Name: Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Öğrenin canlı hücre görüntüleme yöntemiyle TIP60 tükenmesi sonrası meme epitel hücre göçünü gerçek zamanlı izleme tekniğini. Bu yöntem kanser metastazındaki hücre davranışlarını anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jha laboratuvar onların yararlı tartışma ve Yorumlar için üyeleri teşekkür ediyoruz. S.J. kanser Bilim Enstitüsü of Singapore (R-713-006-014-271), Ulusal Sağlık Ulusal Araştırma Vakfı Singapur ve Singapur Milli Eğitim Bakanlığı, araştırma merkezleri mükemmellik girişimi'nin altında hibe tarafından desteklenmiştir Araştırma Konseyi (CBRG-Zen; BNIG11nov001 ve CS-IRG; R-713-000-162-511), Milli Eğitim Bakanlığı akademik Araştırma Fonu (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Ekim -04). Y.Z., G.S.C. ve C.Y.T. kanser Bilim Enstitüsü Singapur tarafından Singapur Ulusal Üniversitesi layık bir yüksek lisans bursu tarafından desteklendi.

1. hazırlık
<ol><li>MCF10A kültür ortamı hazırlamak: Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) / F12 (1:1) % 5 ile ATI serum, 20 ng/mL epitelyal büyüme faktörü, 0,5 mg/mL hidrokortizon, 100 ng/mL kolera toksin ve 10 µg/mL insülin.</li>
	<li>Serum-Alerjik orta hazırlamak: 20 ng/mL epitelyal büyüme faktörü, 0,5 mg/mL hidrokortizon, 100 ng/mL kolera toksin ve 10 µg/mL insülin ile DMEM/F12 (1:1).</li>
	<li>Aşağıdaki siRNA sırasını kullanın: siControl: İleri: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' Ters: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3' siTIP60: İleri: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3' Ters: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'</li>
	<li>10 cm hücre kültür yemekleri ve 24-şey tabak kullanın.</li>
</ol>2. geçici TIP60 kullanarak siRNA tükenmesi
<ol><li>Gün 1, aliquot 15 µL transfection reaktif (Örneğin, Lipofectamine RNAiMAX) ve 2 mL serum orta (Örneğin, Opti-MEM) azaltılmış ve bunları sırasıyla her siRNA (10 µM hisse senedi) 10 µL ile karıştırın.</li>
	<li>Karışımı, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>1 x 106 MCF10A hücreleri ile birlikte kültür orta 10 cm tabak içinde 3 mL tohum. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>SiRNA karışımı damla damla 10 cm yemek için ekleyin.</li>
	<li>37 ° C kuluçka makinesi koymadan önce hücreleri eşit dağıtılır sağlamak için çanak sallamak.</li>
	<li>Kuluçka 6 h sonra siRNA içeren Orta 8 mL taze kültür orta ile değiştirin.</li>
	<li>2 günü siRNA karışımları yönteminin hazırlamak ve onları, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>8 mL 1 gün eklendi kültür ortamının dışarı Aspire edin ve eski yerine koymak o ile 3 mL taze kültür orta.</li>
