Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen belirli genlerin tükenmesinin hücre göçü üzerindeki etkilerini gözlemlemektir. Bu yöntem, kanser hücresi göçü gibi kanser metastazındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, dinamik hücre göçünün gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin vermesidir.

Bu yöntem için ilk olarak, bir tümör baskılayıcı olan TIP60 hastası üzerinde hücre morfolojisi değişikliklerini gözlemlediğimizde aklımıza geldi. 10 santimetrelik bir tabak başına üç mililitre kültür ortamına bir milyon meme epitel hücresi ekerek başlayın. Deneysel hücre kültürüne 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmiş SRINA karışımını damla damla ekleyin.

Hücrelerin 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirmeden önce eşit şekilde dağıldığından emin olmak için her iki kabı da manuel olarak sallayın. Altı saat sonra, süpernatantları tabak başına sekiz mililitre taze kültür ortamı ile değiştirin ve kültürleri inkübatöre geri koyun. Ertesi sabah, süpernatanları tabak başına üç mililitre taze kültür ortamı ile değiştirin ve az önce gösterildiği gibi deneysel hücre kültürüne ikinci bir SIRNA karışımı yaması ekleyin, hücreleri inkübatöre geri döndürmeden önce reaktiflerin tamamen karıştığından emin olmak için tabağı sallayın.

Daha sonra süpernatantları altı saat sonra sekiz mililitre taze kültür ortamı ile değiştirin ve kültürleri gece boyunca inkübe edin. Üçüncü günde, hücreleri plaka başına iki mililitre BPS ile bir kez yıkayın ve her iki plakadaki hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca tabak başına bir mililitre tripson EDTA ile ayırın. İnkübasyonun sonunda, plaka başına dört mililitre tam kültür ortamı ile reaksiyonu durdurun.

Hücreleri pipetleme ile yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonlarını ayrı ayrı 15 mililitrelik tüplere aktarın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri tüp başına beş mililitre serumsuz ortamda yeniden süspanse edin. Saydıktan sonra, her iki hücre kültürünü mililitre konsantrasyonda 600.000 hücreye seyreltin ve% 100 birleşmeyi sağlamak için her kültürden 500 mikrolitre hücreyi 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna ekleyin.

Tüm hücreler tohumlandığında, eşit dağılımı sağlamak için plakayı hafifçe ileri geri ve yan yana sallayın ve plakayı 24 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İlgilenilen genin yıkım verimliliğini kontrol etmek için, toplama tüplerinde kalan hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın ve gerçek zamanlı kantitatif PCR değerlendirmesi için üreticinin talimatlarına göre ticari bir reaktif kullanarak RNA'yı peletlerden izole edin. Ertesi sabah, canlı hücre görüntülemeye başlamadan en az bir saat önce, mikroskobu ve sıcaklık kontrolünü açın.

Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve karbondioksit gazı kaynağını% 5'e ayarlayınOda 37 santigrat dereceye ulaştığında, hücrelerin birleştiğini ve kuyuların dibine tam olarak bağlı olduğunu doğrulamak için faz kontrast mikroskobu kullanın. Ardından, her bir kuyucuğun merkezinin tüm uzunluğu boyunca düz bir çizgiyi nazikçe çizmek için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın ve ayrılan hücreleri çıkarmak için tüm kuyucukları serum içermeyen ortamla beş kez nazikçe yıkayın. Son yıkamadan sonra, her kuyucuğa bir mililitre serum içermeyen ortam ekleyin.

Plakayı 10 güç hedefinin altındaki mikroskop sahnesine yerleştirin ve yayılan ışığı kamera yerine göz merceklerine yönlendirin. Her bir yarayı ve etrafındaki hücreleri bulmak için odağı manuel olarak ayarlayın. Ardından yayılan ışığı kameraya geri verin ve yaraların konumunu işaretlemek ve zaman koşullarını ayarlamak için canlı bir hücre gözlem sistemi kullanın.

Uygun deney süresi için hücreleri görüntüleyin, ardından uygun görüntüleme yazılımında ilk avi videosunu açın ve m track j eklentisini açın. Tek hücreler için bir parça eklemek için ekle sekmesine tıklayın ve istilacı cephenin ucunda bir hücre ve kendi kendine göç edebilen bir hücre seçin. Trafiklerini izlemek için mtrackJ'yi kullanarak videoda seçilen hücrelerin hareketini takip edin.

Ardından, hücre hareketinin mesafesini ölçmek ve videoları avi formatında parçalarla kaydetmek için ölçü sekmesine tıklayın. TIP60'ın tükenmesinden sonra, meme epitel hücreleri, kontrol kültürü hücrelerine kıyasla daha mezenkimal olur. Gerçekten de, TIP60 ekspresyonu ve epitel hücre adezyon molekülü ekspresyonu, siTIP60 tedavisinden sonra önemli ölçüde azalır.

Öte yandan, TIP60 tükenmesi üzerine spesifik epitelden mezenkimal geçiş sürücü genlerine ekspresyonu artar. Yara uygulamasından sonra hücre kültürlerinin canlı görüntülenmesi, siTIP60 ile tedavi edilen hücrelerin siControl kültürlerine kıyasla daha hızlı bir hücre göçünü ve TIP60 tükenmesine yanıt olarak gözlenen göç eden hücrelerin yüzdesinde önemli bir artış olduğunu göstermektedir. Ayrıca, siControl hücreleri bir tabaka halinde hareket ederken, siTIP60 kültürleri içinde daha fazla tek hücre hareketi gözlenir.

Bu videoyu izledikten sonra, hücre göçünün dinamik değişikliklerini izlemek için canlı hücre görüntüleme tekniğinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.