Name: DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNAyı kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Öğrenin tek nükleotid düzeyinde DNA polimeraz etkinliğini yakın kızılötesi floresan etiketli DNA ve akrilamid jel elektroforezi kullanarak analiz etmeyi. Bu yöntem DNA modifikasyonlarının polimeraz fonksiyonuna etkisini hassas şekilde gözlemlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser TriLink biyoteknoloji (ResearchReward Grant #G139) ve bilimsel ilerleme (Cottrell üniversite Scholar Ödülü #22548) için araştırma kurumu tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
<li>Chen, T., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+polymerase+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Directed polymerase evolution.</a> FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerases+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).</li>
<li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+novel+polymerase+activities%3A+mutation+of+a+DNA+polymerase+into+an+efficient+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
<li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li>
<li>Taylor, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysts+from+synthetic+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysts from synthetic genetic polymers.</a> Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).</li>
<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
<li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li>
<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
<li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity%3A+kinetics%2C+structure%2C+and+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Karger, B. L., Guttman, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2782523/">DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.</a> Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression%2C+purification%2C+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5%27+to+3%27+exonuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, M-DNA DNA polimeraz aracılı sentezi karakterize etmek için bir tahlil anlatmıştık. Yakın kızılötesi etiketli DNA primerler kullanılarak ve farklı büyüklükteki oligonucleotides gidermek için denaturing polyacrylamide Jel Elektroforez kullanarak, biz sentezi hassas ölçüm etkinleştirme oligonucleotides, tek nükleotid çözünürlük elde edebilirsiniz. Bu yaklaşımlar da enzim (Bölüm 2.1) genel etkinliğini ölçmek için veya tek tek adımları (2.1. adımda takip Not) Michaelis-Menten parametrelerini ölçmek için kullanılabilir...

DNA polimeraz doğru ve etkili DNA sentezi gerçekleştirir ve genom bütünlüğünü korumak için gereklidir. Nükleotit saniyede yüzlerce hata yapmadan sentez yeteneği Ayrıca moleküler biyoloji ve biyoteknoloji DNA polimerazlar temel araçları sağlar. Ancak, bu özellikler de M-DNA yüzeylerde uygulamalarda sınırı; Genel olarak, doğal DNA polimerazlar birçok potansiyel olarak değerli M-DNA yüzeylerde, büyük olasılıkla nedeniyle standart olmayan yüzeylerde vivo içindekullanarak karşı yüksek seçici basınç için sentez olamaz. Birçok grup mutant DNA polimerazlar M-DNA sentezi1a,2,3,4,5/ yetenekli üretmeye yönlendirilmiş evrim yaklaşımlar geliştirdik; Bu çabalar DNA6,7,8Biyoteknolojik yarar genişletmiştir.
Mutant DNA polimerazlar M-DNA, sentez yeteneği değerlendirmek için biz9,10ve diğer11,12,13 genellikle DNA'ın vitro ölçümler kullanın polimeraz etkinlik, bu el yazması açıklanmıştır. Bu deneylerde, DNA polimerazlar bir etiketli astar/şablonu çift yönlü ve nükleozit trifosfat yüzeyler ile birlikte inkübe; Ürünler Jel Elektroforez tarafından değerlendirilir. Deneysel sorularınıza, mutant DNA polimeraz, değiştirilmiş astar bağlı olarak, değiştirilen şablonlar veya değiştirilmiş nükleozit trifosfatlardan, sistematik biyokimyasal değerlendirme mutant enzim aktivitesinin etkinleştirme kullanılabilir.
Tarihsel olarak, bu deneyleri DNA sentezi izlemek için bir 5' radyoaktif etikette yararlanmıştır; En çok 32P ve 33P kullanılmıştır; genellikle, etiketleme T4 polinükleotit kinaz11kullanarak elde edilir. Ancak, sonlu yaşam ömrü ve radyoaktif etiketleri ve güvenli ellerinde nispeten yüksek maliyet nedeniyle, bizim grup yerine sentetik 5' yakın kızılötesi fluorophore DNA etiketli kullanır. Nispeten düşük maliyetli yakın kızılötesi jel Imager kullanarak, önceki çalışmalar radyoaktif etiketleri (yayınlanmamış sonuçları) kullanarak benzer algılama sınırları gözlemledim. Başarıyla gözlemler9yeniden oluşturduktan ve biz daha önce ölçülen hızı sabitler (yayınlanmamış sonuçları) ile herhangi bir büyük nicel fark gözlemledim değil.
DNA boyutunu ve böylece, DNA sentezi ölçüde çözümlemek için orijinal Sanger sıralama14 Kapiler Elektroforez15gelişiyle önce için gelişmiş polyacrylamide Jel Elektroforez yöntemleri güveniyor. Ayırma ve hareket etme mesafe moleküler ağırlık ölçüsü kullanılabilir; geniş format, dikey polyacrylamide jeller DNA oligonucleotides değişen uzunlukları nicel gözlem etkinleştirme tek nükleotid çözünürlük elde edebilirsiniz.
Toplu olarak, bu deneyler polimeraz karakterizasyonu için sağlam bir yöntemdir. Zaman nedeniyle hassas doğası reaksiyonlar, hazırlık ve bakım tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek gereklidir. Ayrıca, Akrilamid jel DNA sentezi yanı sıra çok sayıda diğer DNA değiştirme reaksiyonları, tek nükleotid çözünürlükle ölçmek için son derece etkili bir yol olsa da teknik olarak zor olabilir. İletişim kuralı burada Umarım kullanıcıların en yaygın hatalardan kaçınırken bu deneyleri gerçekleştirmeye olanak verir.