	<li>SiRNA karışımı ikinci parti yemekleri damla damla ekleyin. Bulaşıkları reaktifleri tam da kuluçka koymadan önce karıştırılır emin olmak için salla.</li>
	<li>6 h sonra siRNA içeren Orta 8 mL taze kültür orta ile değiştirin.</li>
</ol>3. tohum hücreler yara iyileşmesi tahlil için
<ol><li>Günde 3, orta atın ve 2 mL serum fizyolojik (PBS) arabelleği fosfat tamponlu bir kez hücrelerle yıkayın. PBS arabellek atmak.</li>
	<li>SiControl ve siTIP60 tedavi hücreleri plaka 1 mL 1 x tripsin-EDTA arabelleği ekleyerek trypsinize. Kuluçka makinesi 20 dk için geri koydum.</li>
	<li>4 mL tam kültür ortamının her plakasına eklemek, hücreleri pipetting tarafından resuspend ve onları bir 15 mL tüp aktarın.</li>
	<li>5 min için 200 gr, santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
	<li>5 mL serum-Alerjik orta de içeren hücreleri yeniden askıya alma ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Bir hücre süspansiyon olarak 6 x 105 hücre/mL siControl ve siTIP60 için hazırlamak; hücreleri iyi karışık olduğundan emin olun. Hücre süspansiyon 500 µL % 100 confluency emin olmak için bir 24-şey plaka bir şey için ekleyin. 5-6 kuyu her siControl ve siTIP60 için tohum.</li>
	<li>Yavaşça ileri geri plaka ve sonra için bile dağıtım sağlamak için yan sarstı. Dairesel hareketlerle kaçının. Plaka 24 h için kuluçka bırakın.</li>
	<li>TIP60 devirme verimliliğini kontrol etmek için kalan hücreleri hasat. Bunu yapmak için kalan hücre süspansiyon 5 min için 200 gr, santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
	<li>Ticari bir reaktif kullanarak RNA üreticinin protokolüne yalıtmak ve devirme etkinliğini değerlendirmek için gerçek zamanlı kantitatif PCR için devam edin.</li>
</ol>4. yara oluşturma
<ol><li>Faz kontrast mikroskop altında hücreleri tamamen bağlı emin olmak için denetleyin. Hücreleri mikroskop altında gözlemlemek (4 X, 10 X ve 20 X büyütme) hücreleri tamamen hücrelerinin Konfluent monolayer oluşturmuştur bağlı olduğu sağlamak. Not: siControl hücreleri genellikle daha iyi siTIP60 hücreleri ekleyin. TIP60 tükenmesi hücreleri daha fazla gibi Mezenkimal20yapar çünkü bu bekleniyor. Burada, normal benchtop beyaz ışık faz kontrast mikroskop kullanılır.</li>
	<li>Yara oluşturmak için hafifçe merkezi 200 µL pipet ucu ile iyi arasında düz bir çizgi sıfırdan; oluşturulan yara kuyu çapı aynı uzunluğudur. Tüm kalan kuyular için bu adımı yineleyin. Yeni bir pipet ucu her şey için kullanın.</li>
	<li>Yavaşça kullanarak her de 5 kez serum içermeyen yıkama müstakil hücre kaldırma için orta.</li>
	<li>Her şey için 1 mL serum-Alerjik orta ekleyin ve canlı hücre görüntüleme için devam edin.</li>
</ol>5. Kurulum Canlı hücre görüntüleme
<ol><li>Mikroskobunun açmak ve sıcaklık kontrol en az 1 h canlı oda sıcaklığında 37 ° c ulaştığından emin olmak için görüntüleme hücreli ayarlamadan önce</li>
