Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı
15 Aralık 2017
Bu el yazması mikrobiyal yetiştirme ortamının terzi tasarımı için genel bir yaklaşımı açıklar. Bu güvenilirlik ve sıvı ortam işleme hızı artırmak için laboratuvar robot tarafından desteklenen yeterli ekimi verimi için deneysel tasarım ve microbioreactor teknoloji Kriging tabanlı birleştiren yinelemeli bir iş akışı tarafından etkin hazırlık.
Yeterli yetiştirme verimi için Kringing tabanlı deneysel tasarım ve mikrobiyoreaktör teknolojisini birleştiren bu yinelemeli iş akışının genel amacı, mikrobiyal yetiştirme ortamının özel olarak tasarlanmış tasarımı için genel bir yaklaşım tanımlamaktır. Bu yöntem, mikrobiyal biyoproses geliştirme alanında, yetiştirme ortamının optimizasyonu, biyoproses koşulları ve ayrıca suş fenotiplemesi gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem için ilk olarak, küçük metabolit üretimi için optimize edilmiş yetiştirme ortamının heterolog protein üretimi için de en uygun olup olmadığını kendimize sorduğumuzda aklımıza geldi.
Bu tekniğin temel avantajı, deney ve modellemenin akıllı kombinasyonu ile genel geliştirme sürelerini hızlandırmasıdır. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Roman Jansen olacak. Bu prosedüre, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalışma anlayışı ve yöntemlerin tanımı ile başlayın.
Plakaları yüzde 70 etanol ile silerek ve ardından laminer bir akış başlığında kurutarak bir çalışma masasında stok çözeltisi depolaması için derin kuyu plakalarını sterilize edin. Tohum kültürüne, litre başına 25 miligram kanamisin içeren 50 mililitre BHI besiyerini, çalışan hücre bankasından bir alikot ile aşılayarak başlatın. Gerekli tüm laboratuvar malzemelerini robotik çalışma masasına yerleştirin ve stok çözeltilerini ilgili laboratuvar gereçlerine dökün.
Ardından, tohum kültürünün başlaması için son adım olan aşılama aşamasına zamanında ulaşılması için medya hazırlığı için robotik iş akışını başlatın. Optik yoğunluğu 600 nanometre veya OD-600'de ölçerek büyümeyi izlemek için tohum kültürünü yaklaşık iki saat sonra örnekleyin. Her saat büyümeyi izlemeye devam edin.
Yaklaşık beş saat sonra, kültür üç ila dört arasında bir OD-600'e ulaşır ve ana kültürleri aşılamak için kullanılır. Tohum kültürünü sıvı işleyici çalışma masasına yerleştirin ve ortam hazırlama protokolüne devam edin. Aşılamadan sonra yetiştirme mikrotitre plakalarını kapatın.
Ardından, mühürlü yetiştirme MTP'yi Biolector cihazına yerleştirin. Ardından, önceden tanımlanmış yetiştirme protokolünü başlatın. Gerekirse kalan stok çözeltilerini biyogüvenlik yönetmeliklerine göre atın.
Ardından, kültürü robotik çalışma masasından tohumlayın. Sıvı işleyici dekontaminasyon protokolünü başlatmadan önce yeniden kullanılabilir laboratuvar gereçlerini temizleyin. 17 saatlik bir çalışma süresinden sonra ana kültürü durdurun ve verileri metin protokolünde açıklandığı gibi işleyin.
GFP titresini ölçmek için, önce hücre süspansiyonlarını tüm yetiştirme kuyularından önceden hazırlanmış reaksiyon tüplerine aktarın. Ardından, hücresiz süpernatanı elde etmek için bir tezgah üstü santrifüj kullanarak hücre süspansiyonlarını maksimum hızda 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, her hücreli serbest süpernatanın 200 mikrolitresini şeffaf bir tabana sahip siyah bir 96 oyuklu M-T-P'ye aktarın.
Uygun bir mikroplaka okuyucu kullanarak uyarma için 488 nanometrede ve emisyon dalga boyu için 520 nanometrede GFP'ye özgü floresansı okuyun. GFP floresansını ölçtükten sonra, mikroplaka, Bradford veya BCA testi gibi standart protokollerle hücresiz süpernatantların protein içeriğinin belirlenmesi için doğrudan kullanılabilir. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi veri analizine devam edin.
Gösterilen prosedür bir tur deney oluşturur, sonuçlar GFP sinyalinde beklenen maksimum iyileşme ile daha sonraki turlar tasarlamak için kullanılır. Veri değişkenliğini analiz etmek ve deneysel aykırı değerleri tespit etmek için her tura referans deneyler yerleştirilir. Bu kontur grafiği, optimizasyon prosedürüne genel bir bakış sunar.
