Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji
August 25th, 2017
Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.
Bu deneysel prosedürün genel amacı, hedef bölgedeki genetik heterojenliği güvenilir ve sağlam bir şekilde ölçmek için ayrıntılı metodolojide temel bir yaklaşımın ana hatlarını çizmektir. Bu yöntem, yerinde mutajenezin nasıl analiz edilebileceği ve ölçülebileceği gibi gen düzenleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, tek sarmallı oligonükleotidler kullanılarak homolojiye yönelik onarım veya gen düzeltmesi için standartlaştırılmış bir metodoloji olmasıdır.
Protokole başlamak için, bir T-175 şişesinde HTT116 hücrelerinin kültürü için önceden hazırlanmış 25 mililitre ortamda HTT11619 hücreleri büyütün. Ortamı aspire edin ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen dulbecco'nun fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın, ardından PBS'yi aspire edin. Daha sonra, beş mililitrelik bir pipet kullanarak T-175 şişesine damla damla tripsin ekleyin.
Hücrelerin bir inkübatörde ayrılmasına izin verin. Hücreleri yerinden çıkarmak için şişeye dokunun ve ardından hücreleri, şişenin tüm yüzeyi boyunca sekiz mililitre tam ortamla söndürün. Ardından, hücre kümelerini parçalamak ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için karışımı birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
Hücreleri döndürmeden önce, 15 mililitrelik konik tüpten 10 mikrolitre alın ve hücreleri saymak için 10 mikrolitre tripan mavisi ile birleştirin, ardından hücreleri peletleyin. Tripan mavisi ile karıştırılmış hücrelerin 10 mikrolitresini hemositometreye aktarın ve dışarıdaki dört ızgarayı sayın. Senkronize edilecek her 10 santimetrelik hücre plakası için, beş mililitre tam ortam ve altı mikromolar aphidikolin ekleyin.
Daha sonra, 100 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre peletini her santimetrelik plakaya aktarın ve karıştırmak için plakayı hafifçe döndürün. G1S sınırındaki hücreleri senkronize etmek için plakaları inkübe edin. Hedeflemeden dört saat önce, ortamı aspire edin, PBS ile yıkayın.
PBS'yi aspire edin ve beş mililitre tam ortam ekleyin. Plakayı dört saat boyunca inkübatöre geri koyun. Mutant EGFP gen dizisini Zane Labs çevrimiçi oluşturucusuna girin ve hedef bölgeye yakın olarak bağlanan CRISPR kılavuz dizilerini seçin.
RNA'yı eşit molar konsantrasyonlarda 45 mikromolar ile karıştırın. 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 6.75 mikrolitre 200 mikromolar CR RNA stoğu ve 6.75 mikrolitre 200 mikromolar izleyici RNA stoğu ekleyin. Ardından, 30 mikrolitrelik bir son hacim elde etmek için 16.50 mikrolitre IDT tamponu ekleyin.
Daha sonra, karışımı bir PCR makinesinde beş dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Numunelerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Her numune için, 2.22 mikrolitre CR RNA'yı izleyici RNA kompleksine ve 2.78 mikrolitre IDT tamponunu beş mikrolitrelik bir nihai hacme seyreltin.
1.67 mikrolitre Cas9 proteinini 3.33 mikrolitre düşük sera ortamında 60 mikromolar stoktan beş mikrolitrelik bir nihai hacme seyreltin. Beş mikrolitre Cas9 proteinini beş mikrolitre kompleks RNA ile karıştırın. Ortamı aspire edin, beş mililitre PBS ile yıkayın.
PBS'yi aspire edin ve her 10 santimetrelik plakaya bir mililitre önceden ısıtılmış tripsin ekleyin. Plakaları inkübatöre koyun. Ardından, tüm hücrelerin yerinden çıktığından emin olmak için 10 santimetrelik plakaya dokunun ve ardından bunları plakanın tüm yüzeyine dağıtarak dört mililitre tam ortamla söndürün.
Hücre kümelerini parçalamak ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için birçok kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 15 mililitrelik konik tüpten 10 mikrolitre ayırın ve hücreleri saymak için 10 mikrolitre tripan mavisi ile birleştirin. Oda sıcaklığında 125 x G'de beş dakika döndürerek hücreleri peletleyin.
Ortamı aspire edin ve beş mililitre PBS ile yıkayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 125 x G döndürerek hücreleri püskürtün. 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu her bir elektroporasyon dört milimetre aralıklı küvete aktarın.
100 mikrolitre hücreye, 5 x 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda 10 mikrolitre RNP kompleksi ekleyin. Her örneğe iki mikromolar ODN ekleyin. Ardından, rafı bir elektroporasyon makinesine götürün.