	<li>Canlı hücre görüntüleme başlamadan önce karbondioksit (CO2) gaz arzı açın. CO2 konsantrasyonu %5 için ayarlayın.</li>
	<li>24-şey plaka mikroskop sahnesinde yerini ve görüntüleme için 10 X büyütme ile objektif lens seçin. Kamera yerine göz mercekleri verilmiş ışığına doğrudan ve yara ve çevresindeki hücreleri bulmak için odağı ayarlayın. Not: Bu durum, faz kontrast ile beyaz ışık kullanıldı.</li>
	<li>Her şey yarada konumunu işaretlemek için bir canlı hücre gözlemci sistemi kullanın. Not: Otomatik sahne canlı hücre görüntüleme sisteminin birden çok pozisyonlarda resim alma sağlar. Görüntüleri bir kez her ara her işaretli konumuna alınır.</li>
	<li>Kadar zaman koşul ayarla: 1s aralığına ve 72 h süresi; Bu ayar göre sistem resimler işaretli her konumda her saat 72 h. herhangi bir istenen zaman aralığını ayarlamak için ve izleme dönemi olacak. Not: Bu hücreler 72 h sonra serum serbest ortamda ölmeye başlayacak çünkü burada, bir süre 72 h en iyisi.</li>
</ol>6. tek hücreli hareketleri izleme
<ol><li>72 h. hem JPEG formatında görüntülerin ve AVI formatında videolar olarak verdikten sonra verileri veri verin. Not: ImageJ yazılım sadece AVI formatında videolar tanıyabilir çünkü bu önemlidir. SiTIP60 ve siControl hücreler arasında farklı hücre geçiş hızları videoda açıkça görülebilmektedir.</li>
	<li>AVI video ImageJ yazılımında açın.</li>
	<li>MTrackJ eklentisi (eklenti-gerekir indirilen ve ayrı ayrı yüklü) açın: Eklentiler > MtrackJ.</li>
	<li>Videodan MtrackJ araç çubuğunda "Ekle" sekmesini tıklatarak seçilen tek hücreler için bir parça ekleyin. İnvaziv ön ucunda bir hücre ve kendi kendine geçirebilirsiniz bir hücreyi seçin (tek hücreli geçiş). Seçilen hücreleri hareketini videoda izleyin ve onları iz MtrackJ kullanarak.</li>
	<li>Araç çubuğundaki "ölçü" sekmesine tıklayarak hareketinin uzaklığı ölçmek. Not: Burada, tek hücreleri, birçok siTIP60 hücreleri tek hücre olarak taşındı, ancak zor tek hücreli hareketi, ölçümü yapma siControl neredeyse hiçbir hücrelerde alındı. Ancak, invaziv cephede yer alan hücreleri hareket hala takip ve siControl ve siTIP60 hücreleri hesaplanan.</li>
	<li>AVI formatında parçaları ile video kaydetmek.</li>
</ol>7. cep geçiş yeteneği miktar
<ol><li>Miktar için 0 h, görüntüler ve görüntüleri, "n" h, ya siTIP60 ya da siControl hücreler yara tamamen kapattığından ne zaman nerede "n" için timepoint anlamına gelir seçin. Not: siTIP60 hücreleri yaralarda neredeyse tamamen kapalı olarak burada, 48 h, seçildi.</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak ImageJ kullanarak yüzde geçişi ölçmek: (0 h - alan "n" h, yara yara alan) / alanına yara 0 h x 100.</li>
</ol>

