İnsan beyninin Formalin sabit bir doku arka plan Floresans ayirt mikroskopi için basit ortadan kaldırılması

İmmünofloresan mikroskobunda yaygın bir sorun, sinyalinize müdahale edebilecek endojen arka plan floresansının varlığıdır. Çoğu durumda, bu otofloresan sonuçlarınızı yorumlanamaz hale getirebilir. Bu protokolde, ticari bir LED masa lambası ile foto ağartma kullanarak insan beyin dokusu örneklerinden otofloresansın nasıl çıkarılacağını göstereceğiz.

Bu yöntemlerin temel avantajları, etkinlikten ödün vermeden mevcut tekniklere göre önemli maliyet tasarrufu sağlaması ve numuneye hiçbir eksojen bileşik verilmemesidir. Başlamadan önce, bir kez tris-tamponlu salin, TBS ve% 10 sodyum azid stok çözeltileri hazırlayın. İşlemek istediğiniz her üç standart boyutlu mikroskop lamı için, slayt haznesi olarak tek bir 100 milimetre x 100 milimetre kare Petri kabına ihtiyacınız olacaktır.

Her slayt haznesi için, bir kez TBS'nin 50 mililitresine 25 mililitre% 10 sodyum azid ekleyerek TBS'de 50 mililitre% 05 azid hazırlayın. Slayt haznenizi, altına bir lamba kafası sığabilecek şekilde yükseltmek için bir iskele oluşturun. 100 milimetre karelik bir Petri kabı için, benzer boyutta bir plastik gıda kabı şekillendirilebilir.

Işığın numunelere ulaşmasını engellemeden sürgü odasını güvenli bir şekilde yükseltebilen herhangi bir şey kullanılabilir. Beyaz fosforlu LED bir masa lambası edinin ve ışık kaynağını kaplayan tüm difüzörleri veya opak plastikleri çıkarın. LED dizisini yukarı doğru yönlendirin.

Bu amaçla, esnek boyunlu bir lamba tavsiye edilir. Sürgü odalarını ve iskeleyi alüminyum folyo ile kaplayacak kadar büyük bir kutunun içini aydınlatarak cihaz için yansıtıcı bir kubbe kapağı oluşturun. Tek bir hazne için bir milimetrelik pipet ucu kutusu kullanılabilir.

Bu video için, formalinle sabitlenmiş insan FTLD-T orbital frontal gyri beyin dokusu fotobleaching ön işlemine tabi tutuldu. Doku hazırlama ve amino boyama prosedürleri, doku bölümlerinizin kaynağına, fiksasyonuna ve gömülmesine bağlı olarak değişebilir. Dört santigrat derece soğuk odada, soğuk dolapta veya buzdolabında, lambayı iskelenin altına ve numune odasını iskelenin üzerine yerleştirin.

Numune haznesini 50 mililitre azid TBS ile doldurun. Standart cam mikroskop slaytlarına monte edilmiş 10 mikrometre kalınlığındaki doku kesitlerini temiz forseps kullanarak numune haznesine daldırın. Aparatı yansıtıcı kubbe ile örtün ve LED lambayı açın.

Numunelerin 48 saat boyunca fotoağartıcıya maruz kalmasına izin verin. Bu inkübasyon süresi, lamba yoğunluğuna ve dokudaki otofloresan materyal miktarına bağlı olarak değişebilir. Fotobleaching ön işleminden sonra, slaytlar, ilgilendiğiniz özel doku ve proteinler için standart bir protokol ile immün olarak boyanabilir.

Gösteri amacıyla, FTLD-T beyin dokusu, Alexa 488 ve Texas Red'e konjuge edilmiş ikincil antikorlar kullanılarak fosforile tau için boyandı. DAPI nükleer bir karşı leke olarak kullanıldı. TBS'de 500 mililitre antijen alma tamponu, 500 mililitre% 0.025 Triton X-100, TBS'de 10 mililitre% 1 sığır serum albümini, BSA ve BSA TBS'ye eklenen keçi serumundan oluşan iki mililitre bloke edici çözelti hazırlayın.

Fotoağartılmış slaytları bir slayt toplayıcıdaki antijen alma tamponuna daldırarak antijen alımını gerçekleştirin. Kollektörü 90 derecede 30 dakika ısıtın. Kollektör ısıl işlemden çıkarıldıktan sonra, haznenin oda sıcaklığında 30 dakika soğumasına izin vermek önemlidir.

Slaytların hemen çıkarılması, bölümlerin kurumasına neden olur. Birincil antikor karışımınızı üretici tavsiyelerine göre hazırlayın. Bu durumda, anti-fosfo PHF tau p-serin 202 artı treonin 205 AT8 antikoru BSA TBS ile 100'de bir oranında seyreltildi ve buz üzerinde bırakıldı.