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Asetillenmiş BSA</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (yani DTT)</td><td>Uluslararası Araştırma Ürünleri</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (yani EDTA) (0.5M çözelti)</td> <td>Sigma</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>Turuncu G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTP'ler (riboNTP'ler)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTP'ler (diğer tüm modifiye NTP'ler)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>astar 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Özel Sentezler</td><td>Özel bir sentez olarak satın alınabilen IR700 boyasını kullanıyoruz. Genellikle saflaştırılmış oligonükleotid HPLC'yi satın alırız. Dizi 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA şablonudur:</td></tr><tr><td>1</td><td>IDT DNA / TriLink Biyoteknoloji</td><td>Özel Sentezler</td><td>Genellikle oligonükleotidleri HPLC'den saflaştırılmış olarak satın alırız. Sıra 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>A11405</td><td>%38,67 akrilamid ve %1,33 bis-akrilamid</td></tr><tr><td>Tris/Borat/EDTA (TBE) katı</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>Üre ultra saf</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>Jel bant</td><td>CBS Scientific</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>Büyük beyaz yaylı kelepçe polipropilen</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>0,75 mm ara parçalar</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33x42 Çentikli Cam Tabak Seti</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>Kama plakası ayırıcı</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>Jel elektroforezi için tarak</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>Jel elektroforez teçhizatı</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>ultra saf su</td><td></td><td></td><td>Millipore DNA polimerazlarından</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>bir Milli-Q sistemi kullanıyoruzBunları yayınlanmış protokolleri kullanarak laboratuvarımızda hazırlıyoruz.</td></tr></tbody></table>

dna polimeraz etkinliği tahlil akrilamid jel elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli dna'yı kullanarak