<ol><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li>
<li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li>
<li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Rvb1%2FTip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60%2FNuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li>
<li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+functions+of+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li>
<li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control%3A+many+tricks+in+one+HAT%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li>
<li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li>
<li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+p53+DNA-binding+domain+regulates+apoptosis+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction.</a> Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).</li>
<li>Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60-dependent+acetylation+of+p53+modulates+the+decision+between+cell-cycle+arrest+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis.</a> Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).</li>
<li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration%2C+metastasis%2C+and+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li>
<li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li>
<li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li>
<li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+EDD1%2FUBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+of+metastasis%3A+cell+invasion+and+endothelial+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu hücre geçiş sürecinde, her iki hareket yapisan yaprak şeklinde hücreler olabilir bilinmektedir; gevşek kümeleri; ya da tek, izole hücreler. Modu ve hücre işgalinin dinamik bir şartla diğerine değişebilir ve fenotip saat içinde değiştirebilirsiniz. Geleneksel yara iyileşmesi tahlil anlık görüntü resimleri 12 veya 24 s gibi bir uzun zaman aralığı mikroskopla alınan temel alır. Bu yara kapatma dinamik ve hücre hareketlerin desen yakalamak zorlaştırır.
Öte yandan, live-hücre görüntüleme sisteml...

Histon ve sigara Histon proteinleri1,2acetylate bir lisin asetiltransferaz HIV Tat etkileşimli protein 60 kDa (TIP60) olduğunu. Fonksiyonları transkripsiyon, DNA-hasar onarım ve Apoptozis1,3,4,5,6, de dahil olmak üzere birden çok sinyal yollar, uygulamaları bulunmaktadır bulundu 7 , 8. Ayrıca, TIP60 kez downregulated kanserleri ve onun downregülasyon kanser metastaz ile ilişkilidir ve zavallı hayatta kalma oranları9,10,11,12, 13,14. Tümör metastazı kanserle ilgili ölüm başlıca nedenidir. Çok adımlı bir işlemdir ve geçiş ve tümör hücreleri işgali bitişik dokularda15,16içine metastaz ilk adım içerir. Bunu yapmak için tümör hücreleri ilk birincil tümör kitle, ya topluca işgal bir hücre levha şeklinde gelen ayırmanız gerekir veya müstakil olarak tek hücreleri17. Bu işlem sırasında tümör hücreleri kez Mezenkimal geçiş (EMT), morfoloji ve hücre yapışma yeteneği17,18değişimler sonuçta epitel tabi.
Birkaç teknik geçiş eğitim için geliştirilmiştir ve vitroişgali yetenek tümör hücreleri. Bunlar arasında en verimli ve ekonomik19yara iyileşmesi tahlil olduğunu. İlk olarak, bu yöntem Konfluent monolayer hücre, böylece hücrelerin göç ve boşluğu kapatmak izin üzerinde yapay bir boşluğu oluşturulmasını içerir. İkinci olarak, görüntüleri eksikliklerin başlangıç ve deneme sonunda yakalanabilir. Son olarak, bir karşılaştırma boşluğu kapatma hücre geçiş hızını belirlemek için kullanılır. Faz kontrast mikroskop genellikle geleneksel yara iyileşmesi deneyleri için görüntüleri yakalamak için kullanılır. Başka bir yara iyileşmesi tahlil vivo içinde tümör hücre göç kısmen benzer avantajdır. Benzer şekilde vivo içinde tümör metastazı için yara iyileşmesi deneyleri hücre göç epitel sayfaları toplu göç ve müstakil tek hücre geçiş gösterir.
Ancak, hücre göç dinamik olarak bilinir ve hücre gerçek zamanlı olarak hareket belgelemek için bir ihtiyaç vardır. Örneğin, geleneksel bir yara iyileşmesi tahlil tek hücreli hareket analiz etmek bir araştırmacı izin vermez. Öte yandan, yara iyileşmesi deneyleri için kültürlü hücreleri çoğu kez hücre çoğalması etkisizleştirmek için serum aç. Bu boşluğu kapatma nedeniyle hücre çoğalması olasılığını ekarte için yapılır. Yine de, hala olacak bazı yayılması ve hücre ölümü ve faz kontrast görüntüler önce ve deneme sonra ikisi arasında ayrım yapamaz.
Canlı hücre görüntüleme tekniği konvansiyonel yara iyileşmesi deneyleri bu sınırlama giderir. Canlı görüntüleme mikroskop kullanarak bir CO2 kuluçka ve uygun sıcaklık kontrolü ile birlikte, araştırmacılar boşluk boyutu ölçebilirsiniz ve aktif olarak göç hareketi izleme hücreleri iken zamanla kapatılması hızını kendi bulunan uçları invaziv açık. Bu nedenle, canlı hücre hücre geçiş izlemek için Imaging uygulanması yalnızca hücre göç daha iyi görselleştirme vermez ama aynı zamanda hücre göç ve Hücre proliferasyonu, böylece bir daha sağlayan ayırt imkanı sağlayacak hücre göç güvenilir analizi.
Bu çalışmada, MCF10A meme epitel hücreleri yara iyileşmesi tahlil ve canlı hücre hücre göç TIP60 rolü eğitim için Imaging göstermek için kullanılmıştır. MCF10A hücreleri artan göç yeteneklerine TIP60 tükenmesi sonuçlanır.