Üçüncü yineleme yoluyla toplanan veri setinin analizi, optimal bir konsantrasyon aralığı belirleyerek magnezyumun pozitif etkisinin bir sınırlamasını ortaya çıkardı. Bu nedenle, dördüncü yinelemede sadece kalsiyum için konsantrasyon aralığının daha da genişletilmesine karar verildi. Prosedür, GFP sinyalinin doygunluğu bulunana kadar beşinci ve altıncı yinelemede iki kez tekrarlandı.
Bu doygunluk, hücre için mevcut olmayan uygulanan kalsiyum konsantrasyonları için kalsiyum tuzunun çökeltilmesi ile açıklanır. Yedinci yineleme, sınırları daha ayrıntılı olarak keşfetmek için kullanıldı. Doymuş GFP sinyali için ortam bileşenlerinin optimal konsantrasyon aralıkları, istatistiksel bir Z-testi ile güvenilir bir şekilde tanımlanabilir.
Tanımlanan platoyu Kringing kiti araç kutusu kullanılarak belirlendiği ve görselleştirildiği şekilde gösterir. Kringing kiti araç kutusu ücretsiz olarak mevcuttur ve özelliklerinin nasıl kullanılacağını açıklayan ayrıntılı bir eğitimle birlikte gelir. Sunulan protokolün jenerik doğası, diğer mikrobiyal ekspresyon konakçılarının incelenmesi veya hedef proteinin glikozilasyon paterni veya disülfid bağları gibi diğer özelliklerinin optimizasyonu gibi çeşitli uyarlamalara izin verir.
Bir embrion sisteminin entegrasyonu, zamandan büyük tasarruf sağlayan deneysel verimi artırır Tamamen kontrol edilebilir ve etkili biyoreaktörleri amniar sistemlerle değiştirirken, sonuçların ölçeklenebilirliği dikkate alınmalıdır. Matematiksel modelleme ve deneylerin tasarımı, çalışılan hedefe göre ölçüm verilerinin bilgi içeriğini en üst düzeye çıkarmaya yardımcı olur.
Genel Bakış
Bu çalışma, yinelemeli bir iş akışı kullanarak mikrobiyal kültür ortamlarının kişiye özel tasarımı için genel bir yaklaşımı tanımlamaktadır. Bu yöntem, kültürleme verimliliğini ve güvenilirliğini artırmak için Kriging tabanlı deney tasarımı ile mikrobiyoreaktör teknolojisini birleştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyal biyoproses geliştirme
- Deneysel tasarım
- Mikrobiyoreaktör teknolojisi
Arka Plan
- Kültür ortamlarının optimizasyonu, mikrobiyal süreçler için kritik öneme sahiptir.
- Küçük metabolit üretimi ve heterolog protein üretimi, özel olarak hazırlanmış ortamlar gerektirir.
- Deneylerin modelleme ile birleştirilmesi, geliştirme sürelerini hızlandırabilir.
- Robotik sistemler, ortam hazırlama sürecindeki sıvı taşıma işlemlerinin verimliliğini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Mikrobiyal kültür ortamlarını optimize etmek için bir yöntem geliştirmek.
- Ortam bileşimi ile protein üretimi arasındaki ilişkiyi araştırmak.
- Ortam tasarımı için iteratif iş akışını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Kriging tabanlı deneysel tasarımın kullanımı.
- Kültürleme için mikrobiyoreaktör teknolojisinin uygulanması.
- Besiyeri hazırlama için robotik sıvı aktarım sistemleri.
- Optimal besiyeri bileşen konsantrasyonlarını belirlemek için istatistiksel analiz.
Ana Sonuçlar
- Besiyeri bileşenleri için optimal konsantrasyon aralıklarının belirlenmesi.
- G-F-P sinyalinin iyileştirilmesine yol açan iteratif sürecin gösterilmesi.
- Sonuçların istatistiksel Z-testleri ile doğrulanması.
- Protokolün çeşitli mikrobiyal ekspresyon konakçılarına uyarlanabilirliği.
Sonuçlar
- Sunulan yöntem, mikrobiyal kültür ortamlarının tasarımını önemli ölçüde geliştirmektedir.
- Robotik sistemlerin entegrasyonu, işlem kapasitesini ve verimliliği artırmaktadır.