Numunelerin her birini hafifçe hafifçe vurun ve hazneye yerleştirin. Rafı tekrar davlumbaza yerleştirin ve her numuneyi altı oyuklu bir plakada iki mililitre tam ortam içeren bir kuyuya aktarın. Düzeltme seviyelerini kontrol etmeden önce plakayı inkübe edin.
Ortamı aspire edin ve hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre önceden ısıtılmış tripsin ile değiştirin. Plakaları inkübatöre yerleştirin.
Ardından, tüm hücrelerin yerinden çıktığından emin olmak için plakaya dokunun ve ardından kuyunun tüm yüzeyine dağıtarak bir mililitre tam ortamla söndürün. Hücreleri 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne ve pelete geçirin. Hücreleri peletledikten sonra, ortamı aspire edin, ardından hücre peletini 500 mikrolitre FACS tamponunda yeniden askıya alın.
Senkronize edilmiş ve serbest bırakılmış HTT11619 hücrelerini, 100 mikrolitre başına 5 x 10 ila beşinci hücrelere kadar elektropoze edin, RNP kompleksi 100 pikomolde 100 mikromomolden 72 NTODN'de, 2.0 mikromolarda. Hücreleri altı oyuklu bir plakaya aktarın ve 72 saat boyunca iyileşmelerine izin verin. Daha sonra, EGFP artı eksi için 488 nanometre lazerli bir fac sıralayıcı kullanarak hücreleri tek tek 96 kuyucuklu plakaya sıralayın.
Büyümesi olan kuyulardan, ticari olarak temin edilebilen bir DNA izolasyon kiti kullanarak hücresel gDNA'yı izole edin. PCR ile hedef tabanı çevreleyen bölgeleri güçlendirin. Son olarak, numuneler üzerinde DNA dizileme analizi yapın.
İnkübasyon akış sitometrisi analizinden 72 saat sonra, yeşil floresan proteininin fonksiyonel onarımını onaylayın. Koordineli RNP ve 72NT seviyeleri arttıkça kademeli bir doz yanıtı gözlenmiştir. RNP partikülünün yokluğunda bir gen düzenleme reaksiyonu, tek ajan gen düzenleme reaksiyonunda 10 kat daha yüksek bir 72NT oligonükleotid konsantrasyonu kullanıldığında hedeflenen hücrelerin yaklaşık% 1'ini düzeltti.
EGFP pozitif örneklerin 16 klonu seçildi ve hedef bölgeyi çevreleyen genetik bütünlük DNA dizileyici ile analiz edildi. 16 EGFP pozitif hücrenin tümü, hedef bölgede tahmin edilen nükleotid değişimini içeriyordu. Hedef bölgede 15 yeşil olmayan klonal izolat heterojenlik açısından analiz edildi.
Örneklerin yaklaşık yarısında DNA baz değişimi gözlenmedi. İncelenen klonal genişlemelerin geri kalanı, heterojen bir delesyon mutasyonu popülasyonu sergiledi. Silme boyutu bir baz ile 19 baz arasında değişiyordu.
CRISPR, Cas9 ve tek sarmallı oligonükleotid donör DNA molekülleri, birlikte çalışan bu yeni modelde gösterildiği gibi, EGFP genindeki nokta mutasyonunun hassas bir şekilde onarılmasına yol açabilir, bu yeni modelde gösterildiği gibi, donör DNA'nın mutant bazın onarımı için replikasyon şablonuna eriştiği moleküler bir yol. ExACT olarak adlandırdığımız bir süreç. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gen düzenleme alanındaki araştırmacıların, hücre dizilerindeki gen düzenleme aktivitesinin bir sonucu olarak, hedef bölgedeki heterojenlik derecesini keşfetmelerinin yolunu açtı.
Genel Bakış
Bu protokol, memeli hücrelerinde nokta mutasyonlarını onarmak için CRISPR/Cas9 tabanlı bir gen düzenleme sistemini tasvir ediyor. Genetik heterojenliği ölçme ve yerinde mutagenezi analizi yöntemlerini detaylandırıyor.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gen Düzenleme
- CRISPR/Cas9 Teknolojisi
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- CRISPR/Cas9, gen düzenleme için devrim niteliğinde bir araçtır.
- Yerinde mutagenezi anlamak, gen terapisi için kritik öneme sahiptir.
- Standartlaştırılmış yöntemler, deneylerde tekrarlanabilirliği artırır.
- Bu protokol, tek sarmal oligonükleotidler kullanarak homologi yönlendirilmiş onarıma odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Hedef bölgelerdeki genetik değişiklikleri analiz etmek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Gen düzeltme teknikleri hakkındaki anlamayı geliştirmek.