<table><tbody><tr><td>MCF10A hücre</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317TM</td><td>Meme epitel hücresi</td></tr><tr><td>DMEM/F12 ortamı (1:1)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>MCF10A kültür ortamı</td></tr><tr><td>Epitel büyüme faktörü (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A kültür ortamı için takviyeler</td></tr><tr><td>Kolera Toksin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8052</td><td>MCF10A kültür ortamı</td></tr> <tr><td>için takviyelerHidrokortizon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0888</td><td>MCF10A kültür ortamı için</td></tr> takviyeler <tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1882</td><td>MCF10A kültür ortamı için takviyeler</td></tr><tr><td>Ev serumu</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>MCF10A kültür ortamı için takviyeler</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>MCF10A için plakadan ayırın</td></tr><tr><td>Hemasitometre</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>Hücre sayımı için</td></tr><tr><td>Opti-MEM azaltılmış serum ortamı</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>siRNA karışımı için</td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>56532</td><td>Transfect reaktif</td></tr><tr><td>Trizol reaktifi</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>mRNA ekstraksiyonu için</td></tr><tr><td>iScript cDNA Sentez Kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td>cDNA için nesil</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5125</td><td>Gerçek zamanlı qPCR</td></tr><tr><td>7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR sistemi</td><td>Biyosistemler</td><td></td><td>Gerçek zamanlı qPCR mechine</td></tr><tr><td>10 cm çanak</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td>Knockdown deneyi için</td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td>Yara iyileşme testi için</td></tr><tr><td>siControl siRNA</td><td>Self tasarlanmış</td><td>Kendi tasarladığı</td><td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td></tr><tr><td>siTIP60 siRNA</td><td>Kendi tasarladığı</td><td>Kendi tasarladığı</td><td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td></tr><tr><td>Canlı hücre gözlemcisi</td><td>Zeiss</td><td>Canlı hücre deneyleri</td><td></td> için Zeiss ters Hücre Gözlemcisi</tr></tbody></table>

meme epitel hücre göç tip60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Yara iyileşmesi tahlil etkilidir ve bir hücre göç içinde vitroçalışma için en ekonomik yolu. Geleneksel, görüntüleri başlangıç ve faz kontrast mikroskop kullanarak bir deney sonunda alınır ve hücreleri geçiş yeteneklerini yaraların kapatılması tarafından değerlendirilir. Ancak, hücre hareketi dinamik bir olgudur ve geleneksel bir yöntem tek hücreli hareketi izlemek için izin vermez. Geçerli yara iyileşmesi deneyleri artırmak için biz canlı hücre görüntüleme teknikleri hücre göç gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanın. Bu yöntem takip sistemi bir hücreyi temel alarak hücre geçiş hızını belirlemek için bize izin verir ve hücre göç ve Hücre proliferasyonu arasında net bir ayrım sağlar. Burada, yara iyileşmesi deneyleri meme epitel hücreleri TIP60 varlığı ile etkiledi farklı geçiş yeteneklerini çalışmaya görüntülemede canlı hücre kullanımını göstermektedir. Hücre hareketliliği son derece dinamik olduğu için bizim yöntem yara yara kapatma yara iyileşmesi deneyleri için kullanılan geleneksel görüntüleme teknikleri ile çekilen fotoğrafını daha iyileşme süreçleri daha fazla ilgili bilgiler sağlar.

Canlı hücre hücre görüntüleme tabanlı geçiş testin genel şeması Şekil 1A bu protokol bir şemadır. MCF10A hücreler tipik epitel Morfoloji gösterdi siControl ile transfected. TIP60 tükenmesi sonra MCF10A hücreleri kontrol hücreleri (şekil 1B) kıyasla daha Mezenkimal.
TIP60 devirme verimliliği incelenmesi Şekil 2...