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Herhangi bir enzim için sağlam, nicel yöntemler hem yerli hem de mühendislik enzimleri karakterizasyonu için gereklidir. DNA polimeraz için DNA sentezi polyacrylamide Jel Elektroforez tarafından takip bir vitro DNA sentez yöntemi kullanarak karakterize edilebilir. Bu tahlil doğal DNA ve değiştirilmiş DNA (M-DNA) sentezi ölçmek için hedeftir. Bu yaklaşımlar ile tek nükleotid kararlılık, enzimatik Oligonükleotid sentezi sırasında tek tek adımları gözlem etkinleştirme oligonucleotides çözmek için özellikle yararlıdır. Bu yöntemleri bir dizi biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri gibi kararlı durum hızı sabitler tek tek adımları DNA sentezi, DNA sentezi ve DNA bağlama benzeşme hata oranı ölçümü değerlendirilmesi için uygulandı. Dahil ancak bununla sınırlı olmamak üzere, değiştirilmiş nükleozit trifosfatlardan (NTP), M-DNA, ve/veya mutant DNA polimeraz, çift etkili bir şekilde değerlendirilebilir substrat DNA polimeraz göreli yarar bileşenleri kullanılarak değiştirilebilir. Burada, geleneksel olmayan astar DNA stratejileri yakın-kızılötesi fluorescently DNA etiketli gibi etiketleme karşılamak için yapılması gereken değişiklikleri içeren tahlil ayrıntılı. Ayrıca, dökme Akrilamid jel için çok önemli teknik adımları ayrıntılı olması ve çalışan, hangi sık sık teknik olarak zor olabilir.

Başarılı polyacrylamide jel analiz genel faaliyet (2.1, şekil 1bölümünde açıklanan) ve (Bölüm 2.1, Şekil 2sonuç notta açıklanan) kararlı durum Kinetik nitel bir karakterizasyonu gösterilir. Başarısız polyacrylamide jel analizi de (şekil 3) gösterilir.
Not yok piyasada bulunan merdiven ya da moleküler marker kullanılır. Zaman zaman, moleküle...