- Sonuçlar, mikrobiyal araştırmalardaki farklı uygulamalar için ölçeklendirilebilir ve uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygulama Alanları
Bu protokol, suş geliştirme ve biyoproses verimliliğinde kritik bir adım olan heterolog protein üretimi için mikrobiyal kültür ortamlarının optimizasyonu şeklindeki biyofarmasötik zorluğu ele almaktadır. Kriging tabanlı deney tasarımı ile mikrobiyoreaktör teknolojisini ve robotik sıvı taşıma sistemlerini entegre eden bu yöntem, ortam optimizasyon döngülerini hızlandırır ve ortam formülasyonundaki öngörülebilirlik güvenini artırır. Genel ve uyarlanabilir olan bu iş akışı, rekombinant protein verimini ve proses dayanıklılığını artıran optimal besin koşullarının hızlı ve veri odaklı bir şekilde tanımlanmasını sağlayarak erken keşif kararlarını destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Heterolog ekspresyon için gerekli biyolojik gereksinimleri netleştirmek amacıyla, medya bileşenlerinin protein üretimi üzerindeki etkilerinin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Ölçek büyütme öncesinde hedef canlılığını riske atmamak için medya formülasyonlarının hızlı bir şekilde taranmasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Farklı ortam koşullarında protein üretim verimliliği için tekrarlanabilir bir okuma olarak kantitatif GFP titresi verileri üretir.
- Operasyonel Değer: Otomasyon aracılığıyla kültürleme ve tespit iş akışlarını standartlaştırarak analiz tekrarlanabilirliğini ve kapasitesini artırır.
- Stratejik Değer: Bileşik veya suş değerlendirmesindeki değişkenliği azaltarak, sonraki tarama kampanyaları için valide edilmiş ortam koşulları hazırlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Klinik öncesi protein üretiminde kullanılan mikrobiyal konakçıların optimizasyonu için aktarılabilir bir çerçeve oluşturarak geliştirme aşamaları boyunca tutarlılığı destekler.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş protokoller aracılığıyla, optimize edilmiş besiyerlerinin keşif aşamasından klinik öncesi iş akışlarına sorunsuz aktarımını kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, medya optimizasyonunun protein ekspresyon seviyelerini ve sonraki süreçlerin uygulanabilirliğini doğrudan etkilediği, suş mühendisliğinden öncü madde tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Besin maddelerinin protein verimi üzerindeki etkilerine dair hipotezleri test ederek, ekspresyon sistemlerinin mekanistik risklerinin azaltılmasını sağlar.
- Tarama: Yüksek çıktılı tarama platformlarına uygun, standardize edilmiş ve tekrarlanabilir kültürel çıktılar sunar.
- Analitik: Besi ortamı formülasyonlarının kantitatif karşılaştırılmasına olanak tanıyan GFP floresans ve protein konsantrasyon ölçümleri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Daha büyük ölçekli preklinik modellerde tekrarlanabilecek besi ortamı koşullarını tanımlayarak sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla projeye, konakçılara ve protein hedeflerine uygulanabilen modüler ve uyarlanabilir bir protokol sunarak gereksiz geliştirme çabalarını azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Yinelemeli, modelleme rehberli deneyler aracılığıyla medya tasarımındaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Robotik sıvı işleme ve mikrobiyoreaktör entegrasyonu yoluyla standardizasyonu ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Medya bileşimini protein çıktısıyla ilişkilendirerek devam/dur kararlarını iyileştirir ve geç aşama biyolojik risklerini azaltır.
- Portföy Etkisi: Veriye dayalı optimizasyon sonuçlarına göre suşların ve medya koşullarının riskle düzeltilmiş önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Deneysel tasarım, mikrobiyoreaktör işletimi ve robotik sıvı aktarım sistemleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Mikrobiyoreaktör platformlarına (örneğin, Biolector), plak okuyuculara ve süpernatant işleme için santrifüj ekipmanlarına erişime bağlıdır.
- Veri toplama, GFP ölçüm standartları ve istatistiksel analiz protokolleri (örneğin, Z-testi) konusunda ekipler arası uyum gerektirir.
- Protokolün farklı mikrobiyal konakçılara veya protein hedeflerine (örneğin, glikozilasyon, disülfit bağına bağımlı proteinler) aktarılması durumunda adaptasyon değerlendirmelerini kapsar.
- Pratik sınırlamalar arasında, iteratif iş akışında belirtildiği üzere, aykırı değerleri tespit etmek ve veri güvenilirliğini sağlamak için her iterasyon başına referans deneylerin yapılması gerekliliği yer alır.