- Gelecekteki gen düzenleme araştırmaları için standartlaştırılmış bir yaklaşım oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- HTT11619 hücrelerinin kültürü ve senkronizasyonu.
- CRISPR RNA ve Cas9 protein komplekslerinin hazırlanması.
- RNP kompleksi ile hücrelerin elektroporasyonu.
- Gen düzenleme sonuçlarını doğrulamak için akış sitometri analizi.
Ana Sonuçlar
- Yeşil floresan proteininin işlevsel onarımı doğrulandı.
- Hedef bölgede indel oluşumu ölçüldü.
- RNP konsantrasyonları ile doza bağlı bir yanıt gözlendi.
- Hedeflenen hücrelerde yaklaşık %1 düzeltme sağlandı.
Sonuçlar
- Bu yöntem, gen düzenleme çalışmaları için sağlam bir çerçeve sağlar.
- Tekrarlanabilirlik için standartlaştırma, gen terapisi araştırmalarında kritik öneme sahiptir.
- Gelecekteki uygulamalar, genetik bozukluklar için terapötik stratejileri geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol provides a standardized methodology to quantify on-site mutagenesis during CRISPR/Cas9-mediated point mutation repair, a critical factor in assessing the safety and precision of gene editing approaches for therapeutic development. By measuring indel formation at the target site, the method enables mechanistic de-risking of homology-directed repair strategies, supporting predictive confidence in lead identification and preclinical advancement decisions. The approach addresses a key discovery-stage challenge: distinguishing true correction from collateral genetic lesions, thereby informing go/no-go evaluations in early-stage genetic medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypothesis by distinguishing precise point mutation repair from unintended indel formation at the target site.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow to quantify genetic heterogeneity, supporting functional target validation through correction fidelity assessment.
- Predictive Value: Measures off-target-like activity at the on-target locus, informing biological de-risking and portfolio triage of gene editing constructs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized cell-based model (HCT116 with mutant eGFP) for consistent measurement of editing outcomes across experimental conditions.
- Quantitative Output: Delivers measurable indel frequency and size distribution (1–19 bp deletions) as a functional readout for assay optimization and reagent titration.
- Scalability: Supports preparation of validated biological systems for downstream screening campaigns requiring correction precision metrics.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase editing precision to preclinical validation by defining a benchmark for acceptable mutagenesis levels in therapeutic candidates.
- Risk-Adjusted Advancement: Quantifies the degree of on-site mutagenesis as a function of repair catalysis, enabling data-driven decisions on construct progression.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed corrections arise from true homology-directed repair or error-prone mechanisms, informing safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, specifically supporting lead identification by providing a quantitative metric for editing precision that precedes functional validation in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of repair mechanisms by isolating the contribution of CRISPR/Cas9 and ssODN to nucleotide exchange versus indel formation.
- Screening: Enables assay standardization through synchronized cell preparation and defined electroporation parameters, improving reproducibility across replicates.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (indel size, frequency, clonal distribution) that allow comparison of RNP and donor oligonucleotide dosing conditions.
- Translational Research: Connects molecular precision outcomes to preclinical risk assessment by establishing a threshold for acceptable off-target-like activity at the target site.
- Enterprise Reuse: Establishes a foundational, reusable workflow for evaluating any CRISPR/Cas9-based point mutation correction strategy in human cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in gene editing precision by directly measuring on-site mutagenesis as a confounder of apparent correction.
- Operational Value: Ensures standardization through detailed cell synchronization, RNP preparation, and electroporation protocols, reducing variability in genetic outcome measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by revealing whether observed correction is accompanied by significant indel formation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene editing approaches based on quantified mutagenesis profiles, supporting capital efficiency in preclinical investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, flow cytometry, and molecular cloning for gDNA isolation and PCR amplification.
- Dependent on access to electroporation equipment with 4 mm gap cuvettes and a FACS sorter capable of EGFP-based single-cell sorting.
- Necessitates standardization of cell synchronization (aphidicolin treatment) and RNP complex preparation across laboratories for reproducible results.
- Adaptation to other model systems may require optimization of electroporation conditions and donor oligonucleotide delivery efficiency.
- Practical limitation: The assay measures endogenous mutagenesis but does not distinguish between repair pathway contributions without additional mechanistic inhibitors.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Cell Line, Culture Conditions, and Harvest
1:57
Plating the Cells and Releasing Them from Aphidicolin Synchronization
2:44
RNA Complexing
4:13
Harvesting the Cells for Targeting
5:30
Targeting Samples
6:13
Analysis of Gene Edited Cells and Transfection Efficiency
6:57
DNA Sequence Analysis
7:56
Results: Effective Point Mutation Repair
9:41
Conclusion