Bu iletişim kuralı DNA polimeraz yakın kızılötesi fluorescently etiketli DNA Jel Elektroforez ve jel görüntüleme kullanarak değişiklikleri gözlem yoluyla değiştirilmiş DNA sentezi karakterizasyonu açıklar. Akrilamid jelleri yüksek kararlılık düşsel boyutuna bağlı olarak farklı fiyatlara geçiş kısa nükleik asitler ayrılması için kullanılır.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Bu prosedürün genel amacı, tek nükleotid düzeyinde DNA polimeraz aktivitesini analiz etmektir. Bu yöntem, DNA sentezinin hangi spesifik basamaklarının DNA modifikasyonları tarafından sınırlandırıldığı gibi DNA polimeraz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, polimeraz aktivitesinin kesin bir şekilde gözlemlenmesine olanak tanıyan tek nükleotid değişimlerini gözlemleyebilmenizdir.Bu prosedürü uygularken önceden planlama yapmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Adımların çoğu zamana duyarlıdır. Bu prosedüre başlamak için öncelikle metin protokolünde belirtilen tamponları, DNA dupleks karışımını ve protein dilüsyonunu hazırlayın.Ardından, bir kuru banyonun sıcaklığını 50 °C olarak ayarlayın. 25 µL 2X dNTP'ler içeren bir mikrocentrifüj tüpüne, tavlanmış dupleks karışımından 24 µL ekleyin. Bunun ardından, enzim içermeyen kontrolü hazırlamak için bu karışımdan 9,8 µL'yi 20 µL quenching buffer orange içeren bir mikrocentrifüj tüpüne aktarın.Ardından, dNTP karışımına 0,8 µL 50X enzim ekleyin. Çözeltiyi iyice karıştırmak için geniş hacimli bir pipet kullanın. Kuru banyoda inkübe edin.Her bir reaksiyon karışımından 10 µL alıp bunu 20 µL sönümleme tamponu turuncu içeren bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyerek reaksiyonu durdurun. Jel elektroforezi için akrilamid karışımını metin protokolünde belirtildiği şekilde hazırlayın. Ardından, iki adet 33 cm x 42 cm boyutundaki jel plakasını sabun ve suyla iyice yıkayın.Her bir plağın ön yüzünü kağıt havluyla kurulayın ve ardından kalan alanları kurutmak için hassas görev temizleyicileri kullanın. Kurutulmuş plakları %70 ethanol ile durulayın ve her birini tekrar temizleme bezleriyle silin. Bunun ardından, eldivenli elinizi deiyonize su altında yıkayın ve ardından ıslanmış parmakları kullanarak 0,75 milimetre kalınlığındaki ara parçaları nazikçe ıslatın.Ara parçaları çentikli plakanın kenarı boyunca yerleştirin. Plakalara sıçramış olabilecek suları temizlemek için görev silgileri kullanın. Plakaları birleştirin ve ardından üst kısmı açık bırakacak şekilde alt ve yanları jel bantla kapatın.Bandın düzgün şekilde hizalandığından ve sıkıca kapatıldığından emin olun. Bir jilet kullanarak bandın uçlarını kesin. Ardından, jelin altına ek bir bant katmanı ekleyin.Reaktifler hazırlandıktan sonra, bir püskürtme şişesi temin edin ve uçtaki huniyi çıkarın. Mezür kullanarak 125 mililitre su ekleyin. Ardından, kalıcı bir markör ile su seviyesini şişenin dış kısmına işaretleyin.Suyu dökün. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi, mantar halkaları ve plaka sandviçini bir lavabonun yanına kurun. Boş püskürtme şişesini, hazırlanan APS ve TEMED çözeltilerini lavabonun diğer tarafına yerleştirin.İstenilen kuyucuk sayısına sahip bir tarak ve dört adet klempi yakına yerleştirin. Ardından, işaretli seviyeye gelene kadar sıkma şişesine %20 akrilamid jel çözeltisi ekleyin. Aynı anda, poliakrilamid jel çözeltisine 120 microliters TEMED ve 600 microliters APS ekleyin.Hızla 600 µL ek APS ekleyin. Sıkma şişesinin kapağını hızla kapatın ve dairesel hareketlerle çalkalayarak karıştırın. Ardından, plaka sandviçini lavaboya yerleştirin.Şişeye yavaş ve sabit bir basınç uygulayarak jel çözeltisinin düzenli akmasını sağlayacak şekilde dökmeye başlayın. Jel, çentikli alana ulaşana ve çentikli kenardan hafifçe taşana kadar dökün. Hava kabarcıklarını gidermek için plakaları eğik tutun.Ardından kuyucuk tarağını plaka sandviçine ekleyin. Kuyucukların eşit dağılımını sağlamak için kıskaçları tarağın üzerine, aşağıya doğru bastıracak şekilde yerleştirin. Sıkma şişesinde kalan jel solüsyonunu hızlıca uygun bir atık konteynerine boşaltın.Şişeyi temizlemek için püskürtme nozulunu kullanarak üç kez deiyonize su ile durulayın. Başlamak için plaka sandviçindeki tüm binder klipsleri çıkarın. Bir jilet kullanarak, jel bandı kenarlardan kesin ve çıkarın.Polimerize jel kalıntılarını mümkün olduğunca temizlemek için cam yüzeyleri kağıt havlu ve su ile silin. Kalan jeli kazımak için kenarlar boyunca bir jilet kullanın. Ardından, tarakçığı çıkarmak için her iki yanından eşit şekilde itin.Bir jilet kullanarak, plaka sandviçinin üst kısmı boyunca kalan fazla jeli kesin. Ardından, plakanın kertikli kenarı boyunca kesin. Bir şırınga ve deiyonize su kullanarak, kalıntıları temizlemek için kuyucukları durulayın.Her bir kuyucuğun suyla doldurulabildiğinden ve fazla polimerize jel ile tıkanmadığından emin olun. Ardından, uzun plaka dışarıya, kertikli alan ise içeriye bakacak şekilde plaka sandviçini aparata yerleştirin. Plaka sandviçini ve alüminyum plakayı aparata tutturarak klipsleyin.Düzgün bir çalışma sağlamak için plakanın dış kısmına ek klipsler takın. Taban çentiklerini ve üstteki kuyucukları kapatacak kadar TBE tamponu ekleyin. Plakaları ısıtmak için jel elektroforezini 50 watt'ta 20 dakika boyunca çalıştırın.Bunun ardından, kuyucukları temizlemek için bir şırınga ve TBE tamponu kullanın. Kuyucuklardaki tüm kalıntı tampon tuzlarının temizlendiğinden emin olmak için şırınga ile yıkama işlemini birkaç kez tekrarlayın. Daha sonra, her iki yandaki en dış şeritleri metin protokolünde belirtildiği şekilde hazırlayın.Jelin uygun kuyucuklarına bromofenol mavili %95 formamidin üç mikrolitresini ekleyin. Tüm örnekleri yükleyin ve bir dakika boyunca çökmelerini bekleyin. Cihazı ve güç kaynağını bağladıktan sonra, gücü 50 ile 55 watt arasına ayarlayın.Jeli yaklaşık üç saat boyunca veya bromofenol mavi boya önü jelin en az üçte ikisi boyunca ilerleyene kadar çalıştırın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi jelin görüntüsünü alın. Bu çalışmada, modifiye DNA'nın DNA polimeraz aracılı sentezini karakterize etmek için bir analiz geliştirilmiştir.Genel aktivitenin başarılı bir kalitatif karakterizasyonu, iyi tanımlanmış ve düzenli bireysel bantlar gösterir. Aktivite, hem ürünlerin uzunluğuna hem de işaretli primerin ne kadarının daha büyük ürünlere dönüştüğüne bakılarak değerlendirilir. Görüldüğü üzere, E6 ve E5 en aktif enzimlerken, E4 ve E1 en az aktif olanlardır.Bu yöntemler kullanılarak kararlı durum kinetiği ile kantitatif bir analiz de gerçekleştirilebilir. Sadece N ve N+1 ürünleri sentezlendiği için, tekil olay başarıyla miktarlandırılabilir. Buradaki temel metodoloji, polimerazlar dışındaki bir dizi diğer DNA veya RNA modifiye eden enzimi incelemek için de kullanılabilir.

