Rejenerasyon için gerçek zamanlı hücre Analyzer donatılmış dizilmiş altın Microelectrodes

Bu prosedürün genel amacı, Gerçek Zamanlı Hücre Analizörü (RTCA) için donatılmış ticari elektronik plakaları yeniden canlandırmaktır. Bu yöntem, RTCA'da kullanılan elektronik plakaların yenilenmesi dahil olmak üzere, tek kullanımlık altın tabanlı çiplerin rejenerasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, rejenerasyon prosedürünün düşük toksisiteye sahip, hafif ve laboratuvarda kolayca bulunabilen reaktifler kullanılarak gerçekleştirilebilmesidir.

Bu yöntemle ilgili ilk fikri, maliyeti yüksek altın tabanlı çipler kullanan Real-Time Cell Analyzer'ı kullanmaya başladığımızda edindik. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde, hücre kültür kabında A549 hücrelerinin inkübasyonu ve proliferasyonu ile başlayın. Elektronik L8 plakasının her bir inkübasyon kuyucuğuna 150 µL hücre medyumu ekleyin. Plakayı, dengeleme için biyolojik güvenlik kabininde 30 dakika bekletin.

30 dakika sonra, elektronik plaka L8'i 37 °C'deki CO2 inkübatöründe bulunan Real-Time Cell Analyzer'a manuel olarak yerleştirin. Ardından, bilgisayarda Real-Time Cell Analyzer çalışma programını başlatın. Varsayılan deney desen kurulum sayfasında Experiment Model'i seçin ve yürütülen analize isim verin.

Düzen sayfası üzerinden, deneyde yer alan ilgili kuyucukları seçin ve düzenleme kutularına hücre tipi, sayısı ve ilaç isimleri gibi bilgileri girin. Program sayfasında deneysel adımları ekleyin, ardından her bir adımın çalışma süresini ve gerçek zamanlı veri toplama aralığını seçin. Medyanın arka plan empedansını ölçmek için başlat'a tıklayın.

Deney dosyası kaydedilecektir. Elde edilen veriler otomatik olarak çıkarılacaktır. Grafik sayfasında kuyucuklar eklendiğinde, zaman-hücre indeksi grafiği gösterilecektir.

Hücre proliferasyon deneyi için öncelikle programı durdurmak için duraklatma düğmesine tıklayın. Ardından elektronik plakayı çıkarın ve oda sıcaklığında her kuyucuğa 100 microliters A549 hücre süspansiyon tamponu ekleyin. Hücrelerin inkübasyon kuyucuklarının dibine çökmesi için plakayı biyogüvenlik kabininde 30 dakika bekletin.

Elektronik plakayı realtime hücre analiz istasyonuna manuel olarak yerleştirin. Ardından, deneye devam etmek için başlat düğmesine tıklayın. Grafik sayfasında, analizör deney boyunca hücre indeks değerlerini veya eğrilerini sürekli olarak kaydeder.

Deney tamamlandığında, grafik sayfasına girin ve deney dosyasını açın. Ardından, analizler arasındaki varyasyonları azaltmak için farmasötik ilaçlar eklemeden veya besiyerini değiştirmeden önce son kez ortalaması alınabilecek veya normalize edilebilecek tüm test edilen inkübasyon kuyucuklarını ve buna bağlı hücre indeksi eğrilerini seçin. Veri analiz sayfasında EC50 veya IC50 hesaplanabilir.

Metin protokolünde açıklandığı şekilde antikanser ilacın sitotoksisite değerlendirmesi gerçekleştirdikten sonra, hücreleri içeren elektronik plakayı Real-Time Cell Analyzer istasyonundan çıkarın. Kullanılan elektronik plakayı oda sıcaklığında steril bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve bir pipet kullanarak kültür ortamını iyice karıştırın. Ardından, ortamın tamamını aspire etmek için bir pipet kullanın.

Elektronik plakaları, oda sıcaklığında üç kez 200 µL deiyonize su ile durulayın. Elektronik plakalarda kalan hücreleri, 37 °C'deki bir inkübatörde bir ila iki saat boyunca %0,25'lik taze hazırlanmış tripsin ile sindirin. Sindirim işlemi tamamlandığında, inkübasyon solüsyonunu bir pipet kullanarak beş ila 10 kez karıştırmak ve ardından solüsyonu uzaklaştırmak için oda sıcaklığında biyogüvenlik kabininde çalışın.

Elektronik plakaları iki kez 200 µL deiyonize su ile durulayın. Ardından iki kez 200 µL %100 etanol ile, ardından aynı hacimde iki kez %75 etanol ile yıkayın. Son olarak, iki kez 200 µL daha deiyonize su ile durulayın.

Kalan suyu oda sıcaklığında boşaltmak için elektronik plakayı steril bir gazlı bez veya kağıt havlu üzerine ters çevirin. Ardından, rejenerasyon işlemi tamamlanmış elektronik plakayı biyogüvenlik kabininde, oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca ultraviyole sterilizasyona tabi tutun. Plakaları, metin protokolünde açıklandığı şekilde mezogözenekli malzeme kullanarak ilaç iletimi için kullandıktan sonra, kalan hücreleri daha önce yapıldığı gibi tripsin ile sindirin.

Pipet deneylerde sıkça kullanıldığı için, kullanıcı uçların ve mikroçiplerin yüzeyinin çizilmemesine dikkat etmelidir. Biyo-güvenlik kabininde oda sıcaklığında, mikroçipleri bir kez 200 µL deiyonize su ile durulayın. Ardından mikroçipleri oda sıcaklığında iki kez 200 µL absolut etanol ile durulayın.

