Rejenerasyon için gerçek zamanlı hücre Analyzer donatılmış dizilmiş altın Microelectrodes

Bu prosedürün genel amacı, Gerçek Zamanlı Hücre Analizörü veya RTCA için donatılmış ticari elektronik plakaları yeniden oluşturmaktır. Bu yöntem, RTCA'da kullanılan elektronik planların yenilenmesi de dahil olmak üzere, tek kullanımlık altın bazlı çip alanının yenilenmesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, rejenerasyon prosedürünün düşük toksisiteye sahip hafif ve kolayca bulunabilen laboratuvar reaktifleri kullanılarak gerçekleştirilebilmesidir.

Bu yöntem için ilk olarak, altın bazlı çiplere mal olan Gerçek Zamanlı Hücre Analizörü'nü kullanmaya başladığımızda aklımıza geldi. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi hücre kültürü kabında A549 hücrelerinin inkübasyonu ve proliferasyonu ile başlayın. Elektronik plaka L8'in her inkübasyon kuyusuna 150 mikrolitre hücre ortamı ekleyin. Dengeleme için plakayı biyo-güvenlik başlığında 30 dakika bekletin.

30 dakika sonra, elektronik plaka L8'i 37 santigrat derecede CO2 inkübatöründeki Gerçek Zamanlı Hücre Analizörüne manuel olarak yerleştirin. Ardından, bilgisayarda Gerçek Zamanlı Hücre Analizörü işlem programını başlatın. Varsayılan deneme deseni kurulumu sayfasında Deneme Modeli'ni seçin ve çalışan testi adlandırın.

Düzen sayfasında, deneye dahil edilen ilgili kuyucukları seçin ve hücre tipi, sayı ve ilaç adları gibi bilgileri düzenleme kutularına girin. Zamanlama sayfasında, deneysel adımları ekleyin, ardından her adımın çalışma süresini ve gerçek zamanlı veri toplama aralığını seçin. Ortamın arka plan empedansını ölçmek için başlat'a tıklayın.

Deney dosyası kaydedilecektir. Elde edilen veriler otomatik olarak çıkarılacaktır. Arsa sayfasında, kuyucuklar ekleyin ve zaman hücresi indeksinin grafiği gösterilecektir.

Hücre çoğalması deneyi için, programı duraklatmak için önce duraklat düğmesine tıklayın. Daha sonra elektronik plakayı çıkarın ve oda sıcaklığında kuyucuk başına 100 mikrolitre A549 hücre süspansiyon tamponu ekleyin. Hücrelerin inkübasyon kuyularının dibine çökmesini sağlamak için plakayı biyo-güvenlik başlığında 30 dakika bekletin.

Elektronik plakayı gerçek zamanlı hücre analizörü istasyonuna manuel olarak yerleştirin. Ardından, denemeye devam etmek için başlat düğmesine tıklayın. Çizim sayfasında, analizör deney boyunca hücre indeksi değerlerini veya eğrilerini sürekli olarak kaydeder.

Deney tamamlandığında çizim sayfasına girin ve deney dosyasını açın. Ardından, testler arasındaki varyasyonları azaltmak için farmasötik ilaçlar eklemeden veya ortamı değiştirmeden önce test edilen tüm inkübasyon kuyucuklarını ve son kez ortalaması alınabilen veya normalleştirilebilen hücre indeksi eğrilerini seçin. Veri analizi sayfasında EC50 veya IC50 hesaplanabilir.

Metin protokolünde anlatıldığı gibi antikanser ilacının sitotoksisite değerlendirmesini yaptıktan sonra, hücreleri içeren elektronik plakayı Gerçek Zamanlı Hücre Analiz Cihazından çıkarın. Kullanılmış elektronik plakayı oda sıcaklığında steril bir biyo-güvenlik başlığına yerleştirin ve kültür ortamını bir pipet kullanarak iyice karıştırın. Ardından tüm ortamı aspire etmek için bir pipet kullanın.

Elektronik plakaları 200 mikrolitre deiyonize su ile oda sıcaklığında üç kez durulayın. Elektronik plakalarda kalan hücreleri% 0.25 taze hazırlanmış tripsin ile 37 santigrat derecede bir inkübatörde bir ila iki saat boyunca sindirin. Çürütme tamamlandığında, inkübasyon solüsyonunu bir pipet kullanarak beş ila 10 kez karıştırmak için oda sıcaklığında biyo-güvenlik başlığında çalışın ve ardından solüsyonu çıkarın.

Elektronik plakaları 200 mikrolitre deiyonize su ile iki kez durulayın. Daha sonra 200 mikrolitre %100 etanol ile iki kez yıkayın, ardından aynı hacimde %75 etanol ile iki kez yıkayın. Son olarak, 200 mikrolitre deiyonize su ile iki kez durulayın.

Kalan suyu oda sıcaklığında boşaltmak için elektronik plakayı steril bir gazlı bez veya kağıt mendil üzerinde ters çevirin. Ardından, oda sıcaklığında biyo-güvenlik başlığında bir ila iki saat boyunca rejenere elektronik plaka üzerinde ultraviyole sterilizasyon gerçekleştirin. Metin protokolünde tarif edildiği gibi mezogözenekli malzeme kullanarak ilaç verilmesi için plakaları kullandıktan sonra, kalan hücreleri daha önce olduğu gibi tripsin ile sindirin.