dna-polymerase-activity-assay-using-near-infrared-fluorescent-labeled

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Eksonükleazlar, genom stabilitesinin sağlanmasında kritik roller oynar. WRN eksonükleaz fonksiyonunun kaybı erken yaşlanmaya neden olur. Nükleazın substratlarını ve diğer gereksinimlerini in vitro olarak incelemek, in vivo rolünü aydınlatmaya yardımcı olabilir. Burada, nükleaz aktivitesini ölçmek için hızlı ve tekrarlanabilir floresan bazlı bir test gösteriyoruz.

İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexo'yu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Semiflexible polimerler canlı sistemler tarafından yaygın olarak uygulanan benzersiz mekanik özellikler görüntüler. Ancak, polimer sertlik gibi özellikleri erişilemez olduğundan biyopolimer sistematik çalışmalar sınırlıdır. Bu müsvedde filaman sertlik etkisi üzerinde deneysel çalışmalar etkinleştirme programlanabilir DNA nanotüpler tarafından bu sınırlama nasıl hile açıklar.

DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak

Bu yöntem bir SYBR yeşil jel ıslatarak seçici boyama ve jelleri içinde DNA'ın miktar sağlar ben / Nitro mavi Tetrazolium çözüm ve sonra güneş ışığı ya da mavi bir ışık kaynağına maruz. Bu işlem görünür bir çökelti oluşturur ve alan kullanımı için ideal hale neredeyse hiçbir ekipman.

DNA Formazan yağış mavi ışığa maruz tarafından indüklenen esas alarak yöntemini boyama

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Bu çalışma, DNaz aktivitesinin tespiti ve kantitatif değerlendirmesi için basit, kullanıcı dostu bir oransal FRET testi sunar ve zayıf bir nükleazın analizinde uygulamasını gösterir.

DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Bu protokol, DNA polimerazlar ve G-dörtlü yapılar gibi engeller arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan floresan mikroskobu tabanlı tek moleküllü DNA replikasyon testini ana hatlarıyla belirtir.

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Öğrenin tek nükleotid düzeyinde DNA polimeraz etkinliğini yakın kızılötesi floresan etiketli DNA ve akrilamid jel elektroforezi kullanarak analiz etmeyi. Bu yöntem DNA modifikasyonlarının polimeraz fonksiyonuna etkisini hassas şekilde gözlemlemenizi sağlar.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNAyı kullanarak (Video) | JoVE Journal

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

Daha fazla video keşfet