Ardından, mikroçipler oda sıcaklığında bir kez 200 µL %75 etanol ile durulayın. Her kuyucuğa 250 µL %75 etanol ekleyin ve elektronik plakayı oda sıcaklığında sızdırmazlık filmi ile kapatın. Elektronik plakayı 114 ×g hızında iki dakika boyunca santrifüj ettikten sonra plakayı boşaltın.

Kalan sıvıyı oda sıcaklığında süzmek için elektronik plakayı steril bir gazlı bez veya kağıt havlu üzerine ters çevirin. %75 ethanol ile durulama ve ardından santrifüj işlemlerini tekrarlayın. Daha sonra, rejenerasyon işlemi tamamlanmış elektronik plakayı, biyogüvenlik kabininde oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca ultraviyole sterilizasyona tabi tutun.

Metin protokolünde açıklandığı üzere, öncelikle inkübasyon kuyusunun alt kısmını sökerek rejenere edilmiş elektronik plaka yüzeyinin optik özelliklerini değerlendirin. Taze ve rejenere edilmiş elektronik plakalar üzerinde antikanser ilaç alımı sonrası yapışık hücrelerin canlılığını değerlendirmek için, A549 hücreleri tarafından absorbe edilen DOX moleküllerinin spontan floresansını izlemek amacıyla bir konfokal lazer taramalı mikroskop kullanın. Hücreler tarafından absorbe edilen DOX'un spontan floresansını kaydetmek için 63 kat yağ daldırma objektif ve eksitasyon dalga boyu olarak 485 nanometre kullanın.

Ardından, önce altın elektrodu ve camsı karbon elektrodu bir parlatma bezi üzerinde illuminoslurry ile ayna benzeri bir yüzey elde edilecek şekilde parlatarak rejenere edilmiş elektrotların elektrokimyasal davranışlarını değerlendirin. Daha sonra, partikülleri temizlemek için elektrotları su içinde sonikasyon işlemine tabi tutun. Son olarak, altın elektrodu 0,5-molar sülfürik asit içinde aktive edin.

Çıplak altın elektrodun ve camsı karbon elektrodun, bir milimolar potasyum ferrosiyanür içeren 10-milimolar potasyum klorür elektrolit çözeltisi içindeki Elektrokimyasal Empedans Spektroskopi (EIS) verilerini elde edin. Ardından, GCE içindeki altın elektrodun yüzeyine 10 µL hücre süspansiyonu damlatın. Hücreleri ekledikten sonra, metin protokolünde açıklandığı üzere hücrelerle modifiye edilmiş elektrodların EIS verilerini elde etmeden önce, GCE'deki altın elektrodu 37 °C'lik bir inkübatörde üç saat boyunca inkübe edin.

Elektrotları yeniden oluşturmak için, hücrelerle modifiye edilmiş GCE içindeki altın elektrodu 0,25% tripsin içinde 0,5 ila iki saat boyunca bekletin. Her iki elektrodu su ile dört kez nazikçe durulayın. Ardından, elektrotları absolut etanol ile dört kez nazikçe durulayın.

Ardından, GCE içindeki altın elektrodu yaklaşık beş dakika boyunca %75 etanol içinde bekletin. Beş dakika sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi yeniden oluşturulan elektrotların EIS verilerini elde etmeden önce çipi %75 etanol ile dört kez nazikçe durulayın. Dizili altın elektronik plakanın rejenerasyon verimliliğini değerlendirmek için hem taze hem de işlem görmüş elektronik plakalarda mikroskobik gözlemler yapılmıştır.

Mikroçip yüzeyinin optik özelliklerinde herhangi bir sanal fark bulunmamıştır. Dozorubisin moleküllerinin floresansı, altın mikroçipler üzerindeki hücre durumunu rejenerasyon öncesinde ve sonrasında değerlendirmek için kullanılmıştır. Benzer homojenlik ve belirgin hücresel morfoloji, çiplerin yeniden kullanılabilirliğini kanıtlamıştır.

Rejenerasyon protokolü, hücre proliferasyonunun gerçek testi için uygulanır. Test edilen elektronik bir plakanın birden fazla inkübasyon kuyucuğundan elde edilen büyüme eğrileri iyi bir tutarlılık göstermekte olup, bu durum ticari çipin başarıyla rejenerasyon yapıldığını belirtmektedir. Burada, rejenerasyon işlemi uygulanmış elektronik plaka L8, mezogözenekli silika malzemeler kullanılarak sitotoksisite değerlendirmesi için test edilmiştir.

Mezogözenekli malzemelerle işlem görmüş örneğin hücre indeksi, kontrole kıyasla azalmış olup bu durum malzemelerin hafif bir sitotoksisiteye sahip olduğunu göstermiştir. Mezogözenekli malzemeler tarafından antikanser ilaç doxorubisinin daha ileri düzeyde enkapsülasyonu ve salınımı, A549 hücrelerinin büyüme eğrisinde dramatik bir düşüşe neden olmuştur. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde yürütülürse dört saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedür uygulanırken, tip lavabo sindirim süresinin çipten çipe farklılık gösterebileceğinin hatırlanması önemlidir. Bu prosedürü takiben, rejenerasyon etkisinin değerlendirilmesi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla konfokal lazer tarama mikroskopisi, hatta spektroskopi veya elektrokimyasal empedans spektroskopisi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.