Burada, hücre göç TIP60 tükenmiş MCF10A meme epitel hücreleri kullanarak bir yara iyileşmesi tahlil gerçek zamanlı izleme mevcut. Canlı hücre görüntüleme teknikleri bizim protokolündeki uygulanması bize analiz ve tek hücreli hareket içinde gerçek zaman ve zaman içinde görmenize olanak sağlar.

Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen belirli genlerin eksiltilmesinin hücre migrasyonu üzerindeki etkilerini gözlemlemektir. Bu yöntem, kanser hücre migrasyonu gibi kanser metastazındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, dinamik hücre migrasyonunun gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanımasıdır.Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, bir tümör baskılayıcı olan TIP60'ın etkileri üzerine hücre morfolojisi değişikliklerini gözlemlerken ortaya çıktı. İşleme, her bir 10 santimetrelik petri kabına üç mililitre kültür ortamı içerisinde bir milyon meme epitel hücresi ekerek başlayın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilmiş SRINA karışımını, deney hücresine damla damla ekleyin.Hücrelerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için her iki kabı da manuel olarak sallayın ve ardından 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Altı saat sonra, süpernatanları kap başına 8 mL taze kültür ortamı ile değiştirin ve kültürleri inkübatöre geri koyun. Ertesi sabah, süpernatanları kap başına 3 mL taze kültür ortamı ile değiştirin ve az önce gösterildiği gibi, deney hücresi kültürüne ikinci bir SIRNA karışımı dozu ekleyin; hücreleri inkübatöre geri koymadan önce rea

live-imaging-breast-epithelial-cell-migration-after-transient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Kanser kök hücre göçü araştırılması için bir bölme oluşturan mikroakışkan cihaz tarif edilmektedir. Bu yeni platform canlı hücresel mikroçevrede oluşturur ve canlı hücre lokomosyon mikroskobik görselleştirme sağlar. Son derece hareketli kanser hücrelerinin potansiyel olarak daha etkin gelecekteki tedaviler neden agresif infiltrasyon moleküler mekanizmaları, çalışma izole edilmiştir.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Burada, anti-kanser terapötiklerine yanıt olarak tek hücreleri uzunlamasına izlemek için uzun süreli hızlandırılmış mikroskopi yöntemini açıklıyoruz.

Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için

Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

Bu yazıda, dosetaksele dirençli meme kanseri hücrelerinde (MCF-7TXT) mikrotübül dinamik kararsızlığını ölçmek için in vivo bir yöntemi tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemde, hedef hücrelerde GFP-tubulin ekspresyonunu tespit etmek için bir dekonvolüsyon mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılır.

Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için

Burada, kantitatif geçiş ve zamanla ve birden fazla tedavi koşullar altında işgal glioblastoma Beyin tümör kök hücrelerin ölçmek için canlı hücre görüntüleme teknikleri açıklar.

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Burada mil oluşumu ve mitotik progresyon dinamiklerini değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Hızlandırılmış görüntüleme uygulamamız, kullanıcının mitozbölünmenin çeşitli aşamalarındaki hücreleri belirlemesini, mitotik defektleri izlemesini ve tanımlamasını ve anti-mitotik ilaçlara maruz kalındığında mil dinamiği ve mitotik hücre kaderini analiz etmesini sağlar.

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Omurgalı beyin dokusunu invaze eden glioblastoma (GBM) hücrelerinde mikrotübül dinamiklerinin canlı görüntülenmesine izin veren bir teknik sunuyoruz. Floresan etiketli GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonunun, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme ile şeffaf bir zebra balığı beynine bağlanması, in situ kanser invazyonu sırasında sitoiskelet dinamiklerinin ölçülmesini sağlar.

Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin canlı hücre görüntüleme yöntemiyle TIP60 tükenmesi sonrası meme epitel hücre göçünü gerçek zamanlı izleme tekniğini. Bu yöntem kanser metastazındaki hücre davranışlarını anlamak için güçlü bir araç sunar.

Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

Daha fazla video keşfet