleaching (fotobeyazlatma) kullanarak insan beyin dokusu örneklerinden otofloresansın nasıl giderileceğini göstereceğiz.Bu yöntemlerin temel avantajları, etkinlikten ödün vermeden mevcut tekniklere göre önemli maliyet tasarrufu sağlamaları ve numuneye hiçbir ekzojen bileşiğin eklenmemesidir. Başlamadan önce, 1x tris-tamponlu salin (TBS) ve %10 sodyum azid stok çözeltilerini hazırlayın. İşlemek istediğiniz her üç standart boyutlu mikroskop lamı için, lam haznesi olarak tek bir 100 milimetre x 100 milimetre kare Petri kabına ihtiyacınız olacaktır.Her bir lam odası için, 50 mL 1x TBS'ye 25 mL %10 sodyum azid ekleyerek 50 mililitre %0,5 azid içeren TBS hazırlayın. Lamba başının altına sığabileceği şekilde lam odasını yükseltmek için bir destek düzeneği oluşturun. 100 milimetrelik kare bir Petri kabı için, benzer boyutlarda plastik bir gıda saklama kabı uygun şekilde kesilerek kullanılabilir.Numunelere ulaşan ışığı engellemeden

simple-elimination-background-fluorescence-formalin-fixed-human-brain

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada yarı kalın beyin dilimleri görüntü floresan işaretli hücrelerin hızlı ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Sabitleme, dilimleme, beyin dokusu ve optik temizleme standart epifluorescent veya konfokal görüntüleme, sağlam sinir dokusu içinde bireysel hücreleri ve nöral ağların görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

Tüm fare organların Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün değil, tüm protokolleri floresan proteinlerin floresan sinyal korumak. Etanol bazlı dehidratasyon ve benzil alkol ile optik temizleme yöntemi: benzil benzoat takas, biz bütün fare beyin YFP ifade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.

YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Parafini çıkarmak için yıkayın, ardından azalan alkol konsantrasyonlarını kullanarak dokuyu yeniden sulandırın.

Beyin Dokusundaki Patojenlerin İmmünohistolojik Tespiti

Bu giriş seviyesi protokolü, örnek olarak mikroglia ve nöronal elementler için belirteçler kullanarak, kemirgen beyinlerinin immünohistokimyasal boyamasını tamamlamak için gereken reaktifleri, ekipmanı ve teknikleri açıklar.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Burada, kolay ve düşük maliyetli sağlar ve zaman tasarrufu sağlayan bir protokol kimyasal transmisyon elektron mikroskobu için immünohistokimya ön gömme uyumlu uzun süreli koruma sağlayan, akrolein sabitleyici ile primat beyin dokusunun düzeltmek için.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, çok etiketli FISH ve floresan IHC sinyali elde etmek amacıyla hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyin bölümlerinde floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve floresan immünohistokimyasını (IHC) birleştirmek için bir yöntemi açıklar. IHC, sitoplazmik ve membrana bağlı proteinleri hedefledi.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

Bu protokol, perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere fare beyni histolojik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı açıklar.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Mevcut protokol, (SWITCH  - H2O2 - Antijen Reterival - 2,2'-tiyodietanol [TDE]) KISA doku transformasyon tekniğini rutin olarak yüksek verimli bir protokolde ışık tabakası floresan  mikroskobu görüntüleme ile birleştirerek onlarca postmortem insan beyni kesitinin hızlı ve eşzamanlı optik temizleme, çok yönlü etiketleme ve 3D hacimsel rekonstrüksiyonu için adım adım bir prosedür sağlar.

Büyük Ölçekli İnsan Beyni Görüntülemede Işık Tabakası Floresan Mikroskobu için Optik Temizleme ve Etiketleme

Öğrenin, insan beyni dokularında otofloresansı LED fotobeyazlatma ile nasıl ortadan kaldırılır. Bu maliyet etkin yöntem, immünofloresans mikroskobisinde arka plan gürültüsünü azaltarak görüntü kalitesini artırır.

İnsan beyninin Formalin sabit bir doku arka plan Floresans ayirt mikroskopi için basit ortadan kaldırılması

Daha fazla video keşfet