Deneylerde pipet sıklıkla kullanıldığından, mikroçiplerin ucunun ve yüzeyinin çizilmemesi için kişi tarafından dikkat edilmelidir. Mikroçipleri 200 mikrolitre deiyonize su ile oda sıcaklığında biyo-güvenlik başlığında bir kez durulayın. Daha sonra mikroçipleri oda sıcaklığında iki kez 200 mikrolitre mutlak etanol ile yükseltin.

Daha sonra, mikroçipleri oda sıcaklığında bir kez 200 mikrolitre% 75 etanol ile durulayın. Her oyuğa 250 mikrolitre% 75 etanol ekleyin ve elektronik plakayı oda sıcaklığında sızdırmazlık filmi ile kapatın. Elektronik plakayı iki dakika boyunca 114 kez G'de döndürdükten sonra plakayı boşaltın.

Kalan sıvıyı oda sıcaklığında boşaltmak için elektronik plakayı steril bir gazlı bez veya kağıt mendil üzerinde ters çevirin. % 75 etanol durulamayı tekrarlayın ve ardından sıkın. Ardından, oda sıcaklığında biyo-güvenlik başlığında bir ila iki saat boyunca rejenere elektronik plaka üzerinde ultraviyole sterilizasyon gerçekleştirin.

Rejenere elektronik plaka yüzeyinin optik özelliklerini, önce metin protokolünde açıklandığı gibi inkübasyonun alt kısmını sökerek değerlendirin. Taze ve rejenere elektronik plakalar üzerinde antikanser ilaç alımından sonra bağlı hücrelerin canlılığını değerlendirmek için, A549 hücreleri tarafından emilen DOX moleküllerinin spontan floresansını izlemek için konfokal bir lazer tarama mikroskobu kullanın. Hücreler tarafından emilen DOX'un kendiliğinden floresansını kaydetmek için, 63 kez yağ hedefi ve uyarma dalga boyu olarak 485 nanometre kullanın.

Daha sonra, önce altın elektrotu ve camsı karbon elektrotu bir parlatma bezi üzerinde bir aydınlatıcı ile ayna benzeri bir yüzeye parlatarak rejenere elektrotların elektrokimyasal davranışlarını değerlendirin. Daha sonra herhangi bir parçacığı gidermek için elektrotları suda sonikleştirin. Ardından, altın elektrodu 0.5 molar sülfürik asit içinde aktive edin.

Bir milimolar potasyum feraksiyanür içeren 10 milimolar potasyum-klorür-elektrolit çözeltisi içinde çıplak altın elektrot ve camsı karbon elektrotun Elektrokimyasal Empedans Spektroskopisi veya EIS verilerini elde edin. Şimdi, GCE'deki altın elektrotun yüzeyine 10 mikrolitre hücre süspansiyonu bırakın. Hücreleri ekledikten sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi, hücrelerle modifiye edilmiş elektrotların EIS verilerini elde etmeden önce, altın elektrodu GCE'de 37 derecelik bir inkübatörde üç saat inkübe edin.

Elektrotları rejenere etmek için, altın elektrodu 0,5 ila iki saat boyunca% 0,25 tripsin içindeki hücrelerle modifiye edilmiş GCE'ye daldırın. Her iki elektrodu da dört kez suyla yumuşak bir şekilde durulayın. Ardından, elektrotları dört kez mutlak etanol ile yumuşak bir şekilde durulayın.

Ardından, altın elektrodu GCE'ye yaklaşık beş dakika boyunca% 75 etanol içine daldırın. Beş dakika sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi, rejenere elektrotların EIS verilerini elde etmeden önce çipi dört kez %75 etanol ile yumuşak bir şekilde durulayın. Dizilimli altın elektronik plakanın rejenerasyon verimliliğini değerlendirmek için, hem taze hem de işlenmiş elektronik plakalar için mikroskobik gözlemler yapıldı.

Mikroçip yüzeyinin optik özelliklerinde sanal bir fark bulunamadı. Doksorubisin moleküllerinin parçalanması, rejenerasyondan önce ve sonra altın mikroçipler üzerindeki hücre durumunu değerlendirmek için kullanılır. Benzer homojenlik ve iyi tanımlanmış hücresel morfoloji, çiplerin yeniden kullanılabilirliğini gösterdi.

Rejenerasyon protokolü, hücre proliferasyonunun gerçek testi için uygulanır. Test edilmiş bir elektronik plakanın çoklu inkübasyon kuyularından elde edilen büyüme eğrileri, ticari çipin başarılı bir şekilde rejenerasyonunu gösteren iyi bir tutarlılık gösterir. Burada gösterilen, rejenere elektronik plaka L8, mezogözenekli silika malzemeler kullanılarak sitotoksisite değerlendirmesi için test edilmiştir.

Mezogözenekli materyallerle muamele edilen numunenin hücre indeksi, kontrol ile karşılaştırıldığında azalmıştır, bu da materyallerin hafif bir sitotoksisitesini gösterir. Antikanser ilacı doksorubisin'in mezogözenekli materyaller tarafından daha fazla kapsüllenmesi ve salınması, A549 hücrelerinin büyüme eğrisinde dramatik bir azalmaya neden oldu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, tip lavabo sindirim süresinin çipten çipe farklılık gösterebileceğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, rejenerasyon etkisinin değerlendirilmesi gibi ek soruları yanıtlamak için konfokal lazer tarama mikroskobu veya hatta spektroskopi, elektrokimyasal empedans spektroskopisi gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.