Bölüm başına 150 mikrolitre antikor karışımı gereklidir. Bölümler 30 dakika soğuduktan sonra, slaytları antijen alma toplayıcısından TBS Triton ile doldurulmuş bir boyama kavanozuna aktarın. Slaytları bu solüsyonda hafifçe çalkalayarak beş dakika yıkayın.

Bu yıkama adımını ikinci kez tekrarlamak için TBS Triton'u boşaltın ve değiştirin. Yıkadıktan sonra, slaytları boyama kavanozundan çıkarın ve fazla tamponu fitille temizleyin. Hidrofobik bir kalem kullanarak dokunun etrafına bir taslak çizin.

Bu, çözümlerinizin slayttan kaçmasını önleyecektir. Kaydırakların kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Slaytlara 200 mikrolitre blokaj solüsyonu pipetleyerek dokuyu bloke edin ve bunları nemlendirilmiş bir odanın içine yerleştirin.

Bu hazne, ıslak bir kağıt havlu içeren pipet ucu kutusunun içindeki bir kaydırma rafı kadar basit bir şey olabilir. Tüm doku örneğinin bloke edici solüsyon ile kaplandığından emin olun. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Tıkalı çözeltiyi aspiratör veya pipet ile çıkarın. Slaytların üzerine 100 ila 150 mikrolitre primer antikor karışımı pipetleyin. Antikorun eşit olmayan şekilde toplanmasını önlemek için tüm numunenin antikor çözeltisi ile kaplandığından ve bölümlerin düz bir yüzeyde tutulduğundan emin olun.

Nemlendirilmiş bir odada gece boyunca dört santigrat derecede birincil antikor ile inkübe edin. Ertesi gün, ikincil antikor karışımını hazırlayın. Bu durumda, keçi anti-fare Alexa 488 ve keçi anti-fare Texas Red, BSA TBS kullanılarak 100'de bir oranında seyreltildi.

Doku bölümlerini alın ve birincil antikor çözeltisini aspiratör veya pipet ile çıkarın. Slaytları, daha önce olduğu gibi, her yıkamada beş dakika boyunca TBS Triton ile doldurulmuş bir boyama kavanozu kullanarak iki kez yıkayın. Yıkadıktan sonra fazla tamponu fitille temizleyin.

100 ila 150 mikrolitre ikincil antikor solüsyonu pipetleyin ve doku örneğinin tamamen kaplandığından bir kez daha emin olun. Karanlıkta nemlendirilmiş odada oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Üretici tavsiyelerine veya seri seyreltmeye göre TBS'de mililitre başına 0.1 mikrogram DAPI karşı boyası hazırlayın.

Olası çözünemezlik nedeniyle DAPI stok çözeltisini iyice karıştırdığınızdan emin olun. Slaytları alın ve ikincil antikor karışımını çıkarın. Numuneleri iki kez yıkayın, ancak TBS Triton kullanmak yerine düz TBS kullanın.

Kalan yıkama solüsyonunu aspire edin veya pipetleyin ve doku bölümlerinize 100 ila 150 mikrolitre DAPI lekesi pipetleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Numuneleri alın ve iki yerine düz TBS ile üç kez yıkayın.

Yıkadıktan sonra, kalan yıkama solüsyonunu dikkatlice çıkarın. Montaj ortamını uygulayın. Numuneleri cam kapak kızakları ile kaplayarak sürgülü montajı tamamlayın.

Kapağın bir kenarını aşağı kaydırarak ve karşı kenarı forseps kullanarak çok yavaş bir şekilde indirerek kabarcıkları önleyin. Karanlıkta dört santigrat derecede saklamadan önce montaj ortamının kurumasını bekleyin. Slaytlar artık görselleştirilmeye hazırdır.

Floresan mikroskobu ayarları, boyama için kullanılan floroforlara ve mikroskoba bağlı olarak değişecektir. Floresan lambayı, mikroskobu ve bilgisayarı açın ve lambanın 15 dakika ısınmasına izin verin. Lekeli doku slaytlarını floresan mikroskobuna yerleştirin.

Dokuyu 10 kat büyütmede bulmak için parlak alanı kullanın. Uygun bir doku bölgesi bulunduğunda, numunenin kapak fişinin üzerine bir damla su ekleyin. 20 kez suya daldırılan lense geçin.

En iyi sinyal için her bir florofor için uygun lazer uyarma ve emisyon dalga boylarını ayrı yollarda seçin. Kullanılan ayarlar ve dalga boyları hakkında daha fazla ayrıntı, ekteki el yazmasında bulunabilir. Her parça için sinyal yoğunluğunu optimize etmek için lazer gücü ve kazanç ayarlarını yapın.

Uygun ayarlar ve görüş alanı bulunduğunda, her parçadan floresan verilerini içeren bileşik bir görüntü kaydedin. Her kanaldaki floresan yoğunluğunu görselleştirmek için ImageJ için RGB Profil Araçları makrosunu yükleyin. lsm konfokal görüntü dosyasını ImageJ'de açın ve Görüntü, Renk, Kanal Aracı'na giderek kompozit görüntüleri üç yığından RGB'ye dönüştürün.

Kompozit'i seçin ve üç kanalı da kontrol edin. Ardından, Görüntü, Tür ve RGB Rengi'ne gidin. RGB Profil Araçları simgesini seçin ve görüntüde profili oluşturulacak bölüm boyunca bir çizgi çizin.

Bu videoda, arka plan floresansı üretmek için doku örneklerinin foto-ağartma ön işlemini gerçekleştirme adımları açıklanmıştır. Bu prosedür, antijen alımı ve amino boyamadan önce herhangi bir standart amino floresan protokolüne eklenebilir. Foto ağartma için kullanılan aparat ucuzdur ve kolayca elde edilebilir, kullanıma hazır bileşenlerden oluşur.

Beyaz fosfor LED'ler, geniş bir dalga boyu spektrumunda ışık yayar ve bu da onları geniş aralıklı foto ağartma için son derece uygun hale getirir. Hazır bir LED masa lambası kullanılarak, boyanmamış insan FTLD-T beyin dokusu örnekleri fotoağartıldı ve bu örneklerin Texas Red ve Alexa 488 ile boyanması durumunda uygun olacak dalga boyları kullanılarak görüntülendi. İşlenmemiş numuneler büyük miktarda otofloresan gösterdi.

Buna karşılık, fotobleaching, lipofusisine benzeyen otofloresan beneklerin yoğunluğunun yanı sıra genel arka plan floresansının önemli ölçüde azalmasına neden oldu. Bu tekniğin daha fazla doğrulanması için, FTLD-T beyin dokusu örnekleri, bu hastalıkta farklı inklüzyon cisimcikleri olarak yanlış katlanan ve biriken bir protein olan hiperfosforile tau için boyandı. Tau etiketleme ve spesifik olmayan floresan arasında daha iyi ayrım yapmak için iki farklı ikincil antikor uygulandı.

Bu kompozit görüntülerde, Alexa 488 ve Texas Red'in kolokalizasyonu, doğru şekilde boyanmış tau proteinini temsil eden sarı renkle gösterilmiştir. Kırmızı veya yeşil bölgelerin görünümü, kromoforlardan birinin spesifik olmayan floresansını veya söndürülmesini gösterir. İşlenmemiş kontrol numunesinde, özellikle Texas Red kanalında önemli arka plan ve spesifik olmayan sinyal görülebilir.

Hem foto ağartma ön işlemi hem de kimyasal bir söndürücünün uygulanması, arka plan sinyalinin oldukça azalmasına neden olur. Floresan kanallarını böler ve görüntülere daha yüksek büyütme altında bakarsak daha detaylı gözlemler yapılabilir. İşlenmemiş kontrol, tüm kanallarda arka plan floresansının yanı sıra, tau'ya özgü etiketlemeye benzer yoğunluğa sahip, esas olarak Texas Red kanalında spesifik olmayan özelliklere sahiptir.

Tau inklüzyon cisimcikleri belirgin, öngörülebilir morfolojiye sahip olmasaydı, bu Texas Red sonuçları, bu otofloresan özelliklerin varlığı nedeniyle yanlış yorumlanabilirdi. Foto ağartma ön işlemi, tau'ya özgü Texas Red ve Alexa 488 sinyallerinin çoğunu korurken, bu Texas Red'e özgü olmayan özellikleri tamamen ortadan kaldırır. Bununla birlikte, foto ağartma, DAPI arka plan floresansı üzerinde çok az etkiye sahip gibi görünmektedir.

Kimyasal söndürücü, Alexa 488 kanalındaki arka plan floresansını foto ağartma kadar etkili bir şekilde azalttı. Bununla birlikte, hem DAPI hem de Texas Red'in floresan yoğunluklarını da azalttı ve bu da bazı verimsiz söndürmelerin varlığını düşündürdü. Bu etkilerin nicelleştirilmesi sinyal profillerinde görülebilir.

Gördüğünüz gibi, bu yöntem kafa karıştırıcı özelliklerden arınmış temiz görüntüler üretir. Bu foto ağartma ön işlemi, otofloresanı gidermek ve yüksek kaliteli, kesin sonuçlar elde etmek için herhangi bir standart amino floresan protokolüne dahil edilebilir.